制备酵母菌生物质的方法

专利名称：制备酵母菌生物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备酵母菌生物质的方法或者酵母菌产品，用于这些酵母生长的 底物，酵母菌菌株，以及所述酵母菌菌株在制备酵母生物质中的用途，以及酵母产物例如乙 醇。本发明具有特定的应用，用于通过使用酵母菌制备乙醇，并且本发明在此对这一点进行 了描述。
背景技术：
乙醇是一种日趋重要的用于运输的可再生燃料，并且作为一种工业化学以及 2-碳化学前体而言同样是重要的。乙醇大多数是通过酵母菌经由基于糖类的己糖发酵物 制得的。所述基于糖类的己糖通常从农作物植物中获得，以水解淀粉的形式来自于玉米、小 麦、大麦、高粱、黍、木薯、甘薯、稻米等等，或者来自于甘蔗以及糖甜菜。所述参与发酵的基 于糖类的己糖通常是葡萄糖、果糖、蔗糖以及麦芽糖。依赖葡萄糖、果糖、蔗糖以及麦芽糖，用于制备乙醇以及酵母生物质的农作物植物 中的糖类为人类和动物食物来源的供给带来了压力。因此用以改进乙醇的制造方法以及酵 母生物质的制备存在日益增长的需求。特别是，存在增加效率的需要，通过这种效率，利用 基于植物的材料来进行酵母生物质以及乙醇的制备。

发明内容
本发明人已经发现，可以使用包括含有C5化合物的材料的底物制备酵母菌生物 质以及酵母菌产品进行，其中所述含有C5化合物的材料可以从木质纤维素的水解产物和/ 或木质纤维素的水解产物的发酵中获得。在本发明之前，这样的材料被认为不适合用于进 行酵母菌生物质以及酵母菌产品的制备，这归因于存在能够抑制酵母菌生长的物质，以及 高浓度的C5化合物、许多酵母菌菌株不能利用该C5化合物进行生长。特别是，通过木质纤 维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材料被认为是一种废弃流体，不适合用于酵 母菌的生长。在第一个方面，提供了一种包括含有C5化合物的材料的底物在酵母菌的生长或 者酵母菌产品的制备中的用途，其中所述含有C5化合物的材料是(a)从木质纤维素水解产物中获得的含有C5化合物的材料；(b)通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材料；或(c) (a)以及(b)的混合物。在第二个方面，提供了一种制备酵母菌生物质或者酵母菌产品的方法，包括在能 够引发酵母菌的生长或者所述产品的制备的条件下，利用酵母菌对一种包括含有C5化合 物的材料的底物进行培养，其中所述含有C5化合物的材料是(a)木质纤维素水解产物中获得的含有C5化合物的材料；(b)通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材料；或(c) (a)以及(b)的混合物。
在一种实施方式中，所述含有C5化合物的材料来自于木质纤维素水解产物的发酵。在另外一种实施方式中，所述含有C5化合物的材料来自于木质纤维素水解产物。在另外一种实施方式中，所述含有C5化合物的材料是来自于木质纤维素水解产 物的含有C5化合物的材料与来自于木质纤维素水解产物的发酵的含有C5化合物的材料的 混合物。本文中使用的术语“木质纤维素水解产物”指的是从木质纤维素生成的材料，其中 存在于木质纤维素中的半纤维素已经经历了至少部分程度的水解，从而从所述半纤维素聚 合物中释放出单糖。通常，存在于木质纤维素中的纤维素同样发生了至少部分程度的水解， 从而从所述纤维素聚合物中释放糖。木质纤维素中含有以纤维素以及半纤维素形式存在的丰富的糖源。纤维素是一种 交联的葡萄糖残基的聚合物。半纤维素是一种聚合物，其中通常含有葡萄糖、木糖、甘露糖、 半乳糖和阿拉伯糖以及其他残基。然而，尽管被包含于所述聚合物中，木质纤维素中的糖对 于例如酵母菌这样的产乙醇有机体而言是难以利用的。因此，所述木质纤维素必须在用于 发酵之前被进行处理。使用水解方法对木质纤维素进行处理，该方法可释放存在于所述纤 维素以及半纤维素之中的糖单体从而形成一种木质纤维素的水解产物。对木质纤维素(例 如植物材料)中的纤维素以及半纤维素的处理通常释放出葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖以 及阿拉伯糖。在它们之中，葡萄糖、甘露糖以及半乳糖是己糖而木糖和阿拉伯糖是戊糖。所 述水解产物中释放出的糖残基是可以用于发酵过程之中。除了糖类，所述木质纤维素的水解产物中可含有大量的抑制性化学制剂例如乙 酸、呋喃、酚类以及木质素的分解产物。使用工业产乙醇菌进行的木质纤维素水解产物的发酵导致了对存在于所述水解 产物中的绝大部分的C6糖类的利用。作为结果，经过木质纤维素水解产物的发酵之后剩余 的物质通常富含C5化合物例如木糖，以及例如甘油、乙酸、乙醇的化合物及其他能够完成 所述发酵的化合物。此外，发酵通常导致代谢产物例如甘油、乙酸及乙醇的聚集，以及在所 述发酵操作过程中来自于水解产物的能够存留到底的其他化合物的聚集。这些来自于所述 水解产物的能够存留到底的代谢产物以及化合物可能是酵母菌的生长抑制剂。因此，木质纤维素水解产物的发酵所产生的材料在本发明之前被认为能够形成废 弃的流体，所述流体不适合用于进行酵母菌的生长。这种材料可能存在高度的生物氧和/ 或化学氧需求并且对其的处理带来了重大的挑战。在一种形式中，所述酵母菌能够使用木糖作为一种用于生长的碳源进行生长。通常，所述酵母菌能够使用木糖作为一种碳源在一种底物上进行生长，所述底物 是通过木质纤维素水解产物的发酵获得的。通过使用能够利用木糖以及通常的一种或者多种其他碳化合物的酵母菌菌株，本 发明人已经发现之前被认为是一种废弃产物的产物可以被用来作为一种底物，用于酵母菌 生物质的生长和/或酵母菌产品的制备。所述酵母菌能够在木糖以及在底物中发现的其他 碳化合物上进行生长的能力减少了所述底物对生物氧的需求以及由此对化学氧的需求。本文中使用的术语“酵母菌生物质”是指酵母属(Saccharomyces)的酵母菌细胞。 本文中使用的术语“酵母菌生物质的生产”是指所述酵母菌的生长。
本文中使用的术语“底物”指的是被用来作为培养基使用的材料，用于一种有机体 的生长和/或一种有机体产品的制备。所述底物含有用于所述有机体的碳源，并且可以含 有氮源。本文中使用的所述表达“含有C5化合物的材料”是指含有一种或者多种C5碳化 合物的材料。在一种形式中，所述含有C5化合物的材料是含有木糖的材料。通常，所述含 有C5化合物的材料包括木糖，并且可以含有其他的C5化合物。C5化合物是含有5个碳原 子的化合物。木糖是一种C5化合物。其他的C5化合物的例子包括阿拉伯糖，核糖以及木 糖醇。通常的，所述底物含有大量的C5化合物，包括木糖以及木糖醇、阿拉伯糖和核糖中的 一种或几种。本文中使用的表达“通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材 料”指的是经过木质纤维素水解产物的发酵之后存在的含有C5化合物的材料，或者是其含 有C5化合物的提取物。本文中使用的表达“来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料”指的是 存在于木质纤维素水解产物中的含有C5化合物的材料，或者是其含有C5化合物的提取物。所述底物包括足够量的含有C5化合物的材料，用以支持所述酵母菌的生长。在一种形式中，所述底物包括至少20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，65 %，70 %，75 %， 80 %，85 %，90 %，95 %，99 %或者100 %的通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5 化合物的材料。在一种形式中，所述含有C5化合物的材料是当德(“dimder”)。本文中使用的所 述术语“dimder”指的是经过木质纤维素水解产物的发酵以及随后的乙醇提取之后剩余的 液体。所述“Dimder”存在于所述底物中的量通常是足以为所述酵母的生长提供碳源的量。 例如，所述底物可以包括至少 20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，65 %，70 %，75 %，80 %，85 %， 90%,95%或者99%的“dunder”。