一种烟草疫霉菌分子检测引物及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草疫霉菌分子检测引物及其检测方法，专用于烟草疫霉菌特异分子检测。主要设计了一对烟草疫霉菌的特异引物（上游引物YhF:5'-GACATGATATCAACTGTTCTGCAG-3'和下游引物YhR:5'-CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG-3'），经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在烟草疫霉菌纯DNA、带菌的发病组织特异性地扩增出片段长度为342bp的扩增产物。本发明可被用于生产实践中烟草疫霉菌感染的植物组织中烟草疫霉菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为烟草疫霉菌引起病害的防治提供可靠的技术和理论依据。
【专利说明】一种烟草疫霉菌分子检测引物及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种烟草疫霉菌分子检测引物及其检测方法，专用于烟草疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间烟草黑胫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治【技术领域】。
【背景技术】
[0002]由烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae Breda de Haan)引起的烟草黑胚病是一种毁灭性世界病害。1896年van Breda de Haan在印度尼西亚的爪睡首次发现,此后该病流行蔓延迅速，1922年便成为美国的佛罗里达、堪萨斯州烟区的严重病害。1924年后，该病己遍布于全世界温带、亚热带和热带地区烟田。中国于1950年首次报道，当时该病发生在黄淮烟区，目前各主要产烟区均有不同程度的发生，其中安徽、山东、河南为历史上的重病区；云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生亦相当普遍，平均发病率为5%-12%，严重田块发病率高达75%，甚至造成绝收。烟草疫霉的寄主范围很广，可以侵害数百种植物，病害通常在潮湿、多雨条件下发病重，潜育期短，可多次再侵染，传播与蔓延迅速，常造成寄主植物成片死亡。近年来，由于我国连作烟田面积不断扩大，连作年限不断增加，加重了该病害的流行，我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达I亿元以上，仅次于烟草病毒病。该病属于维管束系统性病害，一旦发生就很难控制，对烟草威胁极大，并常与其他烟草根茎部病害混合发生，给病害的诊断造成困难，而生产上则常因不明发病原因，难以有针对性的防治措施，故造成更为严重危害。因此建立烟草疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及土壤进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。
[0003]传统烟草疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，程序繁琐，所需时间较长，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而免疫血清学鉴定方法虽已建立，但是特异性较差，常常受到抗血清质量的影响，容易造成假阳性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。
[0004]近年来随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，PCR技术的应用在很大程度上弥补了传统方法的不足，这类方法普遍具有特异、灵敏、快速且不需要进行病原菌分离培养的特点，可用于烟草疫霉引起病害显症之前的早期监测。
[0005]利用核糖体转录间隔区(rDNA-1TS)基因序列在物种进化过程中的保守性和异变性设计引物进行PCR扩增已在棉花、番茄、西瓜等作物的病害检测中得到了广泛的应用。但是越来越多的研究发现，在疫霉属中，部分疫霉菌种间ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将这部分疫霉菌与其近缘种区分开，因此要对烟草疫霉菌进行高灵敏性和特异性检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物。已有的研究表明，疫霉菌属中的YPTl基因(ras-related protein)是一个与原癌基因Ras (Rat sarcoma)相关的基因，在酵母中，该基因编码一个与Ras相关的GTP结合蛋白。YPTl基因包含有多个外显子和内含子，多个外显子具有保守性，而这些内含子在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行疫霉属卵菌近缘种的分子检测，区分不同种的疫霉菌。Schena等分析了 29个疫霉种43个菌株的YPTl基因的序列，认为YPTl基因作为疫霉菌分子检测的靶标基因在理论上是可行的。
