专利名称：酿酒酵母金属硫蛋白产生菌的选育发酵与提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过自然选育及诱变选育手段，从酿酒酵母中分离出对Cu2+、Cd2+等重金属拮抗、又产生金属硫蛋白的菌株；还涉及MT产生菌分级诱导、发酵调控及酵母菌MT分离、纯化和生物活性检测等技术。
国内、外研究现状分析金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)是一类广泛存在于生物中的低分子量，富含半胱氨酸、能被金属诱导的金属结合蛋白。生理功能广泛，主要参与微量元素贮存、运输和代谢；拮抗电离辐射；清除羟基自由基及重金属解毒等多种作用，涉及机体生长、发育、生殖、衰老、免疫、肿瘤发生、应激反应等各个方面。其研究与应用在医药、保健食品和化妆品添加剂、农业、环境保护、生物工程等各领域已取得一些令人兴奋的成果。1978年7月，1985年8月，1992年12月就召开过三届关于研究金属硫蛋白的国际会议。目前，MT的研究，已成为生物化学及分子生物学领域的热门课题之一。
自1957年Margoshes，M.和Vallee，B.L.等报道从蓄积镉的马肾脏中分离出MT以来，现已能从几乎所有哺乳动物组织(结缔组织除外)、某些两栖类、鱼类、植物和某些真核、原核微生物中分离得到。1975年Prinz，R.和Weser，U.等报道在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中发现MT是真核微生物中有关MT的第一篇文章，迄今为止，在微生物MT近200篇文章中，1975-1985年10年时间里，只占13篇，自1985年来研究报道增多，多数文章为MT基因结构、基因调控、MT基因启动于等理论文章，酵母菌MT应用开发研究限于专利保护，报道极少，只有2篇。
从<CA>67年至92年7月检索出有关酵母菌Metallothionein专利1.Ger.Offen DE 3,433,076(A1)(C1.C07k15/22)20 Mar.1986Appl.08 Sep.1984；16pp.题目Isolation and use of antirheumatic copper metallothioneinsCu-MT的分离和抗风湿病中的应用作者Weser，Ulrich；Hartmann，Hans Juergen；Gaertner，Alfred2.Ger.Offen DE 3,920，826(A1)(C1. C07k15/04)03，Jan.1991Appl.24 Jan.1989；3pp.题目Preparation of metallothionein as inflammation inhibitors炎症抑制剂MT的制备作者Weser，Ulrich；Hartmann，Hans Juergen；Miesel，Ralf真核微生物中金属诱导产生的MT主要特征低分子量(2,000-10,000道尔顿)；高金属含量(含4-13个金属原子/每分子MT)；氨基酸组成中半胱氨酸含量丰富(占6.8-43％)；没有芳香族氨基酸或含量极微；具有金属通过硫酯键与蛋白质结合的种种特殊吸收光谱行为；具有MT中典型的Cys-Xaa-Cys多肽序列(Cys表示半胱氨酸残基，Xaa代表任一非特殊氨基酸残基)。与哺乳动物中MT相比，其主要差别是酵母菌MT中酸性氨基酸含量高(为哺乳动物2-3倍)；Cys含量不同；有His(组氨酸)、Arg(精氨酸)等碱性氨基酸；另外酵母菌MT一般只被Cu2+、Ag2+诱导，不被其它金属诱导。
根据国外文献报道，56个属酵母菌中，只发现酵母属、裂殖酵母属、假丝酵母属等3个属中7-8个种酵母菌有MT，国内尚未见有关酵母菌MT的报道。
本发明的目的本发明所选育出的酿酒酵母BD101的金属硫蛋白，与哺乳动物金属硫蛋白基本相似；经实验进一步证实含MT酿酒酵母菌具有抗紫外线、60Co辐射、消除羟基自由基和重金属解毒能力，与哺乳动物金属硫蛋白生理功能相同；可适用于药物、机能性食品或化妆品添加剂的应用开发；也可应用于贵重金属回收、有毒重金属废水污染处理。酵母菌生长迅速、繁殖快、原料价廉、培养简便，其金属硫蛋白提取易于掌握，酵母菌金属硫蛋白研制，在医药、食品、化妆品添加剂、贵重金属回收和重金属污染治理等应用方面，将展现诱人的前景，这是本发明的主要目的。
