一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于烟草抗病性检测技术领域，具体涉及一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定 方法。
【背景技术】
[0002] 烟草黑腔病是由烟草疫霉（Phytophthoranicotianae)引起的，一旦被侵染，整 个烟株就会死亡。自然条件下，其病原菌烟草疫霉主要侵染根、茎等地下部分，偶见叶部侵 染。在品种抗性鉴定中多采用根部或根胫部接种，应用较多的室内接种鉴定（GB/T23224) 要求每份材料10~20株，才可有效评价抗性。这种方法对数量庞大的诱变群体或突变群 体、杂交变异群体进行单株抗性鉴定显然不适合。因此，需要建立一种新的方法解决这类材 料抗性鉴定的难题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法。
[0004] 本发明的目的是这样实现的：所述烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法包括组培快 繁、贴敷接种、烟苗培养及抗性判别工序，具体包括：
[0005]A、组培快繁：取团棵期至旺长期烟草单株的最幼嫩顶叶叶片组织，常规消毒，切取 小叶圆片不经愈伤组织直接培养成苗，形成群体后，筛选长势一致的单株组培苗移栽至漂 浮盘上煅苗后，按常规漂浮育苗方式继续培育至5~6片真叶苗，挑选长势整齐的烟苗移栽 至装有育苗基质的栽培盆中，待烟苗成活后，剪叶，整苗，以备接种。
[0006]B、贴敷接种：用已消毒的打孔器，从长满黑胫病菌菌丝的培养基平板中打取直径 或边长4~6mm的菌丝块，将长满菌丝的一面贴于微伤的烟苗根茎部，用保湿透气材料包裹 烟苗根茎部的菌丝块贴敷处，每株烟苗贴敷菌丝块1块；以抗性品种RBST和感病品种红花 大金元进行同样的处理作为对照。
[0007]C、烟苗培养：将接种后的烟苗置于盛有水的浅盘中，维持土壤湿润，在25~28°C， 相对湿度75%以上，12h光照12h黑暗交替的人工气候室中培养不少于14天。
[0008]D、抗性判别：接种后第3天开始观察发病情况，第7天、第14天各调查1次，以最 后一次调查的结果统计病情，烟草黑胫病以株为单位调查，以接种点病斑扩展、烟苗凋萎记 作发病，以接种点病斑不扩展、烟苗直立、生长正常记作不发病，调查所有接种烟苗，以发病 率a统计病情，按发病率a划分抗感性，免疫或高抗的发病率为a= 0,抗病的发病率为0 <a< 25%，中抗的发病率为25%<a< 45%，中感的发病率为45%<a< 65%，感病的 发病率为65%< 80%，高感的发病率为80%< 100%，其中免疫或高抗、抗病、中 抗的即为抗性材料。
[0009] 本发明由于单株通过小叶圆片不经愈伤组织直接培养成苗，可有效保持原有单株 的固有遗传特性；同时由单株组织培养形成一定数量的群体，筛选长势一致的进行抗性鉴 定，湿润培养，在控温、保湿、光照相对恒定的人工可控环境条件下，以感病和抗病亲本为对 照，增强了抗性结果的稳定性、不同批次结果的重复性与可比性，鉴定结果重现性高，节省 了鉴定的时间与空间，鉴定过程简便易学，可程序化，减少了不同操作人员间的人为误差， 节省人力，可实现大规模的抗性鉴定，特别适合从数量庞大的诱变群体或突变群体、杂交变 异群体中筛选抗病靶标单株。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制， 基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0011] 本发明所述烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法包括组培快繁、贴敷接种、烟苗培养 及抗性判别工序，具体包括：
[0012] 所述组培快繁工序指的是：取团棵期至旺长期烟草单株的最幼嫩顶叶叶片组织， 常规消毒，切取小叶圆片不经愈伤组织直接培养成苗，形成群体后，筛选长势一致的单株组 培苗移栽至漂浮盘上煅苗后，按常规漂浮育苗方式继续培育至5~6片真叶苗，挑选长势整 齐的烟苗移栽至装有育苗基质的栽培盆中，待烟苗成活后，剪叶，整苗，以备接种。
[0013] 所述贴敷接种工序指的是：用已消毒的打孔器，从长满黑胫病菌菌丝的培养基平 板中打取直径或边长4~6mm的菌丝块，将长满菌丝的一面贴于微伤的烟苗根茎部，用保湿 透气材料包裹烟苗根茎部的菌丝块贴敷处，每株烟苗贴敷菌丝块1块；以抗性品种RBST和 感病品种红花大金元进行同样的处理作为对照。
[0014]所述烟苗培养工序指的是：将接种后的烟苗置于盛有水的浅盘中，维持土壤湿润， 在25~28°C，相对湿度75%以上，12h光照12h黑暗交替的人工气候室中培养不少于14 天。
[0015] 所述抗性判别工序指的是：接种后第3天开始观察发病情况，第7天、第14天各 调查1次，以最后一次调查的结果统计病情，烟草黑胫病以株为单位调查，以接种点病斑扩 展、烟苗凋萎记作发病，以接种点病斑不扩展、烟苗直立、生长正常记作不发病，调查所有 接种烟苗，以发病率a统计病情，按发病率a划分抗感性，免疫或高抗的发病率为a= 0， 抗病的发病率为〇 <a< 25%，中抗的发病率为25%<a< 45%，中感的发病率为45% < 65%，感病的发病率为65% <a< 80%，高感的发病率为80% <a< 100%，其中免 疫或高抗、抗病、中抗的即为抗性材料。
[0016]步骤A所述筛选长势一致的单株组培苗移栽至漂浮盘上煅苗，时间为5~7天。
[0017]步骤A所述挑选长势整齐的烟苗移栽至装有育苗基质的栽培盆中，每盆烟苗数不 少于3株，每单株系烟苗数至少12株。
[0018] 步骤B所述长满黑胫病菌菌丝的培养基平板为燕麦培养基平板。
[0019] 步骤B所述菌丝块的直径或边长为5mm。
[0020] 步骤B所述微伤的烟苗根茎是采用弯头眼科小镊子轻刮茎基部表皮或4~6根昆 虫针束轻度刺伤茎基部表皮的方法处理，以形成微伤的表面。
[0021 ] 步骤B所述保湿透气材料为脱脂棉或育苗基质。
[0022] 步骤C所述维持土壤湿润，需使土壤的含水率保持在60 %~80 %。
[0023]步骤C所述烟苗在人工气候室中的培养时间为14天。
[0024] 实施例1
[0025]--改良单株抗黑腔病鉴定
[0026] 本实施例用烟草疫霉0号生理小种（中华人民共和国烟草行业标准YC/T39-1996) 为实验菌株，用抗病亲本RBST