复合反胶束体系、制备方法及其在木质素过氧化物酶催化反应中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种反胶束体系，具体是涉及到复合反胶束体系、制备方法及其在木质素过氧化物酶催化反应中的应用，复合反胶束体系由质量浓度为4～30%的乳化剂和70～96%的非极性有机溶剂组成，所述乳化剂由质量浓度为2～15%鼠李糖脂、2～15%吐温-80和80～90%助表面活性剂组成，制备方法是将乳化剂加入到非极性有机溶剂中，混合，得到复合反胶束体系，本发明还提供复合反胶束体系在木质素过氧化物酶催化反应中的应用，本发明的复合反胶束体系有利于木质素过氧化物酶发挥催化性能，稳定性好，效率高。
【专利说明】复合反胶束体系、制备方法及其在木质素过氧化物酶催化反应中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种反胶束体系，具体是涉及到一种复合反胶束体系、制备方法及其在木质素过氧化物酶催化反应中的应用。
【背景技术】
[0002]反胶束体系是表面活性剂在非极性有机溶剂中超过其临界胶束浓度时自组装形成的纳米尺寸的聚集体，具有良好的热力学稳定性。有水的反胶束体系有一个外壳，由两亲分子的烃链组成的，疏水尾指向有机溶剂，极性头指向聚集体内部形成极性腔，纳米尺寸的水溶解在极性腔中形成“小水池”。反胶束体系极性内核中的水与常态水物理性质不同，它的黏度较高，但酸度和极性比常态水低。所以“水池”中的水可溶解某些原本不溶的物质。 此外，表面活性剂分子膜的存在可以避免酶与周围的有机溶剂接触，保护酶的活性部位，使其不因与有机溶剂接触而失活，从而提高酶的催化性能。反胶束体系作为酶反应的介质有很多优点，从而使得反胶束体系在酶催化反应中的应用也十分广泛，因此在反胶束体系中研究酶的催化反应即胶束酶学成为当今研究的热点。
[0003]目前为止对介质的研究经历了从水一有机溶剂一反胶束体系的过程。在微水有机溶剂单相体系中和在水/有机溶剂两相体系中，酶通常不能保持其良好的催化性能。由于反胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境，因此，在反胶束体系中大多数酶能够保持催化活性和稳定性。这为酶在反胶束体系中催化反应等领域的应用奠定了非常重要的理论基础。反胶束体系与水和非极性有机溶剂相比，作为一种反应媒介，具有接触面积大、组成灵活、热力学稳定等优点，这推动了反胶束体系的理论和应用研究的迅速发展。在反胶束体系中的酶学研究为介质工程带来了新的革命。正是由此，反胶束体系的构建方法和其作用于酶催化反应过程的作用机理与优势受到人们的普遍关注。
[0004]木质素是由苯丙烷结构单元组成的近似球状的复杂芳香族高聚体，其较难降解， 已成为地球上碳循环的限速步骤。木质素类物质的有效降解是环境中大量废弃木质素类生物质资源化利用的重要前提，反胶束体系中木质素过氧化物酶(lignin peroxidase, Lip) 活性的有效保持和高效的催化反应的实现为木质素的酶法降解提供了新的技术途径。反胶束体系使木质素类废弃物的资源化处理具有重要的意义。现有技术中，Wang等研究了反胶束体系中纤维素酶解特性研究，Chen等在反胶束体系中用不同的蛋白酶合成了二肽。随着研究的进行，在反胶束体系中进行酶催化反应不仅仅停留在理论方面，而是在应用上同样有广阔的前景。
[0005]然而目前对反胶束体系的研究多数是在单相表面活性剂体系中，主要是A0T、 CTAB、SDS等构建的单相反胶束体系中，在这样的体系中，位于反胶束体系界面的表面活性剂的带电头基与水池中的酶之间往往存在强的静电作用力，从而导致酶活力的降低或丧失。