基因工程中异源哺乳动物基因在酵母菌中表达率都不高，一般只占细胞总蛋白1％，酵母菌金属硫蛋白基因启动子表达系统是酵母菌中发现的最好表达系统之一，业已证实它能在不同属的大多数细胞中行使其正常功能，几乎使所有异源蛋白质表达水平提高5-20倍，使基因表达产物产量达到每升数毫克水平。为分离出酵母菌金属硫蛋白启动子，能最大限度地提高异源目的基因产物产量，这也是本发明的目的之一。
发明的内容及方法本发明的内容包括(一)MT产生菌选育；(二)MT产生菌分级诱导及发酵调控；(三)酵母菌MT的分离纯化。
(一)MT产生菌选育1.菌株特点(1)BD101菌株(液体Cu2+抗性5mmol/L)(2)BD101-69菌株(液体Cu2+抗性15mmol/L)(3)BD101-30菌株(液体Cu2+抗性25mmol/L)2.选育方法(1)自然选育通过常规的梯度平板法和菌悬液混合培养法，选出液体CuSO4终浓度5mmol/LCu2+抗性酿酒酵母菌株BD101，经Cu2+诱导证实该菌产生Cu-MI。(2)亚硝基胍(NTG)诱变采用常规法对经诱导产生Cu-MT的菌株BD101抗性(5mmol/L)稳定的纯种，以亚硝基胍处理(NTG终浓度100-1,000微克/毫升，处理时间1-2小时)，筛选高Cu2+抗性突变株，其中BD101-69突变株混合培养法进一步证实，液体抗Cu2+终浓度达15mmol/L，经Cu2+诱导证实该菌产生Cu-MT。(3)紫外线(UV)诱变以紫外线处理BD101-69突变株细胞(紫外线灯15W、灯距30cm、照射时间0.5-5分钟)，筛选高Cu2+抗性突变株，其中BD101-30突变株经菌悬液混合培养法进一步证实液体抗Cu2+终浓度达25mmol/L，经Cu2+诱导证实该菌产生Cu-MT。
(二)MT产生菌分级诱导及发酵调控1.分级诱导及发酵调控参数为(1)酿酒酵母BD101菌株金属硫蛋白诱导条件诱导金属盐CuSO4或CuCl2盐浓度5mmol/L诱导方式分级诱导(2)产金属硫蛋白发酵调控参数
2.方法(1)一级种子菌株(YPD斜面)活化——→克氏瓶(YPD平板)扩大——→制成菌悬液直接接入种子罐或摇瓶进一步扩大培养。(2)二级种子种子罐空消——→装入YPD培养基实消——→保压降温至30℃——→接入一级种子(1％)——→再通入无菌空气培养——→二级种子菌悬液。(3)发酵发酵罐空消——→装入YPD培养液(适当浓度Cu2+盐)实消——→保压降温至30℃——→接入二级种子(1％)——→30℃通入无菌空气培养——→待MT积累高峰期放罐。(4).上述各罐灭菌采取高压蒸汽灭菌，即121℃、0.3-0.5kg F/cm2。灭菌30分钟，发酵调控参数见上款所述。
YPD培养基配方<
>(三)酵母菌MT分离纯化1.主要技术特点无细胞提取液、凝胶过滤、亲和层析纯化MT2.酿酒酵母BD101 Cu-MT理化特性(1)只被金属诱导的金属结合蛋白；(2)低分子量约7,000道尔顿，表观分子量14,000道尔顿；(3)氨基酸组成每个Cu-MT分子含59个氨基酸，其中Cys占10％；酸性氨基酸含量高，芳香族氨基酸含量≤1％；(4)高金属含量每克分子Cu-MT含4克原子Cu；(5)具有金属通过硫酯键与蛋白质结合的特殊吸收光谱Cu-MTA270nm处有吸收肩，脱辅基MTA270nm处吸收肩消失；(6)根据MT所带电荷不同(取决于MT一级结构氨基酸序列)，可分为Cu-MT1和Cu-MT2两个亚型。
3.方法(1)无细胞提取液制备离心收集酵母细胞——→洗涤三次——→超声波或高压匀浆器破壁——→离心弃沉淀——→80℃加热5分钟——→离心——→上清液浓缩即为MT粗提取液(用Ag饱和血红蛋白法测定MT中Cu含量，按公式计算Cu-MT)。(2)凝胶过滤制备MT制剂取上述适当浓缩后的提取液——→葡聚糖凝胶过滤层析分离——→用Tris·HCl缓冲液平衡、洗脱，用核酸、蛋白检测仪和原子吸收光谱仪检测，收集A270nm＞A280nm、富含Cu吸收峰蛋白组分，即为酵母菌MT制剂。(3)纯化MT
将上述含Cu-MT制剂的组分——→亲和层析——→再干燥获Cu-MT纯品。
酿酒酵母BD101菌株Cu-MT的优点和效果(一)本发明工艺酿酒酵母菌MT产量与哺乳动物MT产量相近。目前人们获得哺乳动物MT，一般从兔肝中提取，用Zn诱导兔肝得到MT1-2mg/g湿肝，酿酒酵母BD101菌Cu-MT产量达1mg左右/g湿重酵母细胞。酵母细胞生长快、繁殖速、培养简便、原料价廉，已建立一套完整的发酵技术，为MT的开发应用提供了新资源。
