专利名称：：一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法
技术领域：
：本发明属于农业生物
技术领域：
，具体涉及一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法。
背景技术：
：烟草黑胫病(tobaccoblackshank)是世界烟草生产中危害最严重的病害之一，特别是在温带、亚热带和热带发生较重，是我国烟草的主要病害。目前，在实验室、温室有采用平板菌丝块、发酵搅碎菌丝液、游动孢子液等制备烟草黑胫病菌接种体的方法。这几类方法制备的接种体一般不适用于大田人工接种。在田间烟草黑胫病菌接种体应用较多的是谷物培养接种体，主要供烟草种质资源抗性鉴定或药剂筛选时人工接种病原物用。这种谷物培养制备方法的培养周期较长，通常需要45~60天；且培养时容易污染杂菌，导致培养失败。此外，培养成本相对较高。因此，如何更为有效的制备烟草黑胫病菌接种体，就成为烟草育种、植保工作中亟待解决的技术问题。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种经济有效的烟草黑胫病菌接种体的制备方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。除非另有说明，本发明所釆用的百分数均为质量百分数。一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法，包括以下步骤1、从发病田块中釆集病株，经过分离、纯化、致病力筛选测定，获得强致病力病菌，菌种釆用菌丝块水浸法置于1(TC条件下恒温保存，备用；2、将烟草黑胫病菌菌丝块移到试管平板培养基上，在28'C下恒温培养5-6天，选择菌丝纯白色、在平板表面形成一层较致密菌丝层的培养物，用作液体培养菌种；所述的平板培养基配方为燕麦片30g，琼脂1720g，蒸馏水1000ml，pH自然；3、用解剖刀切取烟草黑胫病菌菌丝块置于液体培养基中，每100毫升培养液接种菌丝24块，150转/分钟、28。C恒温培养78天；所述的液体培养基配方为燕麦片30g,蒸馏水1000ml，pH自然；培养得到的液体菌液要求菌丝白色、菌液不浑浊，菌丝不成团，镜检已产生游动孢子囊，并发现液体中有大量带有鞭毛的游动孢子，每毫升孢子含量在105个以上；所述的菌丝块大小为2-4mmx2~4mm。所述的培养液占容器容积的30%~50%。4、按3%~5%的体积比将液体菌液置于盛有固体培养基三角瓶中，在28。C下恒温培养10-12天，所述的固体培养基配方为粒径1-3mm的粗米糠和粗麦麸以8:2的质量比混匀，加入45%的清水，充分混匀；培养得到的固体培养物要求菌丝长满整个固体基质，菌丝灰白色，菌丝低温诱导，镜检可产生游动孢子囊，液体中有大量带有鞭毛的游动孢子，每亳升孢子含量在105个以上；所述的固体培养基占容器容积的50%~80%。5、将合格的固体培养物破碎成0.5-lcmx0.5-lcm大小的菌丝块，再加入三分之一质量比的新鲜、干燥粗米糠、粗麦麸，米糠和麦麸按8:2的质量比混匀，搅碎、混匀，平铺，通风晾干2-3天，待水分降至35%~40%时，即为所需的烟草黑胫病菌接种体。本发明相对于现有技术，具有以下优点1、可缩短培养时间10-15天；2、培养获得的.接种体颗粒比通常用的谷粒小，颗粒大小为2~3毫米，接种体容易分散；3、接种体有效侵染数量大，具有扩大培养的潜力，污染杂菌少。具体实施例方式通过下面给出的实施例和应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明,但它们不是对本发明的限定。实施例l制备烟草黑胫病菌接种体，首先需要通过分离、培养、致病力测定获得强致病力病菌。通常可釆用菌丝块贴接法、游动孢子灌根法接种病菌，测定发病情况，发病严重的菌株致病力强一些，以保证接种的有效性、可比性。