在一种形式中，所述底物是“dunder”。在另外一种形式中，所述含有C5化合物的材料是通过木质纤维素水解产物的发 酵获得的液体以及固体。在这一形式中，经过木质纤维素水解产物的发酵以及醇的提取之 后，剩余的材料可以被用来形成所述底物而不需要进一步除去固体物质。在一种形式中，所述底物包括至少20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、 80 %、85 %、90 %、95 %、99 %或者100 %的来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的 材料。在一种形式中，所述含有C5化合物的材料是木质纤维素水解产物。在一种形式中，所述含有C5化合物的材料是木质纤维素水解产物与“dunder”的 混合物。所述木质纤维素水解产物与“dunder”可以以任意的比例混合。“Dunder”与木质 纤维素水解产物的适当比例的例子包括1 1、1 1.25,1 1.5,1 1.75,1 2、1 3、 1 4、1 5、1 6、1 7、1 8、1 9、1 10,1. 25 1,1.5 1,1.75 1、2 1、 3 1、4 1、5 1、6 1、7 1、8 1、9 UlO 1。在一种实施方式中，所述底物是含有C5化合物的材料。本发明中使用的酵母菌是Kurtzman等人(2003)在FEMS Yeast Research4 235-245中定义的酵母属的酵母菌。 在一种实施方式中，所述底物被用来在底物上进行酵母菌的生长。通常，所述酵母菌在所述底物上进行好氧生长。在所述底物包括通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含 有C5化合物的材料的实施方式中，酵母菌在所述底物上的好氧生长，使得那些没有被转化 成乙醇或者从发酵过程中被提取出去的碳源被有效的从所述废弃流体中除去并且转化成 为有用的酵母生物质。这在降低所述底物对于化学氧及生物氧的需求上具有额外的优势。
通过所述木糖以及存在于底物中的其他碳源可以生成大量的酵母菌细胞。所述酵 母菌之后可以被用于其所适合的任何用途。正如在此描述的，所述酵母菌可以被用来进行 木质纤维素水解产物的接种从而进行木质纤维素水解产物的发酵，或者用来进行底物的接 种从而进行进一步的酵母生物质或者酵母产品的制备。酵母菌同样可以被用来作为传统发 酵例如烘焙、酿造、白酒、饮用或者非饮用蒸馏酒等的接种物，或者作为动物饲料原料，或者 用于酵母菌的生产。在一种形式中，所述木质纤维素水解产物是一种经过pH调节的木质纤维素水解 产物。本发明中使用的“经过PH调节的木质纤维素水解产物”是一种木质纤维素水解产 物，其具有能够支持酵母菌的生长和/或酵母菌的发酵的PH值。所述经过pH调节的木质 纤维素水解产物可以包括一种酸水解的木质纤维素水解产物以及一种碱性试剂。在一种形 式中，所述碱性试剂是氨水。在所述底物上生长的酵母菌可以被用来进行木质纤维素水解产物的发酵。因此， 在第三个方面提供了一种制备乙醇的方法，包括下述的步骤(a)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵的条件下，对通过第一方面所述用途 或者第二方面所述方法制备得到的酵母菌以及经过PH调节的木质纤维素水解产物进行培 养，从而生成乙醇以及含有C5化合物的材料；以及(b)分离所述乙醇。第三方面所述方法可以包括下述进一步的步骤(C)在底物上使酵母菌生长，所述底物包括(i)步骤(a)中制得的所述含有C5化合物的材料；(ii)来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；或者(iii)⑴与(ii)的混合物；其中，所述酵母菌能够利用木糖作为一种碳源用于在所述底物上进行的生长。第三方面所述方法可以包括下述进一步的步骤(d)使用在步骤(C)中生长的酵母菌重复进行步骤(a) (C)。在第四个方面提供了一种制备乙醇以及酵母菌的方法，包括下述步骤(a)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵的条件下，对一种经过pH调节的木质 纤维素水解产物以及一种能够利用木糖作为碳源用于在底物上进行生长的酵母菌进行培 养，从而生成乙醇以及含有C5化合物的材料，所述底物是通过木质纤维素水解产物的发酵 而获得的；(b)分离所述乙醇；以及(c)在底物上使酵母菌生长，所述底物包括(i)步骤(a)中制得的所述含有C5化合物的材料；(ii)来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；或者(iii)⑴与(ii)的混合物；
其中，所述酵母菌能够利用木糖作为一种碳源用于在所述底物上进行的生长。第四方面所述方法可以包括下述进一步的步骤(d)使用在步骤(C)中生长的酵母菌重复进行步骤(a) (C)。在第五个方面提供了一种制备乙醇的方法，包括下述的步骤(a)提供一种能够利用木糖作为碳源用于在底物上进行生长的酵母菌以及一种木 质纤维素水解产物，所述底物是通过木质纤维素水解产物的发酵而获得的；(b)对用于进行酵母菌发酵的木质纤维素水解产物进行pH调节，所述ρ H调节包 括添加氨水对所述水解产物的PH进行调节，使其达到一种能够支持酵母菌发酵的pH值；(c)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵的条件下，对所述酵母菌以及经过pH 调节的木质纤维素水解产物进行培养，从而生成乙醇以及含有C5化合物的材料；(d)分离所述乙醇。在第六个方面提供了一种制备乙醇以及酵母菌生物质的方法，包括下述的步骤(a)提供一种能够利用木糖作为碳源用于在底物上进行生长的酵母菌以及一种木 质纤维素水解产物，所述底物是通过木质纤维素水解产物的发酵而获得的；(b)对用于进行酵母菌发酵的木质纤维素水解产物进行pH调节，所述ρ H调节包 括添加氨水对所述水解产物的PH进行调节，使其达到一种能够支持酵母菌发酵的pH值；(c)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵的条件下，对所述酵母菌以及经过pH 调节的木质纤维素水解产物进行培养，从而生成乙醇以及含有C5化合物的材料；(d)分离所述乙醇；以及(e)在底物上使酵母菌生长，所述底物包括(i)步骤(c)中制得的所述含有C5化合物的材料；(ii)来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；或者(iii)⑴与(ii)的混合物；其中，所述酵母菌能够利用木糖作为一种碳源用于在所述底物上进行的生长。第六方面所述方法可以包括下述进一步的步骤(f)使用在步骤(e)中生长的酵母菌重复进行步骤(a) (e)。在第七个方面提供了 一种用于制备酵母菌或者酵母菌产品的底物，所述酵母菌能 够利用木糖作为一种碳源用于在所述底物上进行的生长，其中所述底物包括含有C5化合 物的材料，所述含有C5化合物的材料是(a)来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；(b)通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材料；或者(c) (a)与(b)的混合物。所述酵母菌可以是重组的或者非重组的。在一种特定形式中，所述酵母菌是非重 组的。所述酵母菌 通常是一种酵母属菌株，其在Tl检测中制备出至少10倍的生物量的 增加。在一种形式中，所述酵母菌是一种能够在经过pH调节的木质纤维素水解产物中 进行好氧生长的菌株。在一种形式中，所述酵母菌是一种酿酒酵母菌株。
所述酵母菌通常是原养型的并且因此能够在底物上生长而无需添加那些可以被 用来促进酵母的生长以及发酵的复合营养物质，所述复合营养物质例如为氨基酸、核酸碱 基、酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨或者其他复杂并且昂贵的补充剂。所述酵母菌因此仅 需要向木质纤维素水解产物中添加充足的氮并且具有能够利用工业上经济的底物添加物 进行生长的特征。经济的底物添加物例如可以包括氨水、铵盐、尿素、磷酸铵或者磷酸二铵 或者其他工业上经济的氮源和/或磷源。

