从莫勒菌中提取5α,8α-环二氧-24(R)-甲甾-6,22-二烯-3β-醇的方法
【专利摘要】本发明公开了从莫勒菌中提取一种甾体化合物5α,8α-环二氧-24(R)-甲甾-6,22-二烯-3β-醇的方法，包括:1)活化菌株;2)初级培养;3)次级培养;4)减压抽滤得到菌丝体，菌丝体恒温干燥;5)甲醇浸提;6)得到的流分旋蒸浓缩，溶于水用乙酸乙酯等体积萃取三次，乙酸乙酯部位旋蒸得浸膏，分别以石油醚：二氯甲烷，(3:1,2:1,1:1)减压硅胶柱洗脱，其中石油醚：二氯甲烷1:1洗脱成分经石油醚：乙酸乙酯5:1等度洗脱，经TLC收集相同洗脱液，经EI-MS、NMR、谱图分析并与文献对比得甾体5α,8α-环二氧-24(R)-甲甾-6,22-二烯-3β-醇。
【专利说明】从莫勒菌中提取5 a , 8 α -环二氧-24 (R)-甲甾-6, 22- 二
烯-3 β -醇的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及从莫勒菌中提取一种甾体化合物5α，8α-环二氧-24(R)-甲甾-6，22- 二烯-3 β -醇的方法。
【背景技术】
[0002]虫生真菌生态学上被认为是一种寄生在昆虫体内或者外壳表面，并最终能够引起宿主昆虫死亡的一种真菌，这种真菌是产生天然活性化合物的重要资源，莫勒菌(Moelleriella)是虫生真菌的重要成员，隶属于粪壳菌纲，肉座菌目，麦角菌科。随着研究的深入，近年来人们发现莫勒菌的代谢产物具有抗菌、抗肿瘤和抗疟原虫等生物活性，这预示该菌在生物农药或医药上存在很大应用价值。
[0003]5α ,8 α -环二氧-24 (R )-甲甾_6，22- 二烯_3 β -醇，有一定的细胞毒活性和抗疟原虫活性，是一种麦角固醇的衍生物，而麦角固醇是麦角固醇是一种重要的医药化学原料，所以该化合物含有很重要的潜在的医学价值，有待进一步活性研究。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供从莫勒菌中提取一种留体化合物5α，8 α-环二氧_24(R)-甲甾-6，22- 二烯-3 β -醇的方法。
[0005]本发明采取的技术方案如下:
一种从莫勒菌中提取留体 化合物5α，8α-环二氧-24 (R )-甲留_6，22-二烯-3 β_醇的方法，其特征在于该方法包括以下步骤:
O将莫勒菌活化后，取菌块接种PDB培养基中，在120 r/min、26°C条件下连续培养7天，按10%接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120 r/min、26°C条件下连续培养31天得发酵物；
2)发酵物经抽滤得到菌丝体，菌丝体在35°C下恒温干燥后，用甲醇浸提后旋蒸浓缩至干，用水溶解后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏；
3)将浸膏上200-300目硅胶柱，进行粗分；分别以石油醚:二氯甲烷=(3:1，2:1, 1:1)减压硅胶柱洗脱。
[0006]4)将3)中得到的石油醚:二氯甲烷1:1洗脱成分，经减压浓缩后上200~300目硅胶柱，以石油醚:乙酸乙酯体积比=5:1等度洗脱，经TLC分析，收集相同Rf值相同的洗脱液，旋蒸浓缩。
[0007]所述步骤I)中接种菌块的大小为0.5X0.5cm，接种量为5块。
[0008]所述步骤2)中浸提要用1-3倍体积甲醇浸提48小时，每8小时超声20分钟。
[0009]所述步骤2)中具体操作为:发酵物经抽滤得到菌丝体，菌丝体在35°C下恒温干燥后，用甲醇浸提后旋蒸浓缩至干，用200mL水溶解后与乙酸乙酯按体积比1:1.5混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取菌液3飞次，每次5~lOmin。[0010]所述步骤4)中石油醚:乙酸乙酯体积比=5:1等度洗脱，收集TLC分析中以石油醚:丙酮=3:1为展开剂时Rf值为0.2-0.3的组分。
[0011]本发明的技术效果:
本发明以繁殖快、周期短的真菌为材料，成本低，操作简单，重复性好，无需昂贵的仪器，通过多次进行硅胶柱层析，制得了一种留体化合物5α，8 α-环二氧_24(R)_甲留-6, 22- 二烯-3 β -醇。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1单体化合物TLC (石油醚:丙酮=3:1)
图2化合物的的1H NMR谱 图3化合物的13C NMR谱
图4化合物的13C NMR谱(下)和DEPT 135谱(上)