然后培养制备接种体，培养釆用平板、液体、固体3级培养的方式进行，再进行制备，本例采用游动孢子灌根法接种筛选获得的强致病力菌株98Pn022实施，具体如下①平板培养平板培养基配方为CA:燕麦片30g,琼脂1720g,蒸馏水1000ml，pH自然。将4块烟草黑胫病菌98Pn022的菌丝块移到试管平板培养基上，在28。C恒温培养56天，选择菌丝纯白色、在平板表面形成一层较致密菌丝层的培养物，用作液体培养菌种。②液体培养液体培养基配方为CA:燕麦片30g,蒸馏水1000ml，pH自然。用解剖刀切取薄薄的一层烟草黑胫病菌98Pn022的菌丝块，菌丝块大小约为4mmx4mm,移到盛有250毫升培养液的500毫升三角瓶中，每瓶接种菌丝68块，150转/分钟、28。C恒温培养78天。选择菌丝白色、菌液不浑浊，菌丝不成团，镜检已产生游动袍子囊，并发现液体中有大量带有鞭毛的游动孢子，每毫升孢子含量在105个.以上，作为固体培养的菌种。③固体培养固体培养基配方为l亳米筛不能通过的粗米糠、粗麦麸以8:2的质量比混匀，按质量45%的比例加自来水，充分混匀。用10毫升移液枪移取1520亳升液体菌液到盛有固体培养基(至400毫升刻度处)的500毫升三角瓶，28。C恒温培养1(K12天。选择菌丝长满整个固体基质，菌丝灰白色，菌丝低温诱导，镜检可产生游动孢子囊，并发现液体中有大量带有鞭毛的游动孢子(每毫升105个以上)，即为合格的固体培养物。④接种体的制备将封闭长满菌丝的固体培养物用25cm的镊子扳成0.5-lcmx0.5-lcm大小的菌丝块，再加入三分之一质量比的新鲜、干燥粗米糠、粗麦麸(8:2的质量比混勻)，搅碎、混匀，平铺，通风晾干23天，待水分降至35%~40%，即为所需的烟草黑胫病菌接种体，分装有孔塑料袋中，室温保存，备用。应用实施例l品种抗性评价1.1材料与方法l丄l材料供试接种病原为强致病力烟草疫霉98Pn022。供试品种为红花大金元、K326、云烟97、NC89。1.1.2方法1丄2.1供试病原接种体的制备烟草黑胫病菌接种体的制备强致病力烟草疫霉98Pn022菌株固体接种体按实施例l进行。U.2.2抗性测定品种的小区布置试验处理为4个处理，待测定的4个品种，每个品种为l个处理。每处理植烟20株，3次重复。小区随机排列。管理与种植同优质烤烟模式。试验用地约0.5亩。L1.2.3病菌人工接种移栽后的第四天在烟株根胫部周围株施烟草黑胫病菌固体接种体(本发明制备的接种体)3g，浇水后，培土。U.2.4病情调查在烟草黑胫病菌接种前一天，进行一次病情基数调查，接种后的第80天调查一次病情。调查各处理的全部植株，调査记载釆用YC/T39-1996"烟草病害分级及调查方法"中烟草根茎病害的行业标准。1.2结果与分析品种抗性测定结果见表1,以病情指数大于30为感病、20《病情指数<30为中度感病、10<病情指数<20为中度抗病、小于10为抗病进行评价，可以看出红花大金元中度感病，云烟97、K326、NC89抗病。表l待测抗性品种的测定结果品种病情指数抗性评价红花大金元27.5MS云烟978.3RK3266.7RNC897.5R应用实施例2田间小区筛选拮抗烟草黑胫病的生防菌2.1材料与方法2丄1材料供试拮抗菌为温室盆栽筛选的6个菌株GP1、GP3、GP8、GP13、、GP16、GP20。供试接种病原为强致病力烟草疫霉98Pn022。供试品种为红花大金元。2丄2方法2丄2.1供试菌株接种体的制备烟草黑胫病菌接种体的制备强致病力烟草疫霉98Pn022菌株固体接种体按实施例l进行。拮抗菌菌悬液的制备挑取活化23次的6个待测菌株各一环，分别接种于300mlNA液体培养基中，28°C、150r/m振荡培养72小时，用灭菌水配成1()6々cfu/ml的菌悬液。2丄2.2生防菌剂的小区处理试验处理为6个筛选菌株处理、甲霜灵锰锌药剂对照处理(CK*)、培养液处理(CK)，共8个处理。每处理植烟20株，3次重复。小区随机排列。管理与种植同优质烤烟模式。试验用地约0.5亩。2丄2.3生防菌剂的施用生防菌剂的施用釆用灌根的方法，于移栽后的第二天进行，每处理每株灌注0.25升。移栽后的第四天在烟株根胫部周围株施本发明接种体3g,浇水后，培土。