在一种特定形式中，所述酵母菌选自由下述菌株所组成的组具有匪I登录号 V08/013411的酿酒酵母菌株或具有匪I V08/013411的定义性质的上述菌株的变体或衍生 物，以及具有NMI登录号V09/005064的酿酒酵母菌株者具有NMI V09/005064的定义性质 的上述菌株的变体或衍生物。菌株V08/013411以及菌株V09/005064能够耐受存在于木质纤维素水解产物以及 底物中的高水平的抑制剂。菌株V08/013411以及菌株V09/005064同样能够使用木糖作为 生长的唯一碳源在所述底物中进行生长。在第八个方面，提供了一种选自由下述菌株所组成的组中的酵母菌具有匪I登 录号V08/013411的菌株或具有匪I登录号V08/013411的定义性质的上述菌株的变体或衍 生物；以及具有NMI登录号V09/005064的菌株或具有NMI登录号V09/005064的定义性质 的上述菌株的变体或衍生物。在第九个方面，提供了一种制备乙醇的方法，包括下述的步骤(a)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵的条件下，对根据第八方面所述酵母 菌以及一种经过PH调节的木质纤维素水解产物进行培养，从而生成乙醇以及含有C5化合 物的材料；(b)分离所述乙醇。第九方面所述方法可以包括下述进一步的步骤(C)使第八方面所述酵母菌在底物上生长，所述底物包括(i)步骤(a)中制得的所述含有C5化合物的材料；(ii)来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；或者(iii)⑴与(ii)的混合物；第九方面所述方法可以包括下述进一步的步骤(d)使用步骤(C)中生长的酵母菌重复进行步骤(a) (C)。在第十个方面，提供了一种制备乙醇以及酵母菌的方法，包括下述步骤(a)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵的条件下，对根据第八方面所述酵母 菌菌株以及一种经过PH调节的木质纤维素水解产物进行培养，从而生成乙醇以及含有C5 化合物的材料；(b)分离所述乙醇；以及(c)使第八方面所述酵母菌在底物上生长，所述底物包括(i)步骤(a)中制得的所述含有C5化合物的材料；(ii)来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；或者(iii)⑴与(ii)的混合物，第十方面所述方法可以进一步的包括下述步骤
( d)使用步骤(c)中生长的酵母菌重复进行步骤(a) (C)。在一种实施方式中，所述底物是所述含有C5化合物的材料。在一种形式中，所述 底物是“dunder”。所述经过PH调节的木质纤维素水解产物通常具有能够支持酵母菌发酵的PH值。在一种实施方式中，所述经过pH调节的木质纤维素水解产物包括一种木质纤维 素水解产物以及一种碱性试剂。在一种形式中，所述碱性试剂是氨水。在使用酵母菌进行所述经过pH调节的木质纤维素水解产物发酵的实施方式中， 所述酵母菌以一种足以允许水解产物进行发酵的密度与所述经过PH调节的木质纤维素水 解产物一同进行培养。所述酵母菌通常以下述密度与所述经过PH调节的木质纤维素水解 产物一同进行培养每毫升水解产物至少大约2X106 ；至少大约2X107 ；至少大约2X108 ； 至少大约2 X IO9个细胞。在所述酵母菌在底物上生长的实施方式中，所述底物以一种足以允许所述酵母菌 进行生长的密度与酵母菌一同进行培养。通常，所述酵母菌以下述密度与所述底物一同进 行培养每毫升水解产物至少大约2X IO6 ；至少大约2X IO7 ；至少大约2X IO8 ；至少大约 2 X IO9个细胞。在所述酵母菌在底物上生长的实施方式中，所述酵母菌通常在所述底物上进行好 氧生长。在第十一个方面，提供了一种对木质纤维素水解产物进行pH调节的方法，通过向 木质纤维素水解产物中添加氨水的方式对所述PH进行调节，使其达到能够支持酵母菌发 酵的PH值。在第十二个方面，提供了一种适于进行酵母菌发酵的经过pH调节的木质纤维素 水解产物，包括木质纤维素水解产物以及氨水。氨水的使用提供了对所述木质纤维素水解产物的pH的调节，调节到一种适合于 支持酵母菌的生长以及发酵的范围。除此之外，氨水为所述酵母菌提供了一种可以利用的 容易获得且便宜的氮源。本发明人已经发现可以使用氨水而不是使用例如氢氧化钙、碳酸钙或者氢氧化钠 的化合物来实现对所述木质纤维素水解产物的PH调节。这可能是有利的，因为，例如，钙盐 能够生成高水平的不溶性灰分例如石膏。在制备经过PH调节的木质纤维素水解产物的过 程中生成的高水平的灰分带来了处理方面的挑战。同样，由于钙盐所具有的在锅炉内生成水垢的能力，高水平的钙盐能够引起下游 加工问题。除此之外，避免使用氢氧化钙、碳酸钙或者氢氧化钠对所述水解产物进行PH调 节能够避免由这些离子生成的相关离子抑制以及渗透胁迫。进一步的，通过在所述水解产 物的PH调节中使用氨水，能够为酵母菌的繁殖和发酵提供氮。由于使用氢氧化钙作为一种pH调节试剂而引发的过度加石灰，已经被广泛的用 在木质纤维素的中和作用中，这是因为它在降低所述水解产物的抑制性特征方面所具有的 效用，因此允许酵母菌在不进行进一步纯化的条件下对所述水解产物进行发酵。与使用钙 制剂用于PH调节目的的情形相比，避免过度加石灰能够提供具有更强抑制性的水解产物。 因此，在一种形式中，对氨水中和的水解产物具有抗性的酵母菌被用于这一过程。这样的酵 母菌的例子是菌株V08/013411以及V09/005064。
本文中描述的酵母菌可以在存在于木质纤维素水解产物中的碳源上生长，从而提 供生物质用于随后的木质纤维素水解产物的发酵，或者用于过量酵母菌的制备，所述酵母 菌用于出 售或者用于传统发酵中例如烘焙、酿造、白酒、饮用以及非饮用蒸馏酒等等，或者 作为添加剂，食品，蛋白补充剂，提取物等等。在第十三个方面，提供了一种制备酵母菌生物质或者酵母菌产品的方法，包括在 能够引发酵母菌生长或者所述产品生成的条件下，利用酵母菌对木质纤维素水解产物进行 培养，其中所述酵母菌能够利用木糖作为一种碳源用于在底物上进行生长，所述底物是通 过木质纤维素水解产物的发酵得到的。在一种实施方式中，所述酵母菌是在第八方面中所述酵母菌。在第十四个方面，提供了一种制备酵母菌生物质或者酵母菌产品的方法，包括在 能够引发酵母菌生长或者所述产品生成的条件下，利用第八方面中所述酵母菌对一种包括 含有C5化合物的材料的底物进行培养，其中所述含有C5化合物的材料是(a)来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；(b)通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材料；或(c) (a)与(b)的混合物。通常，所述木质纤维素水解产物是经过pH调节的。在一种形式中，所述经过pH调 节的水解产物包括木质纤维素水解产物以及氨水。通常，所述酵母菌在所述底物上生长。所述酵母菌通常在所述底物上进行好氧生长。在第十五个方面，提供了一种减少底物的生物氧需求的方法，所述底物包括通过 木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材料，包括在能够引发酵母菌生长的 条件下利用所述底物对酵母菌进行培养。在一种实施方式中，所述酵母菌是在第八方面中所述酵母菌。


将参照附图对本发明的一种实施方式进行描述。附图的细节及其相关说明并不能 被理解为对本发明的前述宽范围的说明所具有的一般性所进行的替代。在所述附图中图1表示的是用于制备乙醇的方法的一种实施方式的示意图，表示出了在所述方 法的各阶段的投入物与产出物；且图2是图1所述乙醇制备方法的框图。