[0006]因此，可以通过测定烟草疫霉菌及其它疫霉菌的YPTl基因，并进行多重比对分析，来鉴定烟草疫霉菌。该检测方法目前尚未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中烟草疫霉菌的生物学检测方法特异性差，灵敏度低、所需周期长、免疫血清学鉴定方法容易造成假阳性的问题，提供烟草疫霉菌特异分子检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的烟草疫霉菌快速分子检测的方法。
[0008]实现本发明的目的包括下列步骤:
1.通过测定烟草疫霉菌及其它疫霉菌的YPTl基因，并进行多重比对分析，设计了对烟草疫霉菌具有特异扩增作用的I对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为:
上游引物 YhF: 5’- GACATGATATCAACTGTTCTGCAG -3’
下游引物 YhR: 5’- CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG -3’
对烟草疫霉菌特异性扩增出342 bp的产物。
[0009]2.烟草疫霉菌特异分子检测体系的建立Cl)从被烟草疫霉菌感染的植物组织中提取DNA。
[0010]当在用于植株组织中`存在烟草疫霉菌时，按NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下:①将烟草病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；②按I mg病叶或病茎加入10uL(0.5mol/L NaOH, 0.5%PVP)计量,将组织充分磨碎成糊,在12,000 g离心机中离心6min ;③取上清20uL与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl (pH8.0)混合；④取I uL作为PCR模板进行扩
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[0011](2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用YhF/YhR这一对引物进行PCR扩增。
[0012]PCR 反应体系 25 μ 1，包括 2.5 μ L 10XPCR buffer (Mg2+free)，2.0 mmol/LMgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U Taq DNA聚合酶(Takara大连宝生物工程有限公司)，引物(YhF/YhR)各0.4 μ mol/L, 25 ng DNA模板，不足部分由无菌超纯水补足。扩增程序为:95°C预变性5 min ；94 °C变性30 s ;66°C退火45 s ；72 °C延伸30 S，共35个循环；最后72°C延伸 10 min。
[0013](3)将8 μ I PCR产物用1.5%琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。如果能特异性地扩增出342bp产物时，即可判断所述的植株组织中存在烟草疫霉菌；否则所述的植株组织中未存在烟草疫霉菌。
[0014]本发明方法适用于植物组织中烟草疫霉菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中烟草疫霉菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果:
1、特异性强:本发明检测方法是根据疫霉属YPTi基因含有多个外显子和内含子，且其基因序列保守区和进化区相互间隔的特点，设计了对烟草疫霉菌具有特异扩增作用的PCR引物；已经对源于中国福建、云南、台湾等省的烟草疫霉菌和带烟草疫霉菌的植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；
2、灵敏度高:将设计的特异引物与YPTl通用引物进行巢式PCR扩增后，对烟草疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10 fg，比常规PCR检测高100倍。
[0015]3、实用性好:本发明所设计出的特异PCR引物可用于带烟草疫霉菌组织的高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌组织中存在的烟草疫霉菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；
4、操作简便快速:应用本发明方法，对带烟草疫霉菌的植物组织进行病菌DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在数小时内完成。
[0016]5、本发明可用于带烟草疫霉菌的植物组织高灵敏度快速分子检测，此技术对于烟草疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义，可以为防治策略的制定提供科学依据。。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明所要检测的烟草疫霉菌的特异PCR扩增图。