2丄2.4病情调查在烟草黑胫病菌接种前一天，进行一次病情基数调查，接种后的第20天、第40天、第60天、第80天各调查一次病情。每次调查各处理的全部植株，调查记载釆用YC/T39-1996"烟草病害分级及调查方法"中烟草根茎病害的行业标准。2.2结果与分析拮抗菌的田间小区防治试验结果(表2)表明，温室筛选的6个菌株在大田中对黑胫病均具有一定的防治效果，其中GP13防治效果较显著，与对照的化学药剂甲霜灵锰锌效果接近，防效稳定在77.53%-93.33%。表2拮抗菌防治黑胫病的田间小区试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注CK+为甲霜灵锰锌药剂对照，表中的数字为三个重复处理的平均值。权利要求1、一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法，包括以下步骤:(1)从发病田块中采集病株，经过分离、纯化、致病力筛选测定，获得强致病力病菌，菌种采用菌丝块水浸法置于10℃条件下恒温保存，备用；(2)将烟草黑胫病菌菌丝块移到试管平板培养基上，在28℃下恒温培养5～6天，选择菌丝纯白色、在平板表面形成一层较致密菌丝层的培养物，用作液体培养菌种；所述的平板培养基配方为:燕麦片30g，琼脂17～20g，蒸馏水1000ml，pH自然；(3)用解剖刀切取烟草黑胫病菌菌丝块置于液体培养基中，每100毫升培养液接种菌丝2～4块，150转/分钟、28℃恒温培养7～8天；所述的液体培养基配方为:燕麦片30g，蒸馏水1000ml，pH自然；培养得到的液体菌液要求:菌丝白色、菌液不浑浊，菌丝不成团，镜检已产生游动孢子囊，并发现液体中有大量带有鞭毛的游动孢子，每毫升孢子含量在105个以上；(4)按3％～5％的体积比将液体菌液置于盛有固体培养基三角瓶中，在28℃下恒温培养10～12天，所述的固体培养基配方为:粒径1～3mm的粗米糠和粗麦麸以8:2的质量比混匀，加入45％的清水，充分混匀；培养得到的固体培养物要求:菌丝长满整个固体基质，菌丝灰白色，菌丝低温诱导，镜检可产生游动孢子囊，液体中有大量带有鞭毛的游动孢子，每毫升孢子含量在105个以上；(5)将合格的固体培养物破碎成0.5～1cm×0.5～1cm大小的菌丝块，再加入三分之一质量比的新鲜、干燥粗米糠、粗麦麸；米糠和麦麸按8:2的质量比混匀，搅碎、混匀，平铺，通风晾干2～3天，待水分降至35％～40％时，即为所需的烟草黑胫病菌接种体。2、根据权力要求l所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的菌丝块大小为2~4mmx2—4mm。3、根据权力要求l所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的培养液占容器容积的30%~50%。4、根据权力要求l所述的制备方法，其特征在于步骤(4)所述的所述的固体培养基占容器容积的50%~80%。全文摘要本发明公开了一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法。烟草黑胫病菌菌丝块在28℃下恒温培养5～6天，培养物置于液体培养基中，150转/分钟、28℃恒温培养7～8天，按3％～5％的体积比将液体菌液置于固体培养基中，在28℃下恒温培养10～12天，合格的固体培养物破碎成菌丝块，再与粗米糠、粗麦麸混匀，平铺，通风晾干，待水分降至35％～40％时，即为所需的烟草黑胫病菌接种体。运用该技术可缩短培养时间10～15天，培养获得的接种体容易分散，且有效侵染数量大，具有扩大培养的潜力，污染杂菌少。本发明操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景。文档编号C12R1/645GK101381685SQ200810233499公开日2009年3月11日申请日期2008年10月28日优先权日2008年10月28日发明者卢秀萍,宋春满,方敦煌,李永平申请人:云南省烟草科学研究所