图5化合物的COSY谱 图6化合物的HSQC谱 图7化合物的HMBC谱 图8化合物的NOSEY谱 图9化合物的E1-MS谱 图10化合物的化学结构。
[0013]
【具体实施方式】
[0014]实施例1:甾体化合物5 α，8 α -环二氧-24 (R ) _甲甾_6，22- 二烯_3 β -醇的制备
O将莫勒菌(邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现.菌物学报，2009.28(1):148-150)活化后，以0.5X0.5cm (5块)接种于PDB培养基(马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min, 4层纱布过滤,称取20g葡萄糖,加蒸懼水定容至IOOOmL, pH自然。分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，高压灭菌121°C，20min。)中，在120r/min、26°C条件下连续培养7天，按10%接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120r/min、26°C条件下连续培养31天得发酵物。
[0015]2)发酵物减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在35°C下恒温干燥后，用I倍体积的甲醇浸提，每8个小时采用超声二十分钟，重复浸提3次。合并浸提液，旋蒸浓缩至干，溶于200ml水中，样品水溶液与乙酸乙酯按体积比1: 1.5混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取3次，每次10min,乙酸乙酯有机层浓缩得浸膏。
[0016]3)将浸膏上200~300目硅胶柱，进行粗分。分别以石油醚:二氯甲烷(3: 1，2:1,1:1)减压硅胶柱洗脱。
[0017]4)将3)中得到的石油醚:二氯甲烷1:1洗脱成分，经减压浓缩后上200-300目硅胶柱，以石油醚:乙酸乙酯体积比=5:1等度洗脱，经TLC以石油醚:丙酮=3:1为展开剂时分析，收集相同Rf值相同(0.2-0.3)的洗脱液，旋蒸浓缩；
5)将4)，中浓缩物用氘代试剂溶解测试核磁共振(图2-8)，并测试低分辨质谱(图9)，由谱图分析并与文献(Sheff er M, Fried A , Gottlieb HE, Tietz A , Avron M.Lipidcomposi—tion of the plasma membrane of the halotolerant alga, Dun aliel—la saIina.Biochim.Biophys.Acta 1986; 857: 165 — 72)对比得到一种甾体化合物 5 a，8a -环二氧-24 (R )-甲甾-6，22- 二烯 _3 β -醇。
[0018]实施例2:甾体化合物5 a，8 a -环二氧-24 (R ) _甲甾_6，22- 二烯_3 β -醇的制备
I)将莫勒菌(本实验室野外采集，分离纯化并保藏菌株)活化后，以0.5X0.5cm (4块)接种于PDB培养基(马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30 min, 4层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，高压灭菌121°C，20min。)中，在120r/min、26°C条件下连续培养7天，按10%接种量再次转接到TOB培养基中，继续在120r/min、26°C条件下连续培养31天即得发酵物。
[0019]2)发酵物减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在35°C下恒温干燥后，用得2倍体积的甲醇浸提，每8个小时采用超声二十分钟，重复浸提3次。合并浸提液，旋蒸浓缩至干，溶于200ml水，样品水溶液与乙酸乙酯按体积比1:1.5混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取4次，每次7 min，乙酸乙酯有机层浓缩得浸膏。
[0020]3)将浸膏上200~300目硅胶柱，进行粗分，分别以石油醚:二氯甲烷(3:1，2:1,1:1)减压硅胶柱洗脱。
[0021]4)将3)中得到的石油醚:二氯甲烷1:1洗脱成分，经减压浓缩后上200-300目硅胶柱，以石油醚:乙酸乙酯体积比=5:1等度洗脱，经TLC以石油醚:丙酮=3:1为展开剂时分析，收集相同Rf值相同(0.2-0.3)的洗脱液，旋蒸浓缩；