[0018]图中:泳道I为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3-8为烟草疫霉菌，泳道9为大豆疫病菌，泳道10为致病疫霉菌，泳道11为掘氏疫霉菌，泳道12为黄瓜疫霉菌，泳道13为恶疫霉菌，泳道14为辣椒疫霉菌 ，泳道15为瓜果腐霉菌，泳道16为黄瓜霜霉菌，M为IOObpladder 分子量 marker。
[0019]图2为本发明烟草疫霉菌的灵敏性检测扩增结果图。
[0020]上图:单重PCR对烟草疫霉菌的灵敏性检测扩增结果图。
[0021]下图:巢式PCR对烟草疫霉菌的灵敏性检测扩增结果图。
[0022]图中:泳道I为I ng,泳道2为100 pg,泳道3为10 pg,泳道4为I pg,泳道5为100 fg，泳道 6 为 10 fg,泳道 7 为 I fg，M 为 IOObp ladder 分子量 marker。
[0023]图3为本发明发病组织的检测结果图。
[0024]图中:泳道I为阳性对照，泳道2-15为发病的烟草组织，泳道16为阴性对照，M为IOObp ladder 分子量 marker。
【具体实施方式】
[0025]以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不止限于此。
[0026]实施例1:引物序列的设计及引物对烟草疫霉菌的特异性扩增1.供试菌株基因组DNA的提取
为了获得烟草疫霉菌的特异引物序列，以我国福建、云南和台湾等省的31株烟草疫霉菌和多个疫霉属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下:取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900 μ I2% CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2% CTAB ；100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0 ；20mmol/L EDTA, ρΗ8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和 90 μ I 10% SDS (十二烷基苯磺酸钠)后混匀，于55~60°C水浴1.5 h,每10 min振荡混匀一次，水浴1.5 h后离心(12，000 rpm) 15min,取上清液加入等体积的酹/氯仿/异戍醇(25:24:1)，离心(12，000rpm)5 min,取上清液(水相)，加入等体积氯仿抽提一次(12，000 rpm离心5 min),吸上清,加0.1体积的3mol/L NaAC溶液和2体积的冰无水乙醇，-20°C下沉淀30 min后12，000 rpm离心5 min,轻轻地倒去上清液，加入700 μ I冰70%乙醇进行洗涤(稍离心，倾掉上清)，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用IXTE (10 mmol/LTris-HCL, 0.1 mmol/L EDTA ,pH 8.0)溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至25 ng/ μ I待用。
[0027]2.引物的设计
在烟草疫霉菌特异DNA片段序列的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物，引物序列为:
YhF: 5’- GACATGATATCAACTGTTCTGCAG -3’
YhR: 5’- CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG -3’
3.PCR验证
经对供试菌株和31株烟草疫霉菌的特异性进行PCR验证。具体的反应体系是PCR反应体系 25 μ 1，包括 2.5 μ L 10XPCR buffer (Mg2+ free), 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U Taq DNA聚合酶(Takara大连宝生物工程有限公司)，引物(YhF/YhR)各
0.4 μ mol/L, 25 ng DNA模板，不足部分由无菌超纯水补足。扩增程序为:95 °C预变性5min ；94 °C变性30 s ;66°C退火45 s ；72 °C延伸30 S，共35个循环；最后72 °C延伸10min。此特异引物在烟草疫霉菌上特异性地扩增出342 bp的产物。
[0028]4.检测特异性结果
PCR扩增结果见图1。除了来自我国福建、云南、台湾等省份的烟草疫霉菌DNA可特异地扩增出342 bp的产物外，检测了 12种不同真菌和6种疫霉、霜霉、腐霉等卵菌DNA均未能扩增出任何产物。这说明该引物具有很强的特异性，可被用于生产实践中发病植物组织中烟早疫霉囷快速可罪的检测和鉴定。
[0029]实施例2:引物对烟草疫霉菌的灵敏性检测
1.DNA浓度稀释:提取的烟草疫霉菌基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，采用系列浓度稀释。
[0030]2.烟草疫霉菌的灵敏性检测
首先以 YPTl 通用引物(phlF:5’ -CGACCATTGGCGTGGACTTT-3’，