[0006]山东大学硕士学位论文，《木质素过氧化物酶在反胶束体系中的催化性能及动力学研究》中指出，Tween80、TritonX-100、Brij30三种非离子表面活性剂的HLB值依次降低， 在非极性有机溶剂中的溶解度依次升高，同时指出，TweenSO油溶性很差不适合用来配制反胶束体系。木质素过氧化物酶在CTAB或Triton反胶束体系中并没有活性，只在AOT反胶束体系中有活性。同一表面活性剂在不同介质中对Lip活力的发挥有着截然不同的影响。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是，提供一种有利于木质素过氧化物酶发挥催化性能， 稳定性好，效率高的复合反胶束体系，并提供复合反胶束体系的制备方法和在木质素过氧化物酶催化反应中的应用。
[0008]本发明的技术方案为，复合反胶束体系由质量浓度为4~30%的乳化剂和70~ 96%的非极性有机溶剂组成，所述乳化剂由质量浓度为2-15%鼠李糖脂、2-15%吐温-80和 80-90%助表面活性剂组成。乳化剂中，鼠李糖脂和吐温-80的质量比优选为3:2。所述非极性有机溶剂优选为异辛烷、环己烷或正庚烷，所述助表面活性剂优选为C1-C6有机醇，最优为正己醇、正丁醇或正戊醇。
[0009]本发明还提供一种复合反胶束体系的制备方法，步骤是，优选室温条件下，将鼠李糖脂、吐温-80和助表面活性剂混合，混合均匀后得到乳化剂，然后将乳化剂加入到非极性有机溶剂中，混合，得到复合反胶束体系。所述混合操作优选为超声作用或者机械搅拌。
[0010]本发明还提供一种复合反胶束体系在木质素过氧化物酶催化反应中的应用。步骤为，将双氧水、木质素过氧化物酶液、底物溶液加入到复合反胶束体系中，得反应体系，充分混合。所述反应体系中，水/ (鼠李糖脂+吐温-80)的摩尔比为10~31:1，其中，水的质量等同于木质素过氧化物酶液和底物溶液的总质量。底物的浓度为lOmmol/L~150mmol/ L，木质素过氧化物酶液中酶的浓度为3~5mg/L，底物和酶液的体积比为1:1，双氧水浓度为 10mmol /I,~40mmol/L。
[0011]本发明的有益 效果是，本发明采用的是复合表面活性剂，所述复合表面活性剂为阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂的混合物。不同种类的表面活性剂或者表面活性剂与添加剂之间混合形成的体系在形状、结构、性质等方面，与单一的表面活性剂相比，往往变化很大，本发明采用鼠李糖脂和吐温-80组成复合表面活性剂，产生协同效应，从而起到提高活性和稳定性，方便使用及降低成本的良好作用，获得单一表面活性剂所没有的独特性质。木质素过氧化物酶在复合反胶束体系中的最大催化活性是其在水溶液中的3.5倍， 而其在鼠李糖脂构建的单一反胶束体系中，木质素过氧化物酶的最大催化活力是其在水溶液中的近2.8倍。证明本发明的复合反胶束体系为木质素过氧化物酶提供良好的催化环境，使木质素过氧化物酶表现出超活性。
[0012]在阴离子型表面活性剂构建的反胶束体系中添加非离子表面活性剂能改变界面膜的性质，通过改变水的溶解量和水的结构来改变反胶束体系的性质。复合表面活性剂的协同行为可以降低表面活性剂的总量，减少成本，降低对环境的影响。其次，鼠李糖脂作为一种阴离子性生物表面活性剂，其具有可降解性、低毒性、高效性和生态相容性等优势，必将为反胶束体系的构建和应用提供具有“环境可持续”意义的选择。非离子表面活性剂的毒性小于其他离子型表面活性剂，在溶液中比较稳定，不易受电解质和酸碱的影响，与其他类型表面活性剂的相容性好，应用比较广泛，其中吐温-80是典型的代表。[0013]本发明方法制备的复合反胶束体系在木质素过氧化物酶催化中的应用是本发明的重要创新，通过本发明复合反胶束体系的应用能使得复合反胶束体系在木质素过氧化物酶催化作用得到更高效地发挥。通过对复合反胶束体系的电导率特性分析，复合反胶束体系中含水量不同时，反胶束水核的尺寸大小不同，当其与酶分子的大小相匹配时酶的催化性能较好。鼠李糖脂和吐温-80的质量比为3:2时，IOg复合反胶束体系的増溶水量可达
