一种3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种3?氨基?2?恶唑烷酮免疫检测方法，呋喃唑酮在动物体内迅速代谢为3?氨基?2?恶唑烷酮(AOZ)，检测呋喃唑酮的残留实际上是检测AOZ的残留。本发明的检测方法是将待检物中的3?氨基?2?恶唑烷酮(AOZ)提取后改用3?醛基苯甲酸甲酯进行衍生化，得到3?醛基苯甲酸甲酯?3?氨基?2?恶唑烷酮(PCPME?AOZ)，然后再测定该衍生物的含量。以NP?AOZ和PCPME?AOZ为标准品进行间接竞争酶联免疫吸附测定(icELISA)，结果证明用本发明的检测方法能够显著提高呋喃唑酮残留即3?氨基?2?恶唑烷酮(AOZ)免疫检测的灵敏度。
【专利说明】
一种3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及含有呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮的检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002]呋喃唑酮(痢特灵)是一种硝基呋喃类抗生素，为广谱抗菌药。3-氨基-2-恶唑烷酮 (3-Amino_2-〇xazolidinon，A0Z)是咲喃唑酮在动物体内的代谢物。咲喃唑酮可用于治疗细 菌和原虫引起的痢疾、肠炎、胃溃疡等胃肠道疾患。对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌有抑制 作用。对毛滴虫、贾第鞭毛虫也有一定的活性。其作用机制为干扰细菌氧化还原酶从而阻断 细菌的正常代谢。
[0003] 人口服呋喃唑酮吸收率低，通过血液循环主要停留在肠道内。但该药物对肝、肾刺 激大、易充血及发生体内糖代谢及神经病变作用，并可在体内残留。过量使用呋喃唑酮可能 会导致胃肠道反应;溶血性贫血、皮疹、药热等过敏反应;多发性神经炎;新生儿和G-6-PH缺 乏可致溶血性贫血。实验证明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有致癌和致突变的特性。
[0004] 由于呋喃唑酮的毒副作用，各国政府都采取了相关管制政策。美国在1975年和 1993年分别禁止了呋喃唑酮作为医药和兽药使用。日本在1977年禁止了呋喃唑酮的使用。 2002年，中华人民共和国农业部将呋喃唑酮列为禁止使用的药物，不得在动物性食品中检 出。中华人民共和国食品药品监督总局也于2002年禁止了硝基呋喃类(包括呋喃唑酮)在动 物性食品中的使用。
[0005] 但是，硝基呋喃类药物药效显著、价格低廉，能在动物体内迅速代谢从而难以检 测。我国的养殖业中，仍有一些不法分子在利益的驱使下滥用了呋喃唑酮药物，对消费者的 健康带来了极大的隐患，同时也严重损害了农产品进出口贸易。因此市场上急需一种高效 快速灵敏的呋喃唑酮药物残留的检测方法。
[0006] 由于酶联免疫吸附检测(ELISA)是一种具有突出优势的检测方法。该方法具有快 速、简单、准确、高通量、无需专业操作等优点，使得它成为一种理想的市场监查检测方法。 国家标准(GB/T 20752-2006，猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量 的测定)等的文献报道，把A0Z提取出来，在提取后用邻硝基苯甲醛作为衍生剂，与A0Z发生 成肟反应从而生成NP-A0Z，但是NP-A0Z的酶联免疫吸附检测不够灵敏。
[0007] 本发明创新地运用了一种呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮的检测方法，使得 相应的ELISA检测灵敏度大幅度提高。因此，本发明建立的酶联免疫吸附检测方法可以大大 提高检测准确性，为各层监督单位提供快速、高效、准确的检测方法，具有不可估量的市场 价值。
【发明内容】
[0008] 为了使得用于检测如动物源性食品及其加工产品等样品中A0Z残留的icELISA具 有更高的灵敏度，本发明创新了一种3-氨基-2-恶唑烷酮的处理方法，使得icELISA更加高 效更适宜于实际样品的检测。
[0009] 本发明所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法如下，将待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行酶联免疫吸 附检测，以测定待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮含量。
[0010] 本发明中用3-醛基苯甲酸甲酯与待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮发生肟反应。