(二)据文献报道，推测酵母菌Cu-MT具哺乳动物MT相同的生物学功能。本发明所选育出的含Cu-MT酿酒酵母BD101菌株及其MT确具哺乳动物MT相同的生物学活性。实验证明1.对紫外线辐射效应三株MT产生菌随Cu2+抗性增加(Cu-MT增加)，对紫外线辐射损伤致死率的下降率增加，表明在一定范围内有拮抗紫外线辐射效应。2.对60Co辐射效应三株MT产生菌随Cu2+抗性增加(Cu-MT增加)对60Co辐射损伤致死率的下降率增加，表明在一定范围内有拮抗60Co辐射效应。3.消除羟基自由基能力三株MT产生菌及其MT随Cu2+抗性增加(Cu-MT增加)，消除羟基自由基能力增强，表明有较高的消除羟基自由基能力。4.重金属解毒功能通过不同浓度Cu2+培养MT产生菌实验，表明MT产生菌在各自的生理及限范围内，对重金属毒害具有解毒作用。
(三)自古以来人们就知道用酵母菌发酵制成的各种食品、饮料和药物，本发明所选育的酿酒酵母菌种，为无毒菌株，生产过程没有污染，不影响生态环境。
综上所述，我们所选育出的酿酒酵母BD101所产生的Cu-MT，从Cys含量，氨基酸组成及金属结合量看，与国外文献报道有所差异，是否新发现的MT蛋白，尚待一级结构测序后进一步证实。本发明从诱变育种、分级诱导、亲和层析、生物活性等四方面工作显示出鲜明的创新特色。酵母菌MT拮抗60Co辐射效应、消除羟基自由基能力，国外尚未见报道；酵母菌MT生物学活性研究，为MT在医药、食品和化妆品添加剂中开发应用提供了基础。
本发明发酵、提取工艺最佳实施例按前述方法所述条件，斜面菌株——→克氏瓶扩大培养——→种子罐扩大培养(YPD培养液)30℃，通气培养12-16小时——→以1％接种量转接发酵罐(YPD培养液，CuSO4为诱导剂，终浓度3-5mmol/L)，30℃，通气培养18-24小时，通风量V/V为1∶1.0-1.2，搅拌速度5-15转/秒，离心收集酵母细胞，用蒸馏水洗涤3次，悬浮在蒸馏水中，然后放超声波发生器(功率8-16W，时间10-15分钟)或高压匀浆器(500-1000磅水压匀浆10-15分钟)中，使细胞破壁、匀浆化，离心除去细胞残渣，上清液经分子筛过滤(葡聚糖凝胶，分子量5000-30000道尔顿)，收集A270nm＞A280nm，含Cu-MT组分，经过亲和层析，收集A270nm＞A280nm含Cu-MT组分，再通过分子筛过滤(葡聚糖凝胶分子量5000-30000道尔顿)或透析去盐，干燥，得Cu-MT纯品，得率为4mg Cu-MT/g干酵母细胞，铜含量为≥30μg/mg蛋白。
权利要求
1.一种酿酒酵母金属硫蛋白产生菌的选育、发酵与提取工艺，其特征在于所述方法包括诱变育种，分级诱导，分离纯化和生物学效应。
2.根据权利要求1所述诱变育种其特征在于通过梯度平板法和混合培养法从野生型菌株选育出液体CuSO4终浓度为5mmol/L Cu2+抗性菌株，然后从野生型菌株为出发菌株，进行亚硝基胍(NTG)和紫外线(UV)诱变，NTG诱变条件为100-1000微克/毫升，处理1-2小时；UV诱变条件为15W/20-40cm灯距、照射0.5-5分钟，在不同浓度的YPD平板上筛选出高Cu2+抗性突变株。
3.根据权利要求1所述分级诱导其特征在于诱导及发酵调控条件，用CuSO4或CuCl2，(浓度5mmol/L)的溶液分级诱导；调控参数为培养液YPD(葡萄糖2-6％，酵母提取物0.5-2％，胰蛋白胨0.5-2％，CuSO4或CuCl2浓度5mmol/L)，pH值5.0-7.0，温度30±2℃，接种量1-10％，通风比1∶1.0(vvm)-1∶1.2(vvm)，搅拌速度5-15转/秒。
4.根据权利要求1所述分离纯化其特征在于用超声波发生器破碎细胞(功率为8-16W，时间10-15分钟)或高压匀浆器破碎细胞(500-1000磅水压，时间10-15分钟)，差速离心法除去细胞残渣，亲和层析或凝胶过滤层析，收集A270nm＞A280nm含Cu金属硫蛋白组分，纯化的金属硫蛋白浓缩液经干燥纯品，冰箱保存。
5.根据权利要求1所述分级诱导其特征在于(1)MT产生菌酿酒酵母BD101对重金属Cu2+的解毒作用(0-10mmol/L)；(2)MT产生菌酿酒酵母BD101拮抗紫外线辐射效应(15W，30cm灯距，1-2分钟内)；(3)MT产生菌酿酒酵母BD101拮抗60Co辐射效应(2000-20000Rad/s)；(4)酿酒酵母BD101及其MT消除羟基自由基能力(ΔA550nm为0.2-1.2/mg蛋白)。
全文摘要
自酿酒酵母中选育出拮抗重金属、并产生金属硫蛋白的菌株BD101。该菌在添加Cu
文档编号C12N15/01GK1138098SQ9610089
公开日1996年12月18日 申请日期1996年2月6日 优先权日1996年2月6日
发明者林稚兰 申请人:北京大学