0.45g。除此之外，本发明复合反胶束体系的制备方法简单，步骤少，所制得的复合反胶束体系増溶水量较高、稳定性好，将其作用于木质素过氧化物酶的催化可获得较高的酶活力， 操作过程简单、安全，费用较低，在促进环境中难以降解的有机物的资源化利用具有重要意义，同时为复合表面活性剂在复合反胶束体系中的应用提供了新途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为实施例1的复合反胶束体系的电导率随含水量的变化曲线图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
[0016]实施例1
复合反胶束体系由乳化剂3g和异辛烷7g组成，所述乳化剂中各组分的质量浓度为，鼠李糖脂8.6%、吐温-80 5.7%、正己醇85.7%。
[0017]制备方法是，室温条件下，将鼠李糖脂和吐温-80混合，加入到正己醇中，混合均匀后得到乳化剂，然后将乳化剂加入到异辛烷中，超声波震荡30min，使溶液中的表面活性剂完全溶解，得到均一透明的溶液即为复合反胶束体系。
[0018]测量最大增溶水量:
向复合反胶束体系中分别加入不·同质量的水，配成一系列含水量不同的复合反胶束体系溶液，将其磁力搅拌1000r/min，20min，混合均匀得到均一透明的溶液，即为一系列含水量不同的复合反胶束体系溶液。对上述一系列的复合反胶束体系溶液分别进行电导率特性分析，测得含水量(水/ (鼠李糖脂+吐温-80)的摩尔比)和电导率的变化曲线图。
[0019]实施例1的复合反胶束体系得到的复合反胶束体系溶液的电导率随含水量的变化曲线图如图1所示，当复合反胶束体系溶液的含水量为30.4时，复合反胶束体系溶液的电导率随含水量的变化曲线呈现最大值，由胶束渗滤原理可得，该复合反胶束体系的増溶水量达到最大，其值为0.45g。
[0020]实施例2
复合反胶束体系由乳化剂1.4g和异辛烷8.6g组成，所述乳化剂中各组分的质量浓度为，鼠李糖脂8.6%、吐温-80 5.7%、正己醇85.7%。
[0021]制备方法是，室温条件下，将鼠李糖脂和吐温-80混合，加入到正己醇中，混合均匀后得到乳化剂，然后将乳化剂加入到异辛烷中，超声波震荡30min，使溶液中的表面活性剂完全溶解，得到均一透明的溶液即为复合反胶束体系。
[0022]实施例3
将相同体积的3mg/l的木质素过氧化物酶液和10mmol/l的黎卢醇水溶液的混合液 131.6mg加入到实施例2制备得到的复合反胶束体系，使得复合反胶束的含水量WP28。取该复合反胶束溶液3ml置于3cm的玻璃皿中，40mmol/L的5微升双氧水加入到该玻璃皿中，得反应体系a,盖上盖子混匀，反应时间为3min。
[0023]将实施例2制备得到的反应体系a、实施例2中以水溶液替代复合反胶束体系得到的反应体系b分别置于紫外分光光度计(Shimadzu UV-2552，Japan)中，在25°C反应3min， 在310nm波长下测定吸光度的变化,反应体系a、反应体系b分别以其不加双氧水的反应体系作空白样。按照下述公式计算得到酶活回收率。
[0024]A=106*Vt* A A/ (V* e * A t) ( I )
AR= (Aa/Ab) *100%(II)
其中，A为酶活值，Vt为反应体系的总体积，A A为吸光度的变化值，V为酶液的体积 (ml), e为黎卢醇的吸光系数,3.6*104, A t为时间，Aa, Ab分别为木质素过氧化物酶在复合反胶束、水溶液中的酶活值，AR为酶活回收率。
[0025]测量、计算结果表明，测得酶活回收率为3.5，木质素过氧化物酶在复合反胶束体系中具有良好的催化性能，其表现出超活性。