Yph2R:5’ -ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3’ )作为第I轮反应引物，按以下反应体系和反应程序进行 PCR 扩增。PCR 反应体系 25 μ I,包括 2.5 μ L 10 XPCR buffer (Mg2+ free)，2.0mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U Taq DNA 聚合酶(Takara 大连宝生物工程有限公司)，引物(phlF / Yph2R)各0.4 μ mol/L, 25 ng DNA模板，不足部分由无菌超纯水补足。扩增程序为:95 °C预变性5 min ；94 °C变性30 s ;58°C退火45 s ；72 °C延伸30 S，共35个循环；最后72 °C延伸10 min。
[0031]然后取I μ L PCR产物为模板与引物(YhF/YhR)组合进行巢式PCR扩增。PCR反应体系 25 μ 1，包括 2.5 μ L 10XPCR buffer (Mg2+ free), 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/LdNTP, 1.0 U Taq DNA聚合酶(Takara大连宝生物工程有限公司)，引物(YhF/YhR)各0.4μ mol/L, 25 ng DNA模板，不足部分由无菌超纯水补足。扩增程序为:95 °C预变性5 min ；94 °C变性30 s ;66°C退火45 s ；72 °C延伸30 S，共35个循环；最后72 °C延伸10 min。
[0032]3.检测结果:如图2所示，上图为单重PCR对不同浓度烟草疫霉菌基因组DNA扩增结果，下图为巢式PCR对烟草疫霉菌的灵敏性检测扩增结果。在25 μ?反应体系中，以10 fg烟草疫霉菌基因组DNA为模板时仍可扩增出一条342 bp大小的特异性条带，表明其检测灵敏度可达10 fg。
[0033]实施例3:发病植物组织中烟草疫霉菌的检测
1.样品采集:植物组织样品采自福建省南平市烟草基地。
[0034]2.DNA提取及检测
发病植物组织采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下:①将烟草病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；②按I mg病叶或病茎加入IOuL (0.5 mol/L NaOH, 0.5%PVP)计量，将组织充分磨碎成糊，在12，000 g离心机中离心6min 取上清20uL与等体积的0.1mol/L的Tris-HCl (ρΗ8.0)混合；④取I uL作为PCR模板进行扩增。
[0035]PCR 扩增的反应体系 25 μ 1，包括 2.5 μ L 10 XPCR buffer (Mg2+ free)，2.0mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U Taq DNA 聚合酶(Takara 大连宝生物工程有限公司)，引物(YhF/YhR)各0.4 μ mol/L, 25 ng DNA模板，不足部分由无菌超纯水补足。扩增程序为:95 °C预变性5 min ；94 °C变性30 s ;66°C退火45 s ；72 °C延伸30 S，共35个循环；最后72 °C延伸10 min。电泳检测扩增产物。
[0036]3.检测结果
结果见图3，扩增产物如果出现一条清晰的分子量为342 bp的特异条带，则可判断发病组织感染烟草疫霉菌。图中第`2、3、4、10、12、13的烟草组织中检测出了烟草疫霉菌。
【权利要求】
1.一种烟草疫霉菌分子检测引物，其特征在于引物序列为:上游引物 YhF: 5’- GACATGATATCAACTGTTCTGCAG -3’，下游引物 YhR: 5’- CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG -3’ ；对烟草疫霉菌特异性扩增出342 bp的产物。
2.一种利用权利要求1引物的烟草疫霉菌检测方法，其特征在于:包括以下步骤:(O从被烟草疫霉菌感染的植物组织中提取DNA ；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用YhF/YhR这一对引物进行PCR扩增；(3)取适量步骤(2)的PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出342 bp的产物，即可判断所述的植物组织中存在烟草疫霉菌。
3.根据权利要求2所述的烟草疫霉菌检测方法，其特征在于:所述的步骤(2)PCR扩增的条件为:PCR 反应体系 25 μ?，包括 2.5 yL 10XPCR buffer, 2.0 mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP, 1.0 U Taq DNA 聚合酶，引物 YhF/YhR 各 0.4 ymol/L,25 ng DNA 模板，不足部分用无菌超纯水补足；扩增程序为95 °C预变性5 min, 94 °C变性30 s，66°C退火45 s,.72 °C延伸30 S，共35个循环，最后72 °C延伸10 min。
【文档编号】C12R1/645GK103555823SQ201310402932
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年9月7日 优先权日:2013年9月7日
【发明者】李本金, 陈庆河, 翁启勇, 何美玲, 谢世勇, 谢廷鑫 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所