用于检测酵母和霉菌的方法和培养装置的制造方法
【专利说明】用于检测酵母和霉菌的方法和培养装置
[0001] 相关专利申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2013年2月25日提交的美国专利申请序列号13/775,495以及2013 年2月4日提交的美国临时专利申请号61/760, 412的权益，这些专利全文以引用方式并入 本文。
【背景技术】
[0003] 酵母和霉菌是真核微生物。它们在自然环境中，即在土壤、空气、水和植物表面，是 无所不在的。由于它们的异养性质和它们适应宽泛范围的环境条件的能力，在很多情况下 在各种商品（包括食品配料成分、加工食品、饮料）、未充分清洁的食品加工设备、以及食品 贮藏设施中或其上会遇到被视为造成高成本麻烦的这些微生物。此外，一些酵母和霉菌具 有对人类和动物健康的潜在危害。例如，许多霉菌产生霉菌毒素，并且一些酵母和霉菌是人 类和动物感染的原因。
[0004] 食品或其它商品中的酵母或霉菌污染可造成生产商、加工商和消费者的巨大经济 损失。对商品（诸如，食品配料成分、加工食品、以及饮料）中的酵母和/或霉菌污染的快 速和准确测定对于食品行业中高品质食物产品的生产而言是重要的。
[0005] 对食物商品中的酵母和霉菌进行常规测定的当前实践较大依赖于针对半固体琼 脂培养基上的真菌活细胞进行计数的常规培养技术。这些方法虽然已被广泛认可，但是具 有以下多个缺点：这些方法一般是劳动密集型的并且给出低再现性。此外，在传统方法中遇 到的常见问题是某些霉菌的菌丝生长的扩展类型往往超出附近的菌落并且妨碍了对样本 中活细胞的准确计数。
[0006]最重要地，这些方法中的大部分在可获得准确的定量结果前需要在25°C下进行5 天的温育期。这些方法的长温育期可需要先贮藏食物产品若干天，直至最终已知污染性的 酵母和/或霉菌的存在或者已知该污染性的酵母和/或霉菌的浓度。因此，存在对于改进 的测试及相关材料的需要。如果可以简化测试过程，并且在较短的时间段内获得测试结果， 那么这将允许制造商发布产品；从而降低贮藏成本，而不会牺牲产品质量和完整性。
【发明内容】
[0007] 本公开整体涉及用于检测样本中的酵母或霉菌微生物的培养装置和方法。具体地 讲，本公开涉及在干燥的可复水培养装置中对酵母和霉菌微生物进行快速检测，干燥的可 复水培养装置包括以高浓度设置在粘合剂组合物中的多种指示剂。该多种指示剂包括用于 检测烷基酯酶酶活的指示剂、用于检测磷酸酶酶活的指示剂、以及用于检测不同糖苷酶酶 活的三种指示剂。有利的是，该多种指示剂允许对多种缓慢生长的酵母和霉菌微生物进行 检测和计数。甚至更有利的是，具体指示剂连同指示剂的浓度和将指示剂提供至微生物的 装置允许在少于120小时，以及优选地少于72小时的时间内对酵母和霉菌微生物进行检测 和计数。在任一个实施例中，培养装置可包括麦芽提取物。有利的是，麦芽提取物与多种指 示剂协同作用，以提供相较于其它可能的方式对酵母和/或霉菌菌落进行更快速的检测。
[0008] 在一个方面，本公开提供了一种培养装置。该培养装置可包括主体，主体包含自支 承基材，自支承基材具有第一主表面和第二主表面；设置在基材的第一主表面的一部分上 的第一粘合剂组合物；基本上干燥的、冷水可溶的第一水凝胶形成组合物，该第一水凝胶形 成组合物附着到第一粘合剂组合物；以及多种指示剂。该多种指示剂包括：用于检测不同 糖苷酶酶活的三种指示剂、用于检测烷基酯酶酶活的指示剂、以及用于检测磷酸酶酶活的 指示剂，其中多种指示剂中的每一种包含可检测的报告基团。在任一个实施例中，培养装置 还可包括附接到主体构件的覆盖片。