具体实施例方式图1描述了根据本发明的一种实施方式的一种乙醇制备方法(10)的概况。图1描 述了所述方法(10)的主要阶段以及所述方法中的投入物和产出物。所述方法可以被划分 为4个主要阶段，为PH调节阶段(11)，发酵阶段(12)，蒸馏阶段(13)以及生长阶段(14)。在pH调节阶段，对木质纤维素水解产物进行pH调节。木质纤维素水解产物是通过 木质纤维素的水解制得的，从而释放出存在于纤维素以及半纤维素聚合物中的构成木质纤 维素的糖类。木质纤维素水解产物中含有碳化合物例如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，木糖和阿拉伯糖以及能够对酵母菌产生抑制性的化合物例如有机酸，呋喃(例如，糠醛，糠醇和5-羟 甲基糠醛)以及木素酚类化合物。可以就地(on site)制备所述木质纤维素水解产物，或 者从体系外的来源获得。在一种形式中，PH调节包括加入一种碱性试剂对所述水解产物的 PH进行调节，达到一种适合进行酵母菌发酵的pH值。所述碱性试剂可以是氢氧化钙，碳酸 钙，氢氧化钠，氨水，或者它们的组合。在所描述的特定形式中，所述碱性试剂是氨水。因 此，在PH调节阶段主要的投入物是木质纤维素水解产物(15)以及以氨水形式存在的碱性 试剂(16)。除此之外，以例如下述形式存在的C6糖类(17)也可以作为pH调节阶段的投 入物经由纤维素水解释放的C6糖，糖蜜，甘蔗汁，来自于水解淀粉的糖浆，麦芽糊精，粗糖 汁，葡萄糖，半乳糖，蔗糖或者其他的C6化合物，或者它们的组合。pH调节阶段的产出物是 经过PH调节的木质纤维素水解产物(19)。所述经过pH调节的木质纤维素水解产物的pH 通常为2. 5 7。通常所述pH为来自于下述的pH值2. 5 6. 5 ；2. 5 6. O ;2. 5 5. 5 ； 2. 5 5. O ;3. O 5. O ；3. 5 5. O ;4. O 5. 5。

在发酵阶段，在允许水解产物中的C6糖类进行发酵的条件下对酵母菌(18)和经 过PH调节的水解产物(19)进行培养。在发酵阶段C6底物同样可以以例如纤维素聚合 物，淀粉或者糊精的形式来提供。可以在发酵阶段中加入具有纤维素分解活性、淀粉或糊 精水解活性的酶，从而允许同时进行糖化以及生成游离可发酵糖的酵母菌发酵。所述酵母 菌(18)是能够对经过pH调节的木质纤维素水解产物中的至少一种C6糖进行发酵并且能 够在通过木质纤维素水解产物的发酵获得的底物上生长的任意酵母菌。适合用于发酵的酵 母菌菌株是能够发酵C6糖类并且利用木糖作为一种碳源用于生长的酵母菌菌株，并且能 够在抑制剂的存在下进行生长，其中所述抑制剂是在“dimder”中发现的。适合的酵母菌 菌株包括具有在木糖以及乙酸、甘油、乙醇、葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖中的任意一种或 多种上进行好氧生长的能力的酵母菌菌株，所述生长通常是在有抑制剂存在的条件下进行 的，所述抑制剂以在“dimder”中发现的浓度存在。在一种形式中，所述酵母菌是一种或多 种来自于酵母属的酵母菌菌株，其能够利用木糖作为生长的碳源。通常，所述酵母菌是一种 或多种酿酒酵母菌株。所述酿酒酵母菌株可以是，例如，NMI登录号V08/013411或具有匪I V08/013411的定义性质的NMI V08/013411的变体或衍生物，或者NMI登录号V09/005064 或具有匪I V09/005064的定义性质的匪I V09/005064的变体或衍生物。这样的酿酒酵 母菌株具有在可变范围的包括木糖、甘油、乙酸、木糖醇的碳源中进行好氧生长的能力。这 样的菌株同样能够立即启动存在于木质纤维素水解产物中的葡萄糖、果糖或甘露糖的快 速发酵，提供一种充足的接种物水平来进行使用。在一种特定形式中，所述酵母菌是菌株 V09/005064。在所述方法的初始周期中，酵母菌通常通过下述方式来提供使所述酵母菌的储 备培养物在一种通过木质纤维素水解产物的发酵而获得的底物上进行好氧生长，所述底 物通常是“dimder”，或者在经过pH调节的木质纤维素水解产物上进行好氧生长，或者在 “dimder”与经过pH调节的木质纤维素水解产物的混合物上进行好氧生长。为了进行所述 方法的后续循环，在生长阶段中在“dimder”上生长的酵母菌可以被投入到发酵阶段中。酵 母菌在“dimder”上的生长允许进行高水平的酵母菌的制备，所述酵母菌被预处理，从而能 够对存在于木质纤维素水解产物中的抑制剂产生抗性。在“dimder”上生成的酵母菌因此 适于在木质纤维素水解产物中进行有效率的生长和发酵。因此，在通过木质纤维素水解产物的发酵获得的、包括含有C5化合物材料的底物上的所述酵母菌的生长提供了一种预先 适应的接种物，适于进行木质纤维素水解产物的有效发酵，同时还能够降低“dimder”对生 物氧以及化学氧的需求。在发酵阶段过程中，酸作为所述发酵的代谢副产物由所述酵母菌 制得。当需要将所述发酵的木质纤维素水解产物的PH维持在允许酵母菌 持续发酵木质纤 维素水解产物的条件时，碱或者缓冲剂可以因此在发酵阶段被投入。能够被用来维持所述 发酵木质纤维素水解产物PH的适合的碱的例子包括氨水，氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化钙， 或者它们的组合。也可以通过例如柠檬酸或柠檬酸盐的添加来实现PH的缓冲。经过所述发酵阶段，被发酵的水解产物(20)通常以包括下述材料的形式被产出 乙醇，木糖和其他C5化合物，剩余的C6糖类，甘油，乙酸盐，来自于水解产物和来自于酵母 菌代谢的抑制剂以及残余固体。来自于发酵阶段的产出物作为蒸馏阶段(13)的投入物。来 自于发酵阶段的产出物是乙醇(22)，以木质素形式存在的微粒物质(21)，酵母菌，剩余的 纤维素和半纤维素，以及木聚糖，其可以被丢弃或者通过例如燃烧、或经由厌氧消化产物被 用作能源生产。在蒸馏阶段(13)，对来自于发酵阶段的材料进行加热从而蒸馏乙醇(22)。一旦 乙醇蒸发，所述剩余液体是“dimder”(23)。因此，来自于蒸馏阶段的产出物是乙醇(22)， "dunder" (23)和微粒物质(21)。所述“dimder”(23)富含木糖和其他碳化合物，其能够作 为一种碳源用于好氧酵母菌在生长阶段(14)的生长。在生长阶段(14)，酵母菌在“dimder”(23)上进行好氧生长。“dimder”(23)和酵母 菌(18)因此成为所述生长阶段的投入物。所述生长阶段的产出物是酵母菌(18)以及失去 效用的“dimder”。由于“dimder”中的大量木糖和其他碳化合物在所述生长阶段已经耗尽， 失去效用的“dimder”的生物氧和化学氧需求减弱，从而降低了所述失去效用的“dimder” 的处理所产生的环境影响。在所述方法的第一周期中，用于生长阶段的酵母菌是从储备培 养物中提供的。然而，在所述方法的随后的循环中，生长阶段中产出的酵母菌可以被用来作 为生长阶段和发酵阶段的投入物。图2描述了上文中所述乙醇制备方法(10)的主要制备步骤。在第一个步骤(111) 中，提供木质纤维素水解产物(15)。所述木质纤维素水解产物(15)可以由体系外的来源提 供，或者通过就地制备水解产物的方式来提供。可以通过水解木质纤维素生物质的方法制 备木质纤维素的水解产物。所述木质纤维素生物质可以是任何含有半纤维素和/或纤维素 的生物质。通常，所述生物质是植物生物质。木质纤维素生物质的例子包括硬木，软木，玉 米秸秆，甘蔗渣，甘蔗废弃物，草，藻类或者其他植物物质，废纸，再生环保纸，造纸工业的废 弃流体，木材糖浆，城市固体废物以及绿色废物。木质纤维素生物质的水解方法是本领域已知的并且包括例如酸水解，酶水解，氨 纤维/冷冻爆破(AFEX)，氨回收过滤法(ARP)，有机溶剂法等。木质纤维素生物质的酸水解 方法在例如US4612286和US6063204中进行了描述。可以使用例如在所谓自身水解过程 中木质纤维素的固有的酸化作用，酸化试剂例如硫酸，二氧化硫，硝酸，盐酸，磷酸，乙酸等 的添加，产生酸化作用。AFEX方法在例如US4600590中进行了描述。ARP方法在例如Kim 等人(2003)在Bioresource Technology 90 :39_47中进行了描述。酶水解方法在例如 US3642580中进行了描述。有机溶剂法在例如US4409032中进行了描述。在有机溶剂法中 使用的溶剂例如可以包括乙醇和丙酮等。