[0026]将实施例2制备得到的反应体系a、实施例2中以鼠李糖脂反胶束体系替代复合反胶束体系得到的反应体系B分别置于紫外分光光度计(Shimadzu UV-2552, Japan)中，在 25V反应3min，在310nm波长下测定吸光度的变化，反应体系a、反应体系B分别以不加双氧水的反应体系作空白样。所述鼠李糖脂反胶束体系由乳化剂1.4g和异辛烷8.6g组成， 所述乳化剂中各组分的质量浓度为，鼠李糖脂8.6%、正己醇91.4%。按照公式I和II测得酶活回收率为2.86。由此可知，在复合反胶束溶液中木质素过氧化物酶的催化活性显著高于单相反胶束体系中木质素过氧化物酶的催化活性。
[0027]实施例4
复合反胶束体系由乳化剂2g和环己烷Sg组成，所述乳化剂中各组分的质量浓度为，鼠李糖脂15%、吐温-80 2%、正丁醇83%。
[0028]制备方法是，室温条件下，将鼠李糖脂和吐温-80混合，加入到正丁醇中，混合均匀后得到乳化剂，然后将乳化剂加入到环己烷中，超声波震荡30min，使溶液中的表面活性剂完全溶解，得到均一透明的溶液即为复合反胶束体系。
[0029]按照最大增溶水量的测量方法，测得上述复合反胶束体系的最大增溶水量为
0.30go
[0030]实施例5
将相同体积的5mg/l的木质素过氧化物酶液和100mmol/l的黎卢醇水溶液的混合液 285.7mg加入到实施例4制备得到的复合反胶束体系，使得复合反胶束的含水量Wtl=SO15取该复合反胶束溶液3ml置于3cm的玻璃皿中，lOmmol/L的5微升双氧水加入到该玻璃皿中，得反应体系a,盖上盖子混匀，反应时间为3min。
[0031]将实施例5制备得到的反应体系a、实施例5中以水溶液替代复合反胶束体系得到的反应体系b分别置于紫外分光光度计(Shimadzu UV-2552, Japan)中，在25°C反应3min， 在310nm波长下测定吸光度的变化，并以不加双氧水的反应体系作空白样。
[0032]测量、计算结果 表明，测得酶活回收率为3.3。
[0033]将实施例5制备得到的反应体系a、实施例5中以鼠李糖脂反胶束体系替代复合反胶束体系得到的反应体系B分别置于紫外分光光度计(Shimadzu UV-2552, Japan)中，在25°C反应3min，在310nm波长下测定吸光度的变化，反应体系a、反应体系B分别以其不加双氧水的反应体系作空白样。所述鼠李糖脂反胶束体系由乳化剂2g和环己烷Sg组成，所述乳化剂中各组分的质量浓为，鼠李糖脂15%、正丁醇85%。按照公式I和II测得酶活回收率为2.34。
【权利要求】
1.一种复合反胶束体系，其特征是，由质量浓度为4~30%的乳化剂和70~96%的非极性有机溶剂组成，所述乳化剂由质量浓度为2~15%鼠李糖脂、2~15%吐温-80和80~ 90%助表面活性剂组成。
2.如权利要求1所述的复合反胶束体系，其特征是，非极性有机溶剂为异辛烷、环己烷或正庚烷。
3.如权利要求1所述的复合反胶束体系，其特征是，所述助表面活性剂为C1-C6有机醇。
4.如权利要求1、2或3所述的复合反胶束体系，其特征是，所述助表面活性剂为正己醇、正丁醇或正戊醇。
5.一种复合反胶束体系的制备方法，其特征是，将乳化剂加入到非极性有机溶剂中，混合，得到复合反胶束体系。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述混合为超声震荡或者机械搅拌。
7.—种如权利要求1所述的复合反胶束体系在木质素过氧化物酶催化反应中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征是，步骤为，将双氧水、木质素过氧化物酶液、底物溶液加入到复合反胶束体系中，得反应体系，充分混合。
9.如权利要求8所述的应用，其特征是，反应体系中，水/(鼠李糖脂+吐温-80)的摩尔比为10~31:1。
【文档编号】C12N9/96GK103589710SQ201310579790
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】袁兴中, 马玉杰, 彭馨, 曾光明, 吴志斌, 陈晓红, 梁婕, 陈耀宁 申请人:湖南大学