5)将4)，中浓缩物用氘代试剂溶解测试核磁共振(图2-8)，并测试低分辨质谱(图9)，由谱图分析并与文献对比得 到一种留体化合物5a，8 α-环二氧-24(R )-甲留_6，22_ 二稀_3 β _醇。
[0022]实施例3:甾体化合物5 a，8 a -环二氧-24 (R ) _甲甾_6，22- 二烯_3 β -醇的制备
I)将莫勒菌(本实验室野外采集，分离纯化并保藏菌株)活化后，以0.5X0.5cm (4块)接种于PDB培养基(马铃薯去皮，切块，称取200g，沸水煮30min，4层纱布过滤，称取20g葡萄糖，加蒸馏水定容至1000mL，pH自然。分装到250ml三角瓶中，每瓶装100ml，高压灭菌121°C，20min。)中，在120r/min、26°C条件下连续培养7天，按10%接种量再次转接到TOB培养基中，继续在120r/min、26°C条件下连续培养31天得发酵物。
[0023]2)发酵物减压抽滤得到菌丝体，菌丝体在35°C下恒温干燥后，用3倍体积的甲醇浸提，每8个小时采用超声二十分钟，重复浸提3次。合并浸提液，旋蒸浓缩至干，溶于200ml水，样品水溶液与乙酸乙酯按体积比1:1.5混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取5次，每次5min,乙酸乙酯有机层浓缩得浸膏。
[0024]3)将浸膏上200-300目减压硅胶柱，进行粗分。分别以石油醚:二氯甲烷(3:1，2:1, 1:1)减压硅胶柱洗脱。
[0025]4)将3)中得到的石油醚:二氯甲烷1:1洗脱成分，经减压浓缩后上200~300目硅胶柱，以石油醚:乙酸乙酯体积比=5:1等度洗脱，经TLC以石油醚:丙酮=3:1为展开剂时分析，收集相同Rf值相同(0.2-0.3)的洗脱液，旋蒸浓缩；5)将4)， 中浓缩物用氘代试剂溶解测试核磁共振(图2-8)，并测试低分辨质谱(图9)，由谱图分析并与文献对比得到一种留体化合物5α，8 α-环二氧-24(R )-甲留_6，22_ 二稀_3 β _醇。
【权利要求】
1.一种从莫勒菌中提取留体化合物5α，80-环二氧-240?)-甲留-6，22-二烯-3 β-醇的方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 1)将莫勒菌活化后，取菌块接种PDB培养基中，在120r/min、26°C条件下连续培养7天，按10%接种量再次转接到PDB培养基中，继续在120 r/min、26°C条件下连续培养31天得发酵物； 2)发酵物经抽滤得到菌丝体，菌丝体在35°C下恒温干燥后，用甲醇浸提后旋蒸浓缩至干，用水溶解后用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏； 3)将浸膏上200-300目硅胶柱，进行粗分；分别以石油醚:二氯甲烷=(3:1，2:1, 1:1)减压硅胶柱洗脱； 4)将3)中得到的石油醚:二氯甲烷1:1洗脱成分，经减压浓缩后上200-300目硅胶柱，以石油醚:乙酸乙酯体积比=5:1等度洗脱，经TLC分析，收集相同Rf值相同的洗脱液，旋蒸浓缩。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤I)中接种菌块的大小为0.5X0.5cm，接种量为5块。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤2)中浸提要用1-3倍体积甲醇浸提48小时，每8小时超声20分钟。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2)中具体操作为:发酵物经抽滤得到菌丝体，菌丝体在35°C下恒温干燥后，用甲醇浸提后旋蒸浓缩至干，用200mL水溶解后与乙酸乙酯按体积比1:1.5混合，倒入分液漏斗中，摇瓶萃取菌液3飞次，每次5~lOmin。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤4)中石油醚:乙酸乙酯体积比=5:1等度洗脱，收集TLC分析中以石油醚:丙酮=3:1为展开剂时Rf值为0.2-0.3的组分。
【文档编号】C12P33/20GK103468778SQ201310402936
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月7日 优先权日:2013年9月7日
【发明者】邱君志, 郭庆丰, 张以盼, 曹丽萍, 何肖云, 孟丽雪, 董冬, 凃洁, 李小霞, 姚灵丹 申请人:福建农林大学