木质纤维素水解产物的pH值通常为大约1，这不适合进行酵母菌例如酿酒酵母的 发酵。因此，在第二个步骤(112)中，在发酵之前对所述木质纤维素水解产物进行pH调节。 pH调节步骤包括一种碱性试剂例如氨水的添加(16)。氨水以一种来自于32%的浓缩氨水 溶液的形式添加。添加氨水直至达到通常大约为5. 0 5. 5的pH。或者，所述碱性试剂可 以为例如氢氧化钙，碳酸钙或者氢氧化钠。除了调节pH，C6糖类可以以水解纤维素、糖蜜、 甘蔗汁、水解淀粉糖浆、麦芽糊精的形式被添加到所述经过PH调节的水解产物(17)中，用 以协助发酵。通过添加例如尿素，磷酸氢铵和/或磷酸氢二铵同样可以提供额外的氮以及 磷。除此之外，可以在这个阶段添加酶以帮助纤维素或半纤维素聚合物的进一步降解。适 合的酶包括纤维素酶，纤维二糖酶，木聚糖酶，葡糖苷酶等。用于降解纤维素或半纤维素聚 合物的可购买获得的酶包括，例如Spirizyme Fuel, Cellulclast和Novozym 188(购自 NovozymesAustralia Pty Ltd)。 在第三个步骤(113)中，提供一种酵母菌的初始接种物，通常以酵母属菌株匪I V08/013411或者NMI V09/005064的形式提供。所述酵母菌被用来在第四个步骤(115)中 对所述经过PH调节的水解产物进行接种。在一种形式中，在分批发酵器中将所述酵母菌接 种至所述水解产物中，达到每毫升水解产物大约2X IO6 2X IO9个细胞的密度。所述方法 的随后循环中可以使用在“dimder”上生长的酵母菌对所述经过pH调节的木质纤维素水解 产物进行接种。在一种形式中，每毫升水解产物大约2X IO7 2X IO9个细胞的高密度酵母 菌的使用能够对水解产物进行脱毒。利用高密度酵母菌对水解产物的接种解除了对于使用 过度加石灰或其他处理的脱毒步骤的需要。在第五个步骤(116)中，通过酵母菌(18)对经过pH调节的木质纤维素水解产物 进行发酵。在分批发酵器中，在30°C下对所述酵母菌以及水解产物进行通常大约1 4天 的培养，更通常大约2 3天，从而允许水解产物的发酵作用的进行。所述木质纤维素水解 产物的发酵导致了对所述经过PH调节的水解产物中的C6糖类的利用以及乙醇的生成。上述发酵得到的材料在第六个步骤(118)中进行蒸馏从而提取乙醇(22)。蒸馏通 常是通过对上述发酵得到的材料进行加热从而蒸发乙醇的方式实现的。经过浓缩后对上述 蒸发的乙醇进行收集。经过乙醇的蒸馏之后，将剩余物质分成“ dunder ”和固体，并且将“ dunder ”作 为一种用于酵母菌生长的底物用于第七个步骤(119)中，所述酵母菌例如是酵母属菌株 V08/013411或者V09/005064。因此，利用酵母菌对上述蒸馏得到的“dunder”(23)进行接种 并且通过在25 42°C下对所述酵母菌和“dunder”进行搅拌使所述酵母菌进行好氧生长， 所述温度通常为30-37°C，更通常为35 37°C (120)。之后通过例如离心或者过滤将所述 酵母菌从“dunder”中分离出来(121)。通过在dunder”上的生长而获得的酵母菌(122)之 后被用来作为后续发酵中新鲜的PH调节的水解产物的接种物。除此之外，在“dunder”上生 长的酵母菌(18)被用来对从水解产物的发酵中获得的“dunder”进行接种，从而生长更多 的酵母菌。因此，在所述方法的每一个循环中，通过在“dunder”上的生长而制得酵母菌，并 且上述得到的酵母菌可以被用于下一循环的发酵以及用作为下一循环而准备的“dunder” 的接种物。所述方法因此制备了大量的酵母菌生物质以及乙醇。图1和2中的虚线描述的是另外一种实施方式，其中所述底物(23)是“dunder” 和木质纤维素水解产物的混合物。在这一点上，保留一部分来自于所述PH调节阶段的经过PH调节的木质纤维素水解产物(24)，用以在生长阶段与“dimder” (23)进行混合。经过乙 醇的蒸馏之后，从蒸馏中得到的“dimder”(23)与所述木质纤维素水解产物(24)进行混合， 并且所述混合物被用作一种用于酵母菌生长的底物，其中使用上文中所述生长条件。或者， 所述木质纤维素水解产物(24)可以在生长阶段(14)被添加到酵母菌/ “dimder”混合物 中。所述木质纤维素水解产物与“dimder”可以以任意比例混合。“dimder”与木质纤维素 水解产物的适合比例的例子包括1 1、1 1. 25,1 1. 5,1 1. 75,1 2、1 3、1 4、 1 5、1 6、1 7、1 8、1 9、1 10,1. 25 1,1. 5 1,1. 75 1、2 1、3 1、4 1、 5 1、6 1、7 1、8 1、9 UlO 1。向“dunder”中添加木质纤维素水解产物提供 了用于酵母菌生长的额外的含有C5化合物的材料，因此当需要制备比单独在“dunder”上 能够制备的更多生物质时是有用的。上述制备的酵母菌生物质可以被用来在发酵阶段对所 述经过PH调节的木质纤维素水解产物进行接种，或者用于酵母菌适宜的任何其他目的。本发明还涉及一种酵母属的分离菌株，其选自匪I登录号V08/013411或具有匪I 登录号V08/013411的定义性质的变体或衍生物，或者选自匪I登录号V09/005064或具有 V09/005064的定义性质的变体或衍生物。本发明人拥有按照布达佩斯条约在国家计量研究院(the NationalMeasurement Institute)分离并且保藏的保藏登录号为V08/013411和V09/005064的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)菌株。保藏登录号 V08/013411 和 V09/005064 具有下述一般 性质(a)利用木糖作为唯一碳源的能力；(b)在存在有在“dunder”中发现的抑制剂的条件下进行生长的能力；(c)形成孢子并且与酿酒酵母进行交配的能力。保藏登录号V08/013411和V09/005064具有下述定义性质i.在Tl检测中发生至少10倍的生物质的增加；ii.形成孢子，并且当将发芽的孢子与一种酿酒酵母测试菌株的发芽孢子进行交 配时能够生成后代；iii.在通过木质纤维素水解产物的发酵制备得到的“dunder”上进行生长。一种适合的酿酒酵母测试菌株的例子是W303-1A。W303-1A能够从美国标准培养 物保藏中心(ATCC，USA)的酵母菌遗传储存中心方便地获得。形成孢子、发芽以及与酵母菌 进行交配的方法将在下文中进行描述。酵母属菌株V08/013411和V09/005064能够将木糖作为唯一碳源在其上进行生 长。而且，菌株V08/013411和V09/005064能够在“dunder”中存在的抑制剂条件下生长。 因此，菌株V08/013411和V09/005064易于在“dunder”上生长。另外菌株V08/013411和 V09/005064能够在存在木质纤维素水解产物的条件下发酵C6糖类。 在一种实施方式中，所述酵母菌是匪I登录号V08/013411或者匪I登录号 V09/005064。在另外一种实施方式中，所述酵母属菌株是匪IV08/013411的变体，或者 V09/005064的变体。NMI V08/013411或V09/005064可以通过将来自于这些菌株的二倍体 或者单倍体细胞暴露在诱变剂中的方式来制备。所述诱变剂可以是适合对所述酵母菌细胞 基因组进行诱变的任意诱变剂。典型的诱变剂包括紫外光，烷基化试剂，致电离辐射。烷基 化试剂的例子包括N-乙基-N-亚硝基脲、环磷酰胺、N-亚硝基-N-甲基脲、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍、硫酸二甲酯、甲磺酸乙酯。致电离辐射的例子包括Y-辐射、X-射线辐射、 β-辐射、α-辐射。用于制备酵母菌变体的方法，并且特别是酿酒酵母变体，是本领域已知 的并且在例如 Lawrence C. W. (1991)Methods inEnzymology，194 :273_281 中进行了描述。在另外一种实施方式中，所述酵母属菌株是匪I登录号V08/013411的衍生物，或 者NMI登录号V09/005064的衍生物。NMI登录号V08/013411或V09/005064的衍生物可以 是一种重组衍生物或者非重组衍生物。