[0011] 本发明所述的酶联免疫吸附检测为间接竞争酶联免疫吸附（icELISA)测定。
[0012] 本发明的待测样品的获取方法为将待检物与甲醇-水混合溶液混合研匀，离心后 的沉淀物为待测样品。
[0013] 本发明的待测样品肟反应的操作方法步骤包括：1)将沉淀物与盐酸溶液混合研 匀；2)再与3-醛基苯甲酸甲酯混匀后旋干;3)再加入1，4_二氧六环在氮气保护条件下加热 回流，减压旋转蒸发得到固体粉末;4)向步骤(3)的固体粉末中加入乙醇溶解;5)抽滤获取 白色固体为含有衍生得到的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮的物质。
[0014] 本发明所述的酶联免疫吸附检测中用完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-BSA免疫动物 体获得抗血清。所述的酶联免疫吸附检测为基于上述抗血清的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮间接竞争酶联免疫吸附反应。
[0015]本发明所述的酶联免疫吸附检测中以完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-0VA作为固相 抗原。
[0016] 本发明所述的酶联免疫吸附检测中以3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮为 竞争性抑制物，以抗血清为一抗，以IgG-HRP为酶标二抗。
[0017] 本发明所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法的应用，尤其在于将待测样品中 的3-氨基-2-恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行 酶联免疫吸附检测在3-氨基-2-恶唑烷酮快速检测试剂盒方面的应用。
[0018] 以上检测方法及其应用具有快速、简单、准确、高通量、无需专业操作等优点，使得 它成为一种理想的市场监查检测方法。
【附图说明】
[0019] 图1为3-氨基-2-恶唑烷酮(A0Z)的化学式；
[0020] 图2为3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮(PCPME-A0Z)的化学式；
[0021] 图3为邻硝基苯甲醛-3-氨基-2-恶唑烷酮(NP-A0Z)的化学式；
[0022] 图4为以PCPME-A0Z为标准抑制物的抗血清icELISA标准曲线；
[0023] 图5为以NP-A0Z为标准抑制物的抗血清i cELI SA标准曲线
【具体实施方式】
[0024] 本发明中出现的技术术语及相关试剂配方如下：
[0025] △02:3-氨基2-恶挫烧酮（3-/\111；[110-2-(?&2011(1;[11011);
[0026] BSA:牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA)，分子量约为66.43kDa;
[0027] OVA:卵白蛋白（Albumin，from chicken egg white)，分子量约为44kDa;
[0028] Tween-20:吐温20;
[0029] Gelatin:明胶；
[0030] DMEM:Dulbecco's modified Eagle's medium,细胞培养液；
[0031] PEG:聚乙二醇 2000;
[0032] HAT:hypoxanthine(次黄噪呤），aminopterin(氨基噪呤），thymidine(胸腺啼啶）；
[0033] PBS:磷酸盐缓冲液（NaCl 137mM，KH2P04 1.5mM，Na2HP04 ? 12H20 8.3mM，pH 7.5)；
[0034] PBST: PBS溶液中加入0 ? 1 % 的Tween-20;
[0035] PBSTG: PBST溶液中加入0 ? 1 %的明胶；
[0036] 包被缓冲液：1.5g Na2C03、2.93g NaHC03溶于 1000mL水，pH 9.6;
[0037] 底物缓冲液：5.1g-水合柠檬酸、18.43g Na2HP04 ? 12H20、1.0mL Tween-20溶于 lOOOmL水，pH 5.0;
[0038] 文中出现的所有试剂及仪器设备均可配制或市购获得，本发明具体实施例中所使 用的试剂均购买于Sigma公司。
[0039] 试验例1:
[0040] 待检物中3-氨基2-恶唑烷酮的获取及其衍生物3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶 唑烷酮(PCPME-A0Z)的获取。
