一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法，包括以下步骤：用利马豆液体培养基或燕麦液体培养基稀释烯酰吗啉配置各种质量浓度的药剂；将烟草黑胫病菌在利马豆固体培养基平板上培养，经V8液体培养基诱导得到游动孢子悬浮液，将其浓度调整为1×104个/mL；将96孔微孔板置于监控培养箱中，28℃黑暗条件下培养72h，采用生长曲线监控软件读取0-72h小时黑胫病菌生长曲线的数据；培养0和72h时，采用浊度测定软件测定590nm每孔黑胫病菌的OD值，按照公式(1)计算杀菌剂对黑胫病菌孢子萌发、菌丝生长的抑制率，并计算药剂对菌株的EC50值。本发明检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性简便、快速、高效、准确。
【专利说明】一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体来说涉及一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]由烟草黑胚病菌(Phytophthoraparasitica var.nicotianae)引起的烟草黑胚病是世界范围内烟草危害最为严重的病害之一，在烟草整个生育期内均可侵染烟草根系、茎杆以及叶片等多个组织，通常导致根系坏死、叶片黄化、植株萎蔫、甚至枯死等症状。在不采取防治措施的情况下，损失可以达到100%。目前，烟草黑胫病的防治主要依赖化学农药，且防治药剂品种较为单一。苯基酰胺类杀菌剂甲霜灵在烟草上已连续使用多年，抗药性问题日益突出，防治效果逐渐降低，及时进行快速高效的敏感性检测是黑胫病抗药性治理的必要前提。此外，新型化学杀菌剂的开发需要采用室内生物测定的方法对病原菌的生物活性进行高通量筛选。病原真菌传统的室内生物测定方法有孢子萌发法和菌丝生长速率法。前者通常采用“载玻片法”和“营养琼脂法”，但都涉及显微镜下观察，计数较麻烦；后者通常采用“培养皿培养法”，但测试时间较长、工作量大。两种方法很难作为大批量病原菌敏感性检测和高通量筛选杀菌化合物的方法。寻找简便、快速、高效和准确的生物测定方法成为国内、外病原菌敏感性测定和杀菌剂高通量筛选的重要目标。
[0004]微孔板法(MicropLate method)是利用监控培养箱(BioLog OminLog)培养待测病原菌、生长曲线监控软件(OminLog-PM)获取病原菌的生长曲线，浊度测定软件(Microstation)快速检测微孔板(96孔)中菌悬液的OD值，以OD增加值作为评价指标，用空白对照组与药剂处理组OD增加值的差值来计算药剂抑制率的方法。这种方法既能够获得药剂选择下病原菌的生长曲线，又能测得病原菌对化学杀菌剂的敏感性。Gerd曾用YBA培养液测定了啶酰菌胺对灰霉病菌孢子萌发及菌丝生长的综合抑制效果，但该方法仅能获得病原菌生长的浊度值，不能反映病原菌生长的具体动态特征。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种简便、快速、高效、准确的检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法。
[0007]本发明的一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法，包括以下步骤:
(1)用利马豆液体培养基或燕麦培养基稀释烯酰吗啉，配置各种质量浓度的药剂；