匪I V08/013411的非重组衍生物可以通过下述方式制备将匪IV08/013411的基 因组与一种期望的酵母属菌株的基因组进行结合从而生成一种包括匪I V08/013411的性 质的酵母属菌株。匪I登录号V09/005064的非重组衍生物可以通过下述方式制备将匪I V09/005064的基因组与一种期望的酵母属菌株的基因组进行结合从而生成一种包括匪I V09/005064的性质的酵母属菌株。通常，所述衍生物进一步包括一种或者多种上述期望的 酵母属菌株的性质。将两个酵母属菌株的基因组进行结合的方法是本领域已知的并且包括 例如交配或者原生质体融合。酵母属菌株的交配方法通常包括使需要进行交配的所述酵母菌菌株形成孢子，从 而生成孢子。所述孢子进行发芽从而形成单倍体酵母菌，所述单倍体酵母菌之后进行交 配从而生成后代。此后可以对所述后代进行筛选，选择从每个母本菌株中遗传下来的期 望特征。酵母属菌株的交配方法是本领域已知的并且在例如Ausubel，F.M. et al (1997), Current Protocols in MolecularBiology,Volume 2,pages 13. 2. 1 tol3.2. 5,published by John ffiley&Sons Inc.中进行了描述。通过举例，酵母菌菌株的孢子形成可以例如按 M Ausubel, F. M. et al (1997), Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pages 13. 2. ltol3. 2. 5,published by John Wiley & Sons Inc.中的描述来执行。随后， 可以通过将其放置在一种固体培养基上并且通常在30°C下进行三至五天培养的方式使所 述酵母菌的孢子进行发芽，所述固体培养基例如是含有w/v D-葡萄糖、0. 5%酵母提取 物、细菌蛋白胨和1.5%w/v琼脂的GYP。单独发芽的孢子通常形成离散的菌落，可 以使用标准的微生物学技术在例如一种GYP琼脂培养基上通过平板划线法以纯化形式对 所述菌落进行分离。之后可以对上述纯化的发芽后孢子进行检测从而确定它们是否具有交 配型“a”或者“α ”。可以通过将酿酒酵母发芽后的孢子与具有已知交配型的实验室测试 菌株进行混合的方式对交配型进行确定。实验室测试酿酒酵母菌株的例子包括DE6. ID以 及 W303-1A，在例如 Attfield P. V. et al. (1994) "Concomitantappearance of intrinsic thermotolerance and storage of trehalose in Saccharomycescerevisiae during early respiratory phase of batch-culture is CIF 1-dependent",Microbiology,140 2625-2632中进行了描述。当在有所述实验室菌株DE6. 1D(具有已知的交配型“ α ”)存在 的条件下进行培养时，交配型“a”的发芽后孢子通常产生絮凝，即形成一种肉眼可见的粒状 细胞悬浮，并且在有所述实验室菌株W303-1A (具有已知的交配型“a” )存在的条件下进行 培养时，交配型“α ”的发芽后孢子通常产生絮凝。与一种交配型测试菌株表现出絮凝的发 芽后的孢子不能够与另一种测试菌株表现出絮凝。由一个酿酒酵母菌株生成的交配型“ α，， 的发芽后孢子之后可以与交配型“a”的发芽后孢子进行交配，所述交配型“a”的发芽后孢 子来自于另外一个菌株，或者来自于同一个菌株。原生质体融合通常涉及到来自于酵母菌细胞的细胞壁的去除，通常使用裂解酶，并且随后在存在融合剂的条件下对所述菌株进行混合从而允许在原生质体之间的融合发 生，所述融合剂例如是聚乙二醇，二甲基亚砜和Ca2+。之后通常将所述融合细胞培养于渗透 压稳定的培养基中从而允许所述细胞的细胞壁的再生。酵母属菌株的原生质体融合的方法 是本领域已知的并且在例如US4973560中进行了描述。

NMI V08/013411的重组衍生物是一种通过使用重组DNA技术向NMIV08/013411 中导入一种核酸的方式生成的菌株。NMI V09/005064的重组衍生物是一种通过使用重组 DNA技术向NMI V09/005064中导入一种核酸的方式生成的菌株。将核酸导入酵母菌细胞特 别是酵母属细胞中的方法是本领域已知的并且在例如Ausubel，F.M. et al. (1997) Current Protocols in MolecularBiology, Volume 2, pages 13.7.1 to 13. 7. 7, published by John ffiley&Sons Inc.中进行了描述。上述提及的酵母属菌株可以被用来通过适合发酵生产乙醇的任何底物进行乙醇 的制备。通过酵母菌的好氧培养在木质纤维素水解产物上或者在通过水解产物的发酵和 蒸馏获得的底物上生成的酵母菌可以被用于木质纤维素水解产物的发酵之外的目的，例 如饲料酵母，食物酵母，用于其他发酵产品例如啤酒、白酒、饮用酒、非饮用乙醇、添加酵母 的焙烤产品的酵母，酵母自溶物、酵母提取物和各种酵母副产品例如酶、维生素、核苷等的 来源。Tl检测使用木糖作为唯一碳源的生长使用标准的微生物学技术在利用2%琼脂进行固化的葡萄糖酵母提取物细菌蛋白 胨培养基上进行酵母菌菌株的划线。在30°C下经过72小时的培养之后，使用无菌微生物环 将酵母菌细胞从平板上取走并且将其在50毫升肉汤中培养至达到0. 1 0.2个单位(！；下 的0D_)的0D_ (600纳米处的光学密度)。0. 1个单位的0D_等同于大约9 X IO5个酵母细 胞/毫升。在250毫升的锥形瓶中，所述肉汤中含有木糖(5% w/v)，无氨基酸的Difco酵 母氮源基础(0. 67% )，柠檬酸(0. 3% )以及柠檬酸三钠(0. 7% )的蒸馏水溶液。柠檬酸 和柠檬酸三钠是作为缓冲剂来提供的，并不能够被用来作为酵母属的生长底物。纯度99% 的D-(+)-木糖是从Sigma-Aldrich处获得的(目录号X1500-500G)。在测量OD6tltl (T48小时 处的0D)之前，在30°C下对培养液进行48小时的培养并伴随220rpm(轨道直径IOcm)的振 荡。通过下述等式确定生物质的增加倍数
T48倾时的OD6ot T0HtWOD600本发明将通过仅参照下述非限制性实施例的方式来进行详细描述。实施例实施例1.酵母属菌株NMI V08/013411和酵母属菌株NMI V09/005064使用木糖 作为一碳源在具有最少矿物质的培养基中的生长按照布达佩斯条约，于2008年5月23日将酿酒酵母菌株V08/013411保藏 T H It if fi ff Ρλ (the National Measurement Institute)， Clarke 大 51-65 号 (51-65Clarke Street)，南墨尔本(South Melbourne)，维多利亚州(Victoria)，3205，澳大利亚(Australia)，登录号为 V08/013411。按照布达佩斯条约，于2009年2月18日将酿酒酵母菌株V09/005064保藏于国 itiffiff^^ (the National Measurement Institute), Bertie 1/153 (l/153Bertie Street),墨尔本港(Port Melbourne),维多利亚州(Victoria)，3207，澳大利亚 (Australia)，登录号为 V09/005064。