[0009] 在上述实施例中的任一个中，培养装置还可包括附接到主体构件的覆盖片。在任 一个实施例中，覆盖片可包括面向主体构件的第一主表面；其中培养装置还可包括设置在 覆盖片的第一主表面的一部分上的第二粘合剂组合物，以及基本上干燥的、冷水可溶的第 二水凝胶形成组合物，该第二水凝胶形成组合物附着到第二粘合剂组合物。在上述实施例 中的任一个中，用于检测不同糖苷酶酶活的至少三种指示剂可包括：用于检测a -葡糖苷 酶酶活的化合物、用于检测葡糖苷酶酶活的化合物、以及用于检测半乳糖苷酶酶活 的化合物。在上述实施例中的任一个中，所述至少一种营养物质可包括麦芽提取物。在上 述实施例中的任一个中，培养装置还可包括具有孔的水不溶性的隔离物，该隔离物附接到 主体构件或覆盖片，并且整个孔定位在主体构件和覆盖片之间。在上述实施例中的任一个 中，所述多种指示剂中的至少一种可设置在第一粘合剂组合物、第二粘合剂组合物、第一水 凝胶形成组合物、和/或第二水凝胶形成组合物中。在上述实施例中的任一个中，第一水凝 胶形成组合物或第二水凝胶形成组合物可包含用于使酵母或霉菌微生物生长的至少一种 营养物质。
[0010] 在另一方面，本公开提供检测样本中的酵母和霉菌的方法。该方法可包括使样本 和含水液体与培养装置的胶凝剂接触以形成经接种的培养装置，温育该经接种的培养装置 一段时间，然后检测该培养装置中的酵母或霉菌菌落。该培养装置包含自支承基材，自支承 基材具有第一主表面和第二主表面；设置在基材的第一主表面的一部分上的第一粘合剂组 合物；冷水可溶的第一水凝胶形成组合物，该第一水凝胶形成组合物附着到第一粘合剂组 合物；以及多种指示剂。该多种指示剂包括：用于检测不同糖苷酶酶活的三种指示剂、用于 检测烷基酯酶酶活的指示剂、以及用于检测磷酸酶酶活的指示剂，其中多种指示剂中的每 一种包含可检测的报告基团。任选地，培养装置包括覆盖片，该覆盖片包括设置在该覆盖 片上的第二粘合剂组合物，以及附着到该第二粘合剂组合物的冷水可溶的第二水凝胶形成 组合物。第一水凝胶形成组合物或第二水凝胶形成组合物（如果存在）包含胶凝剂，以及 任选地用于使酵母或霉菌微生物生长的至少一种营养物质。多种指示剂中的每一种设置在 第一粘合剂组合物、第二粘合剂组合物、第一水凝胶形成组合物，或第二水凝胶形成组合物 中。在任一个实施例中，方法还可包括：在温育该经接种的培养装置之后，对存在于该经接 种的培养装置中的酵母或霉菌菌落进行计数。在任一个实施例中，检测该培养装置中的酵 母或霉菌菌落可包括检测在该培养装置中是否存在多种指示剂中的至少一种的可检测报 告基团，其中检测到存在可检测的报告基团指示存在酵母或霉菌微生物的菌落。
[0011] 如本文所用，术语"粉末"是指具有适用于本发明的薄膜培养装置的平均直径的一 种或多种胶凝剂或营养物质的颗粒物质，优选地直径为约10-400微米，更优选地直径为约 30-90微米。
[0012] 如本文所用，"复水的培养基"指用含水液体对冷水可溶的粉末进行复水所形成的 溶液或凝胶。
[0013] 如本文所用，术语"冷水可溶的粉末"是指当与含水试验样本混合时在室温水（例 如约18°C至24°C )中形成凝胶的粉末。
[0014] 如本文所用，术语"基本上不可透过微生物和水蒸汽"是指覆盖片防止在薄膜培养 装置的装运、贮藏和使用期间出现下层冷水可溶性粉末的不期望污染和水合，并且防止复 水的培养基脱水，使得该复水的培养基适于在温育期间支持微生物的生长。
[0015] 如本文所用，"选择剂"是指用于抑制一种类型的微生物（例如，细菌）相对于另一 种类型的微生物（例如，酵母或霉菌）的生长，从而有利于在根据本公开的薄膜培养装置上 生长的微生物的生长和/或鉴定的任意元素、化合物、或组合物。
[0016] 如本文所用，术语"酵母"是指子囊菌门（phylum Ascomycota)的典型单细胞真菌， 该真菌通过裂殖和/或出芽生殖来无性繁殖。酵母包括在试验样本中存在或一起共存的一 种或多种菌种。术语"酵母"还指在例如试验样本中存在的酵母阵列。术语"酵母"并非限 于意指任何给定数量的这些菌种，并且并非意指排除尚待发现但是之后可能被鉴定并且包 括在本领域的技术人员给出的该定义中的菌种。
[0017]如本文所用，术语"霉菌"是指一种微型真菌。该术语并非限于意指任何给定数量 的这些菌种，并且并非意指排除尚待发现但是之后可能被鉴定并且包括在本领域的技术人 员给出的该种属中的菌种。
[0018]如本文所用，术语"试验样本"是指从食物产品、人或动物试验对象、医药或化妆品 商品、土壤、水、空气或其它环境源，或者任何其它来源取得的组分或部分，将由该组分或部 分测定酵母和霉菌的浓度。可使用本领域的技术人员已知的技术从来源取得试验样本，所 述技术包括例如倾倒、吸移、擦拭、过滤和接触操作。此外，试验样本可经受本领域中已知的 各种样本制备工艺，所述工艺包括例如共混、拍打式勾楽?（Stomaching)、均化、富集、选择性 富集、或稀释。