[0041] 可参考国家标准(GB/T 20752-2006)的文献报告，用文献中的方法把3-氨基2-恶 唑烷酮提取出来，方法可以是（1)收集市场中或实验室制备的待检物，置于棕色离心管中， 加入甲醇-水混合溶液（甲醇与水的混合体积比为2:1)，研均，再用甲醇-水混合溶液洗涤均 质器刀头，二者合并后离心，吸取上清液弃掉。
[0042] (2)向上述离心管中加入盐酸溶液，研均，用盐酸溶液洗涤均质刀头，二者合并。
[0043] (3)把步骤(2)中的混合液中加入3-醛基苯甲酸甲酯，混匀后旋干。加入干燥的1， 4-二氧六环(1，4-dioxane)到反应瓶中，在氮气保护条件下，加热回流。
[0044] (4)用减压旋转蒸发仪脱溶剂得到固体粉末。
[0045] (5)向步骤(4)的固体粉末中加入乙醇，在超声波水浴槽中促溶解。
[0046] (6)直接通过抽滤除掉3-醛基苯甲酸甲酯得到白色固体。
[0047] (7)干燥处理后得到白色粉末3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮（PCPME- A0Z)。
[0048]经过上述处理方案，若待检物提取的待测样品中含有3-氨基-2-恶唑烷酮(A0Z)， 其将与3-醛基苯甲酸甲酯发生成肟反应，衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮 (PCPME-A0Z)〇
[0049] 具体的：
[0050] (1)待测样品的获取。收集市场中或实验室制备的待检物，称取2.0g( ±0.01 g)，分 别置于50mL棕色离心管中，加入10mL甲醇-水混合溶液（甲醇与水的混合体积比为2:1)，均 质2min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并5000r/min离心10min，吸取上 清液弃掉。向3个离心管中分别加入适量A0Z，使最终测定浓度为10.0ng/mL。
[0051 ] (2)向上述每个离心管中加入10mL 0.2mol/L盐酸溶液，研均2min，用10mL 0.2mol/L的盐酸溶液洗涤均质刀头，二者合并。
[0052] (3)向步骤(2)的混合液中加入0.4mL3-醛基苯甲酸甲酯，混匀后悬干。加入干燥的 1，4-二氧六环（1，4-(1;[(^116)至1」251111单口反应瓶中，在氮气保护条件下，加热回流1.5至2.5 小时。
[0053] (4)用减压旋转蒸发仪脱溶剂得到固体粉末。
[0054] (5)向步骤(4)的固体粉末中加入乙醇，混匀溶解。
[0055] (6)直接通过抽滤除掉3-醛基苯甲酸甲酯。
[0056] (7)干燥上述混合液，处理后得到白色粉末。
[0057]以上化学反应使得待测样品中可能含有的3-氨基-2-恶唑烷酮(A0Z)与3-醛基苯 甲酸甲酯发生成肟反应，衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮(PCPME-A0Z)。 [0058] 试验例2:
[0059]合成A0Z的半抗原和完全抗原，并用完全抗原免疫实验小鼠获得抗血清：
[0060]参考Kevin M等的文献报道（Kevin M. Cooper，Anthony Caddel 1，Christopher T.Elliott,D.Glenn Kennedy.Production and characterisation of polyclonal antibodies to a derivative of 3_amin〇-2-〇xazolidinone，a metabolite of the nitrofuran furazolidone.Analytica Chimica △(^&，2004,520,79-86.)，合成厶02的半抗 原和完全抗原。用完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-BSA(按蛋白的量计量，1. Omg/mL)与弗氏佐 剂按l:l(v/V)混合乳化，乳化完全后注射到小鼠体内。免疫Balb/c雌性小鼠，每只小鼠每次 分别在背部和腹腔各注射。四次免疫之后，取小鼠血液，离心之后得到抗血清。
[0061 ]具体的，制备了A0Z半抗原的方法步骤如下：
[0062] (1)依次取A0Z盐酸盐固体粉末38.0mg(l .Oequiv. )，3_醛基苯甲酸41.6mg (1 .Oequiv.)，干燥的1,4-二氧六环（1，4-dioxane)8mL共同加入到25mL单口反应瓶中，在氮 气保护条件下，加热回流2小时。
[0063 ] (2)用减压旋转蒸发仪脱溶剂得到白色固体粉末。