使用标准的微生物学操作从大量的“Ethanol Red”无水酒精酵母中分离出酵母菌 菌株ER，上述菌株是用于工业化淀粉制备乙醇的酵母菌的代表，所述“Ethanol Red”无水 酒精酵母可以从 Ferment is, BP 3029-137rue Gabriel Peri, F-59703Marcq-en-Baroeul Cedex France处商业购买获得(批号470/2，生产日期10/2006)。使酵母菌菌株生长并且根据Tl检测对其进行检测。在0. 147的光学密度下对菌 株ER进行培养并且在48小时内增加到0. 223的光学密度(1. 6倍的增加)。在0. 158的 光学密度下对菌株匪I ￥08/013411进行培养并且在48小时内增加到3.5的光学密度(22 倍的增加)。在0. 15的光学密度下对菌株V09/005064进行培养并且在48小时内增加到 12. 20的光学密度(80倍的增加)。实施例2.木质纤维素水解产物的制备在90 120°C下将经过洗涤的木质纤维素生物质干燥至水分< 5%并且使用锤式 粉碎机将其缩小至< 1. 5mm从而制成干燥的粉碎的生物质。为了制备一种25% w/w的固体/水的浆液，以每克干生物质55. 2毫克硫酸的水平 向上述干燥的粉碎的生物质中混合硫酸。将上述酸化的固体/水的浆液转移至高温高压塑料桶中，覆盖铝箔并且放置在一 个100L的压力容器内。将所述压力容器的温度保持在130°C，在23psi/160kPa下保持90 分钟。之后使所述容器的压力下降从而允许在3分钟内达到大气压力。将上述得到的水解浆液送至手工螺旋压榨机内并且脱水。被压榨的浆液的水分含 量为60 65%。水解产物是来自于所述水解浆液中的液体。所述热液体(所述“水解产物”)具有0. 8 1. 5的pH，并且被进行连续搅拌。为 了使所述酵母菌在这样的介质中生长，通过添加2 3% ν/ν的32%的氨水溶液将所述液 体的PH调节至pH > 5且< 7(25 30°C )从而达到一种有利的pH。氨水的使用提供了 氮，作为酵母菌生长和发酵的营养物质，同时将培养基的pH调节到一个适合酵母菌发酵的 范围内。利用氨水进行pH的中和之后，通过使用20cm半径的水平转子在4000rpm下进行 20分钟的离心而对所述水解产物进行澄清。所述澄清液体可以被预备用于酵母菌的生长和 发酵。通过HPLC对水解产物进行分析，其中使用到Bio-Rad Laboratories Inc.的装有 Carbon-P Guard柱(碳-磷保护柱)(目录号125-0119)的AminexHPX-87磷柱(目录号 125-0098)。流动相是流速为每分钟0. 6mL的HPLC级水并且柱温为85°C。下面的表给出了 使用所述方法实现的所述水解产物的组成的例子表1 水解产物的化学组成
权利要求
1.一种包括含有C5化合物材料的底物在用于酵母菌的生长或者酵母菌产品的制备中 的用途，其特征在于，所述含有C5化合物的材料是(a)从木质纤维素水解产物中获得的含有C5化合物的材料；(b)通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材料；或(c)(a)与(b)的混合物。
2.根据权利要求1所述用途，其特征在于所述含有C5化合物的材料是从木质纤维素 水解产物中获得的。
3.根据权利要求1所述用途，其特征在于所述含有C5化合物的材料是通过木质纤维 素水解产物的发酵获得的。
4.根据权利要求1所述用途，其特征在于所述含有C5化合物的材料是从木质纤维素 水解产物中获得的含有C5化合物的材料与通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5 化合物的材料的混合物。
5.根据权利要求1 4中任一所述用途，其特征在于所述酵母菌是一种能利用木糖 作为碳源，在由木质纤维素水解产物的发酵获得的底物上生长的酵母菌。
6.根据权利要求1 5中任一所述用途，其特征在于所述含有C5化合物的材料是含 有木糖的材料。
7.根据权利要求1 6中任一所述用途，其特征在于所述含有C5化合物的材料是当 德(“dunder”)。
8.根据权利要求1 8中任一所述用途，其特征在于所述含有C5化合物的材料是木 质纤维素水解产物。
9.根据权利要求1 8中任一所述用途，其特征在于所述底物是所述含有C5化合物 的材料。
10.根据权利要求1 9中任一所述用途，其特征在于所述酵母菌在所述底物上进行好氧生长。
11.根据权利要求1 10中任一所述用途，其特征在于所述酵母菌是非重组的。
12.根据权利要求1 11中任一所述用途，其特征在于所述酵母菌选自具有匪I登 录号V08/013411的菌株，或者具有匪I登录号V08/013411的定义性质的上述菌株的变体 或衍生物；以及具有NMI登录号V09/005064的菌株，或者具有NMI登录号V09/005064的定 义性质的上述菌株的变体或衍生物。
13.—种生产酵母菌生物质或者酵母菌产品的方法，所述方法包括在引发酵母菌生长 或者所述产品制备的条件下利用酵母菌对包括含有C5化合物材料的底物进行培养，其中 所述含有C5化合物的材料是(a)木质纤维素水解产物中获得的含有C5化合物的材料；(b)通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材料；或(c)(a)与(b)的混合物；
14.根据权利要求13所述方法，其特征在于所述含有C5化合物的材料是从木质纤维 素水解产物中获得的。
15.根据权利要求13所述方法，其特征在于所述含有C5化合物的材料是通过木质纤 维素水解产物的发酵获得的。
16.根据权利要求13所述方法，其特征在于所述含有C5化合物的材料是从木质纤维 素水解产物中获得的和通过木质纤维素水解产物的发酵获得的。
17.根据权利要求13 16中任一所述方法，其特征在于所述酵母菌能利用木糖作为 碳源进行生长，所述碳源来自木质纤维素水解产物的发酵中获得的含有C5化合物的材料。
18.根据权利要求13 17中任一所述方法，其特征在于所述含有C5化合物的材料 是含有木糖的材料。
19.根据权利要求13 17中任一所述方法，其特征在于所述含有C5化合物的材料 是 “dunder”。
20.根据权利要求13 19中任一所述方法，其特征在于所述含有C5化合物的材料 是木质纤维素水解产物。
21.根据权利要求13 20中任一所述方法，其特征在于所述底物是含有C5化合物 的材料。
22.根据权利要求13 21中任一所述方法，其特征在于所述含有C5化合物的材料 是含有木糖的材料。
23.根据权利要求13 22中任一所述方法，其特征在于所述酵母菌在所述底物上进 行好氧生长。
24.一种制备乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵从而制备乙醇和含有C5化合物的材料的 条件下，对酵母菌以及一种经过PH调节的木质纤维素水解产物进行培养，所述酵母菌是通 过权利要求1 12中任一所述用途制备得到的，或者通过权利要求13 23中任一所述方 法制备得到的；及(b)分离所述乙醇。
25.根据权利要求M所述方法，其特征在于，进一步包括(c)使酵母菌在底物上生长，所述底物包括(i)在步骤(a)中制备得到的含有C5化合物的材料；( )来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；或者(iii)⑴与( )的混合物；其中，所述酵母菌能够利用木糖作为在所述底物上生长的碳源。
26.根据权利要求25所述方法，其特征在于，进一步包括(d)使用在步骤(c)中生长的酵母菌重复进行步骤(a) (C)。
27.根据权利要求M 沈中任一所述方法，其特征在于所述底物是所述含有C5化 合物的材料。
28.一种制备乙醇以及酵母菌生物质的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵从而制备乙醇和含有C5化合物的材料的 条件下，对一种经过PH调节的木质纤维素水解产物以及一种能够利用木糖作为在底物上 生长的碳源的酵母菌进行培养，所述底物是通过木质纤维素水解产物的发酵获得的；(b)分离所述乙醇；以及(c)使酵母菌在包括下述的底物上生长(i)在步骤(a)中制备得到的含有C5化合物的材料；(ii)来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；或者(iii)⑴与( )的混合物；其中，所述酵母菌能够利用木糖作为在所述底物上生长的碳源。
29.根据权利要求观所述方法，其特征在于，进一步包括(d)使用在步骤(c)中生长的酵母菌重复进行步骤(a) (C)。
30.根据权利要求M 四中任一所述方法，其特征在于所述经过PH调节的木质纤 维素水解产物具有能够支持所述酵母菌发酵的PH。