(2)将烟草黑胫病菌在利马豆固体培养基平板上培养4d，取菌落1/3处直径为5mm的菌丝块10块，放入盛有20mL10%V8培养液培养皿中，光照培养4d后菌丝表面形成大量的孢子囊；将形成孢子囊的黑胫病平板置于4°C冰箱低温处理30min，然后再置于室温2h，从溶液中收集游动孢子悬浮液，将其浓度调整为I X 104个/mL，贮存、待用；(3)8通道电动移液器将8种不同质量浓度的药剂每孔140 μ L加入到96孔微孔板中，并设置空白对照组；无菌条件下，在96孔微孔板中每孔加入I X IO4个/mL的游动孢子悬浮液IOyL;盖好96孔板板盖，将96孔微孔板置于监控培养箱(BioLog OminLog)中，28°C黑暗条件下培养72h，采用生长曲线监控软件(OminLog-PM)读取0_72h小时黑胫病菌生长曲线的数据；培养O和72h时，采用浊度测定软件(Microstation)测定590nm每孔黑胫病菌的OD值(处理O和72h的吸光度值分别记为ODtl和OD72)，按照公式(I)计算杀菌剂对黑胫病菌孢子萌发的抑制率，并计算药剂对菌株孢子萌发的EC5tl值。
【权利要求】
1.一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法，包括以下步骤: (1)用利马豆液体培养基或燕麦培养基稀释烯酰吗啉，配置各种质量浓度的药剂； (2)将烟草黑胫病菌在利马豆固体培养基平板上培养4d，取菌落1/3处直径为5mm的菌丝块10块，放入盛有20mL10%V8培养液培养皿中，光照培养4d后菌丝表面形成大量的孢子囊；将形成孢子囊的黑胫病平板置于4°C冰箱低温处理30min，然后再置于室温2h，从溶液中收集游动孢子悬浮液，将其浓度调整为I X IO4个/mL，贮存、待用； (3)8通道电动移 液器将8种不同质量浓度的药剂每孔140μ L加入到96孔微孔板中，并设置空白对照组；无菌条件下，在96孔微孔板中每孔加入I X IO4个/mL的游动孢子悬浮液10μ L ;盖好96孔板板盖,将96孔微孔板置于监控培养箱中，28°C黑暗条件下培养72h,采用生长曲线监控软件读取0-72h小时黑胫病菌生长曲线的数据；培养O和72h时，采用浊度测定软件测定590nm每孔黑胫病菌的OD值(处理O和72h的吸光度值分别记为ODtl和OD72),按照公式(I)计算杀菌剂对黑胫病菌孢子萌发的抑制率，并计算药剂对菌株孢子萌发的EC5tl值；
2.如权利要求1所述的一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法，其中第(3)步可为下述方法:在无菌条件下，在96孔微孔板中每孔加入I X IO4个/mL的游动孢子悬浮液10 μ L，将其置于监控培养箱(BioLog OminLog)中，于28°C黑暗条件下培养24h后，再分别加入140 μ L经利马豆培养基稀释过质量浓度为2、1、0.5,0.25,0.13,0.063,0.031mg/L的烯酰吗啉药剂，设置添加同体积无菌水为空白对照组；采用池度测定软件(Microstation)测定96孔微孔板590nm的OD值(处理Oh的吸光度值为ODtl),将微孔板继续置于监控培养箱(BioLog OminLog)中黑暗条件下培养,采用生长曲线监控软件(OminLog-PM)读取0_72h小时黑胫病菌生长曲线的数据；于72h后再次测定OD值(处理72h的吸光度值为OD72),按照公式(I)计算药剂对菌丝生长的抑制率，并计算药剂对菌株菌丝生长的EC5tl值。
3.如权利要求1或2所述的一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法，其中利马豆液体培养基的配置方法为:称取60g利马豆于800mL无菌水中煮沸Ih,过滤,滤液定容至1L，灭菌、待用；利马豆固体培养基的配置方法为:称取60g利马豆于800mL无菌水中煮沸lh，过滤，滤液中添加16g琼脂粉，煮沸定容至1L，灭菌、待用。
4.如权利要求3所述的一种检测烟草黑胫病菌对杀菌剂敏感性的方法，其中10%V8液体培养基的配置方法为:100mLV8营养液1500rpm离心5分钟，收集上清液，并加入.0.2gCaC03,加去离子水至1L, pH6.5~7.5,经灭菌后分装待用。
【文档编号】C12Q1/04GK103555811SQ201310580090
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】汪汉成, 王茂胜, 陈庆园, 李文红, 陆宁, 夏海乾 申请人:贵州省烟草科学研究院, 贵州省植物保护研究所