[0064] (3)向步骤(2)的固体粉末中加入8mL乙醇，在超声波水浴槽中溶解lmin。
[0065] (4)由于A0Z-3-醛基苯甲酸在乙醇中的溶解性很差，而3-醛基苯甲酸在乙醇中溶 解性很好，直接通过抽滤除掉3-醛基苯甲酸得到白色固体。
[0066] (5)干燥步骤(4)中的白色固体得到半抗原A0Z-3-醛基苯甲酸。
[0067]具体的，制备了A0Z完全抗原的方法步骤如下：
[0068] (1)取半抗原A0Z-3-醛基苯甲酸2 ? 13mg(30 ? Oequiv ?)溶于0 ? 5mL N，N-二甲基甲酰 胺(DMF)，搅拌溶解。加入N-羟基琥珀酰亚胺(順3)1.5711^(45.0叫1^.)搅拌3〇1^11，再加入 1'1，1'1'-二环己基碳二亚胺(0(^)2.81311^(45.〇6911；[￥.)4°0搅拌过夜。
[0069] (2)称取牛血清蛋白（85六）2〇11^(1.0叫11".）装入1〇11^玻璃反应瓶中，再加入211^ PBS搅拌溶解。
[0070] (3)把步骤(1)中的混合物缓慢逐滴加入到步骤(2)的溶液中，4°C搅拌过夜。
[0071] (4)把步骤(3)中混合物转移到透析袋中，用PBS透析2天，每天换液3次。最后按蛋 白质的量用PBS配成1.0mg/mL，分装到1. OmL/管，-40 °C长期冻存。此过程就完成了半抗原与 蛋白质的偶联(即得到完全抗原）。
[0072] 半抗原与卵清白蛋白（0VA)的偶联方法同上。
[0073]具体的，用完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-BSA免疫Balb/c雌性小鼠获得抗血清的方 法步骤如下:取上述制备好的完全抗原一管（1.OmL)与弗氏佐剂按l:l(v/v)混合乳化，乳化 完全后注射到小鼠体内。
[0074] 免疫Balb/c雌性小鼠的免疫方案见表1。
[0075]表1完全抗原免疫小鼠的免疫方案
[0077] 将第四次免疫（四免）之后的小鼠进行眼眶取血，离心取血清，从而制备得到抗血 清。
[0078] 试验例3:
[0079]以抗血清和PCPME-A0Z、NP_A0Z分别建立了间接竞争酶联免疫吸附反应(icELISA) 进行对照及建立标准曲线的方法如下：
[0080] (1)取完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-〇VA( 1 ? Omg/mL)用包被缓冲液稀释1: 320000 倍，加到酶标板中200uL/孔。放入37 °C培养箱中温育3h。
[0081 ] (2)用PBST洗板4次，甩干。
[0082] (3)将标准品 PCPME-A0Z 用 PBSTG 稀释成系列梯度（2;1;0.5;0.25;0.125 ;0.0625; 0.03125;0即/11^)。或将标准品陬-402用？8516稀释成系列梯度（300;150 ;75;37.5;18.75; 9.375;Ong/mL)。用roSTG把抗血清稀释120000倍。在酶标板孔中依次加入100uL浓度为标准 品和1 OOuL抗血清稀释液。37 °C温育30min。
[0083] (4)用PBST洗板4次，甩干。
[0084] (5)每孔加入200uL 用 PBSTG 稀释的 IgG-HRP。
[0085] (6)用PBST洗板4次，甩干。
[0086] (7)每孔加入200uL底物缓冲液，显色到一定程度再加入50uL硫酸(2M)终止反应。
[0087] (8)在492nm波长测吸光值。
[0088] 测得相应数据后，用分析软件OriginPro 8.0建立标准曲线，见图4(PCPME-A0Z为 标准品），图5 (NP-A0Z为标准品）。
[0089]利用本发明的检测方法，可以成功地使待检物中可能残留的A0Z经过一系列的衍 生化反应，最终得到了 PCPME-A0Z。并利用制备得到的抗血清，以PCPME-A0Z作为标准抑制物 建立了 icELISA，其标准曲线见图4。同时，利用以已报道的衍生方法得到的NP-A0Z作为标准 抑制物建立了 icELISA，其标准曲线见图5。以NP-A0Z为标准品进行间接竞争酶联免疫吸附 测定（化￡1134)，得到的1050和检测范围分别为46.63即/11^，11.02~187.43叫/11^。而以 PCPME-A0Z为标准品进行间接竞争酶联免疫吸附测定（icELISA)，得到的IC50和检测范围分 别为0 ? 37ng/mL，0 ? 08~1 ? 31ng/mL。结果证明以PCPME-A0Z为标准抑制物时，其icELISA的灵 敏度更高。实验证明以本发明的A0Z检测方法能大幅度提升icELISA灵敏度。