31.根据权利要求30所述方法，其特征在于所述经过pH调节的木质纤维素水解产物 包括木质纤维素水解产物以及碱性试剂。
32.根据权利要求31所述方法，其特征在于所述碱性试剂是氨水。
33.根据权利要求M 32中任一所述方法，其特征在于将所述酵母菌以每毫升水解 产物至少大约2X 10e5个酵母菌的密度在所述经过pH调节的木质纤维素水解产物上培养。
34.根据权利要求M 33中任一所述方法，其特征在于所述酵母菌在所述底物上进 行好氧生长。
35.一种制备乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括下述的步骤(a)提供能够利用木糖作为在底物上生长的碳源的酵母菌以及木质纤维素水解产物， 所述底物是通过木质纤维素水解产物的发酵获得的；(b)为进行酵母菌的发酵，对所述木质纤维素水解产物进行PH调节，所述pH调节包括 通过添加氨水将所述水解产物的PH调节到能够支持酵母菌发酵的pH ；(c)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵从而制备乙醇和含有C5化合物的材料的 条件下，对所述酵母菌以及所述经过PH调节的木质纤维素水解产物进行培养；(d)分离所述乙醇。
36.一种制备乙醇以及酵母菌的方法，其特征在于，所述方法包括(a)提供能够利用木糖作为在底物上生长的碳源的酵母菌以及木质纤维素水解产物， 所述底物是通过木质纤维素水解产物的发酵获得的；(b)为进行酵母菌的发酵，对所述木质纤维素水解产物进行PH调节，所述pH调节包括 通过添加氨水将所述水解产物的PH调节到能够支持酵母菌发酵的pH ；(c)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵从而制备乙醇和含有C5化合物的材料的 条件下，对所述酵母菌以及所述经过PH调节的木质纤维素水解产物进行培养；(d)分离所述乙醇；以及(e)使酵母菌在底物上生长，所述底物包括(i)在步骤(c)中得到的含有C5化合物的材料；( )来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；或者(iii)⑴与( )的混合物；其中所述酵母菌能够利用木糖作为在所述底物上生长的碳源。
37.根据权利要求36所述方法，其特征在于，进一步包括(f)使用在步骤(e)中生长的酵母菌重复进行步骤(a) (e)。
38.根据权利要求13 37中任一所述方法，其特征在于所述酵母菌是一种酿酒酵母 菌株。
39.根据权利要求13 38中任一所述方法，其特征在于所述酵母菌是非重组的。
40.根据权利要求13 39中任一所述方法，其特征在于所述酵母菌选自匪I登录号 V08/013411或具有V08/013411的定义性质的上述菌株的变体或衍生物；或者选自匪I登 录号V09/005064或具有V09/005064的定义性质的上述菌株的变体或衍生物。
41.一种酵母菌，其特征在于，所述酵母菌选自具有匪I登录号V08/013411的菌株或 具有匪I登录号V08/013411的定义性质的上述菌株的变体或衍生物；以及具有匪I登录号 V09/005064的菌株或具有NMI登录号V09/005064的定义性质的上述菌株的变体或衍生物。
42.一种制备乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵从而制备乙醇和含有C5化合物的材料的 条件下，对权利要求41所述酵母菌以及一种经过pH调节的木质纤维素水解产物进行培养； 以及(b)分离所述乙醇。
43.根据权利要求42所述方法，其特征在于，进一步包括(c)使权利要求41所述酵母菌在底物上生长，所述底物包括 (i)在步骤(a)中制备得到的含有C5化合物的材料；( )来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；或者 (iii)⑴与( )的混合物。
44.根据权利要求43所述方法，其特征在于，进一步包括(d)使用在步骤(c)中生长的酵母菌重复进行步骤(a) (b)。
45.一种制备乙醇以及酵母菌的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在能够引发木质纤维素水解产物的发酵从而制备乙醇和含有C5化合物的材料的 条件下，对权利要求41所述酵母菌以及一种经过pH调节的木质纤维素水解产物进行培 养；(b)分离所述乙醇；以及(c)使权利要求41所述酵母菌在底物上生长，所述底物包括 (i)在步骤(b)中制备得到的含有C5化合物的材料；( )来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；或者 (iii)⑴与( )的混合物。
46.根据权利要求45的方法，其特征在于，进一步包括(d)使用在步骤(c)中生长的酵母菌重复进行步骤(a) (C)。
47.根据权利要求45所述方法，其特征在于所述经过pH调节的木质纤维素水解产物 具有能够支持所述酵母菌发酵的PH。
48.根据权利要求47所述方法，其特征在于所述经过pH调节的木质纤维素水解产物 包括木质纤维素水解产物以及碱性试剂。
49.根据权利要求48所述方法，其特征在于所述碱性试剂是氨水。
50.根据权利要求35 49中任一所述方法，其特征在于将所述酵母菌以每毫升水解 产物至少大约2 X 10e5个酵母菌的密度在所述经过pH调节的木质纤维素水解产物上培养。
51.根据权利要求35 50中任一所述方法，其特征在于所述酵母菌在所述底物上进 行好氧生长。
52.根据权利要求观 51中任一所述方法，其特征在于所述底物是所述含有C5化 合物的材料。
53.根据权利要求观 51中任一所述方法，其特征在于所述含有C5化合物的材料 是 “dunder”。
54.一种对木质纤维素水解产物进行pH调节的方法，其特征在于所述方法通过向木 质纤维素水解产物中添加氨水对所述PH进行调节，使其达到能够支持酵母菌发酵的pH。
55.一种适合进行酵母菌发酵的经过pH调节的木质纤维素水解产物，其特征在于所 述产物包括木质纤维素水解产物以及氨水。
56.一种制备酵母菌生物质或者酵母菌产品的方法，其特征在于，所述方法包括在能够 引发酵母菌生长或者所述产品制备的条件下，利用权利要求41所述酵母菌对一种包括含 有C5化合物材料的底物进行培养，其中所述含有C5化合物的材料是(a)来自于木质纤维素水解产物的含有C5化合物的材料；(b)通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材料；或(c)(a)与(b)的混合物。
57.根据权利要求56所述方法，其特征在于所述含有C5化合物的材料是“dimder”， 木质纤维素水解产物或者是“dunder”与木质纤维素水解产物的混合物。
58.根据权利要求57所述方法，其特征在于所述木质纤维素水解产物是经过pH调节的。
59.根据权利要求58所述方法，其特征在于所述经过pH调节的水解产物是权利要求 50中所述经过pH调节的水解产物。
60.根据权利要求56 59中任一所述方法，其特征在于所述酵母菌在所述底物上生长。
61.根据权利要求60所述方法，其特征在于所述酵母菌在所述底物上进行好氧生长。
全文摘要
本发明涉及一种包括含有C5化合物材料的底物在用于酵母菌的生长或者酵母菌产品的制备中的用途，其中所述含有C5化合物的材料是(a)从木质纤维素水解产物中获得的含有C5化合物的材料；(b)通过木质纤维素水解产物的发酵获得的含有C5化合物的材料；或者(c)(a)与(b)的混合物。本发明还涉及到使用所述底物制备酵母菌生物质或者酵母菌产品的方法，以及制备乙醇的方法，所述方法包括对通过上述用途或者方法制备得到的酵母菌进行培养。本发明进一步的涉及到适合用于所述用途或者方法中的酵母菌菌株。
文档编号C12P7/08GK102076860SQ200980124211
公开日2011年5月25日 申请日期2009年4月28日 优先权日2008年6月27日
发明者保尔·维克托·阿特菲尔德, 菲利普·约翰·利文斯敦·贝尔, 阿瑟·科拉尔斯 申请人:麦克拜奥根Pty有限公司