[0019]词语"优选的"和"优选地"是指在某些情况下可提供某些有益效果的本发明的实 施例。然而，在相同的情况或其它情况下，其它实施例也可以是优选的。此外，对一个或多 个优选实施例的表述并不暗示其它实施例不是可用的，并且不旨在将其它实施例从本发明 的范围排除。
[0020] 如本文所用，"一种（个）"、"所述（该）"、"至少一种（个）"以及"一种或多种 (一个或多个）"可互换使用。因此，例如，包括" 一种"指示剂的培养装置可解释成意指该 培养装置可包括"一种或多种"指示剂。
[0021] 术语"和/或"意指所列要素的一个或全部，或所列要素中的任意两个或更多个的 组合。
[0022] 另外，本文通过端点表述的数值范围包括该范围内包含的所有数值（如，1至5包 括 1、1. 5、2、2. 75、3、3.80、4、5 等）。
[0023] 本发明的特征和优点应通过考虑优选的实施例的详细描述以及所附权利要求而 进行理解。如下结合本发明的各种例示性实施例来描述本发明的这些和其它特征及优点。
[0024] 本发明的上述
【发明内容】
并不旨在描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方 式。以下附图和【具体实施方式】更具体地举例说明了例示性实施例。通过【具体实施方式】、附 图和权利要求，其它特征、对象和优点将变得显而易见。
【附图说明】
[0025] 图1是本公开的装置的剖视图，其中示出了某些特征结构。
[0026] 图2是根据本公开的培养装置的一个实施例的（局部剖视）顶部透视图。
[0027] 图3是根据本公开的培养装置的另选的实施例的顶部透视图。
[0028] 图4为沿线4-4截取的图2的培养装置的剖视图。
[0029] 图5是图2的培养装置的顶视图，示出了在微孔膜上印刷的网格图案。
【具体实施方式】
[0030] 在详细说明本公开的任何实施例之前，应当理解本发明在其应用时并不受限于下 文描述中提及的或下列附图中所示的部件构造和布置的细节。本发明能够具有其它实施 例，并且能够以各种方式实践或实施。还应当理解，本文所用的措辞和术语的目的在于描 述，而不应当被视作具有限制性。本文中所用的"包括"、"包含"或"具有"以及它们的变型 形式意在涵盖其后所列举的项目及其等同项目以及附加项目。除非另外说明或限定，术语 "连接"和"联接"及其变型形式均按广义使用，涵盖直接和间接这两方面的连接和联接。另 外，"连接"和"联接"不限于物理或机械连接或联接。应理解，其它的实施例也可采用，且可 在不脱离本公开范围的前提下作出结构变化或逻辑变化。此外，术语诸如"前"、"后"、"顶 部"、"底部"等仅用于描述元件彼此的关系，而决不用来描述设备的具体取向，也不用来指 示或暗示设备的必要或需要的取向，或用来规定本文所述发明在使用过程中的操作、安装、 显示或设置方式。
[0031] 酵母和霉菌是无所不在的真核微生物，该真核微生物在对大部分其它单细胞微生 物而言是有害的某些（例如，低水活度，低pH)环境中保持活力。对被分类为食物腐败变质 指示生物体的酵母和霉菌的测试占所有常规实行的指示生物体测试的约14%，这是因为在 很多情况下在各种商品（例如，食品配料成分、加工食品、饮料）、未充分清洁的食品加工设 备、以及食品贮藏设施中及其上会遇到被视为造成高成本麻烦的酵母和霉菌微生物。此外， 一些酵母和霉菌具有作为人和动物感染的致病物的临床相关性。
[0032] 对酵母和霉菌的传统测试通常涉及在琼脂培养基上或在薄膜培养装置中培 养微生物，该薄膜培养装置为诸如3M PETRIFILM酵母和霉菌计数平板（3M PETRIFILM Yeast&Mold Count Plate)(购自明尼苏达州圣保罗的 3M公司（3M Company, St. Paul, MN))〇 用于检测样本中的酵母和霉菌的薄膜培养装置在例如美国专利5, 089, 413中有所描述，该 专利全文以引用方式并入本文。传统测试方法涉及温育