[0090]将待检物中可能残留的A0Z经过一系列的衍生化反应，最终得到了PCPME-A0Z，以 PCPME-A0Z作为标准抑制物建立了 i cELI SA，得到的吸光值与标准曲线比对，从而知悉A0Z的 含量，其能提高icELISA灵敏度，可以快速推广市场应用，在市场监测过程中具有更深远的 意义。
[0091]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范 围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术 实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将 被视为涵盖于该权利要求范围之中。
【主权项】
1. 一种3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，将待测样品中的3-氨基-2-恶 唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行酶联免疫吸附 检测，以测定待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮含量。2. 如权利要求1所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，用3-醛基苯甲 酸甲酯与待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮发生肟反应。3. 如权利要求1所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，所述的酶联免 疫吸附检测为间接竞争酶联免疫吸附测定。4. 如权利要求2所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于:待测样品的获 取方法为将待检物与甲醇-水混合溶液混合研匀，离心后的沉淀物为待测样品。5. 如权利要求4所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，所述的待测样 品肟反应的操作方法步骤包括： 1) 将沉淀物与盐酸溶液混合研匀； 2) 再与3-醛基苯甲酸甲酯混匀后旋干； 3) 再加入1，4_二氧六环在氮气保护条件下加热回流，减压旋转蒸发得到固体粉末； 4) 向步骤(3)的固体粉末中加入乙醇溶解； 5) 抽滤获取白色固体为含有衍生得到的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮的物 质。6. 如权利要求1至5所述的任一 3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，酶联免 疫吸附检测中用完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-BSA免疫动物体获得抗血清。7. 如权利要求6所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，酶联免疫吸附 检测为基于抗血清的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮间接竞争酶联免疫吸附反应。8. 如权利要求7所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，酶联免疫吸附 检测中以完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-OVA作为固相抗原。9. 如权利要求8所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法，其特征在于，酶联免疫吸附 检测中以3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮为竞争性抑制物，以抗血清为一抗，以 IgG-HRP为酶标二抗。10. 如权利要求1所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法的应用，其特征在于将待测 样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮 后进行酶联免疫吸附检测在3-氨基-2-恶唑烷酮快速检测试剂盒方面的应用。
【文档编号】G01N33/543GK105911272SQ201610339702
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】王保民, 张威, 陈俊玉, 王冕, 谢紫君, 杨涛, 宁香雪, 郭素琴, 谭桂玉, 丹阳
【申请人】福建安欣睿捷生物科技有限公司