一种抗烟草黑胫病Ph基因连锁的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记及 其应用。
【背景技术】
[0002] 红花大金元是从美国引进的大金元品种变异株选育出来的优良烤烟品种，因其花 色深红而得名。红花大金元烟叶具有独特的香气特征、优良的质量风格，一直是国内最具有 特色的优质烤烟品种之一，并为卷烟工业企业所青睐。但由于该品种对黑腔病 (化^ophthoranicotianae)抗性较差，严重地限制了其生产规模。因此，改良红花大金元黑 腔病抗性育种具有重要的现实意义。
[0003] 烟草黑腔病的抗性改良自然设及到烟草黑腔病的抗性育种。烟草黑腔病抗性育种 研究始于美国，1922年Tisdale在佛罗里达州发现大古己和小古己对黑腔病有抗性，通过杂 交与选择，1931年育成一些高抗黑腔病的雪茄包皮烟品系，其中Florida 301抗性最好，也 是各种类型中抗性最好的一个。同年育成抗黑腔病品种Rgnl943年育成第一个抗黑腔病的 烤烟品种化ford,进而育成DB10UDB102等一系列抗黑腔病的烤烟品种。此外Johnson E S 等（Jonhson E S, Wolff Μ F, Wernsman E A,et al. Origin of the black shank resistance gene,Ph in tobacco cultivar Coker 371 Gold. Plant Disease， 2002， 86(10) :1080-1084)首次报道了高抗烟草黑腔病0号生理小种的研究，利用RAPD分析结果 表明来自野生烟草N.plumbaginifolia和N.longiflora的黑腔病抗性基因是等位基因，并 用BSA法找到了与烤烟品种Coker 371-Gold中抗黑腔病化基因连锁的RAPD标记。发明人 也曾开发了一种用于抗黑腔病陆基因辅助选择的分子标记TM29和TM50,分别位于化基因两 侦U，与之紧密连锁，分子标记TM29与化基因的遗传距离为0.091cM，分子标记TM50与化基因 的遗传距离为0.148cm。但还远远不能满足精确定向改良优质烟草品种黑腔病抗性的需求， 因此深入开发研究是非常必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的在于提供一种抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记;第二目的 在于提供所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的应用;第Ξ目的在于提供所述的抗 烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的应用所得到的烟草品种、及其种子和无性繁殖体;第 四目的在于提供所述的所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的表达盒;第五目的在 于提供所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的表达盒辅助选择在杂交1代、回交2代 及其后续回交、自交改良系(群体）中的应用；第六目的在于提供所述的抗烟草黑腔病Ph基 因连锁的分子标记的转基因细胞系;第屯目的在于提供所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的 分子标记的转基因细胞系辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系(群体） 中的应用；第八目的在于提供所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的重组菌;第九 目的在于提供所述的抗烟草黑腔病Ph基因连锁的分子标记的重组菌辅助选择在杂交1代、 回交2代及其后续回交、自交改良系(群体)中的应用。
[000引本发明的第一目的是运样实现的，所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的 编号为Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617,其扩增产物核巧酸序列分别为SEQ ID No.l (196bp)、沈Q ID No.2(490bp)、沈Q ID No.3(294bp)和沈Q ID No.4(298bp)所示。
[0006] 本发明的第二目的是运样实现的，所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记辅 助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系(群体)中的应用。
[0007] 所述的抗烟草黑腔病Ph基因连锁的分子标记的应用为所述的抗烟草黑腔病Ph基 因连锁的分子标记在黑腔病抗性改良中的应用，包括W下具体步骤： (1) 采用所述分子标记的引物对改良烟草品种的基因组DNA分别进行PCR扩增； (2) 对扩增结果进行凝胶电泳检测； (3) 从检测结果中筛选扩增出同时含有如SEQ ID No. 1~4所示扩增产物核巧酸序列片 段的材料。
[0008] 本发明的第Ξ目的是运样实现的，所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的 应用所得到的烟草品种、及其种子和无性繁殖体。
[0009] 本发明的第四目的是运样实现的，所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的 表达盒。
[0010] 本发明的第五目的是运样实现的，所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的 表达盒辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系(群体)中的应用。
[0011] 本发明的第六目的是运样实现的，所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的 转基因细胞系。
[0012] 本发明的第屯目的是运样实现的，所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的 转基因细胞系辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系(群体)中的应用。
[0013] 本发明的第八目的是运样实现的，所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的 重组菌。
[0014] 本发明的第九目的是运样实现的，所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的 重组菌辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系(群体)中的应用。
[0015] 本发明W优良感病的烤烟品种红花大金元为轮回亲本罕，W具有野生烟草染色体 导入片段的抗病烟草育种材料RBST为非轮回亲本巧勾建Fi和回交、自交群体，通过对6世代 群体的表型鉴定，对抗黑腔病化基因进行遗传规律分析。WBCiFi群体为作图群体，利用BSA 法和基于分子标记的染色体步移技术，实现曲基因所在的野生烟草染色体片段的精细定 位，并获得紧密连锁标记，不仅为抗黑腔病化基因的精细定位和基因克隆奠定基础，同时也 为利用分子标记辅助选择(MAS)改良已有优良品种的抗性提供理论依据。
[0016] 本发明提供了与抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记，并提供了其在改良已有优 良品种的抗性上的应用，为抗黑腔病Ph基因的精细定位和基因克隆奠定基础，可W在烟草 抗性改良候选材料的杂交、回交及其后续世代对其进行抗性的筛选，具有便捷、准确、高效、 且呈共显性的优点，为利用分子标记辅助选择(MAS)改良烟草品种抗性提供便捷、实用、科 学、高效的途径。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明4个分子标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617对轮回亲本材料红花 大金元、非轮回亲本材料RBSTW及BCsFi和BC3F2世代入选单株的检测结果； 其中：左侧为8株入选的BCsFi单株及轮回亲本材料红花大金元、非轮回亲本材料RBST、 Fi共11份样品的基因型；右侧为5株入选BC3F2单株及轮回亲本材料红花大金元、非轮回亲本 材料RBST、Fi共8份样品的基因型；图中最右边泳道为Marker,与之相邻的3个泳道分别为： (从左到右)轮回亲本材料红花大金元、非轮回亲本材料RBST、Fi。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不W任何方式对本发明加 W 限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0019]本发明所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的编号为Scf_30K、TM62、 ST141和InDel0617，其扩增产物核巧酸序列分别为SEQIDNo.l(19化p)、SEQIDNo.2 (490bp)、沈Q ID No.3(294bp)和沈Q ID No.4(298bp)所示。
[0020] 所述的分子标记所对应的4个位点的引物序列分别为： Scf_30K序列为Scf_30KF: 5 ' -GAGAAGCCCATCACCTTTTG-3 '， Scf_30KR:5 '-TTCGAAATAAAGGCTCCCTCT-3 '； TM62序列为TM62F:5'-AG ACGGGGC TAAATTTGACA-3'， T M62R:5'-AGCGGAAGAGTT GAGGA CA A-3'； ST141 序列为ST141F:5'-CCATTCTAGCAAAGCCCATAA-3'， ST141R:5 '-CAGA GGCAACAATGCATACG-3 '； InDel0617序列为InDel0617F:5'- TGGCTTTGCGGTCCTATTAC-3'， InDel0617R:5'- GCTCTGCAGATGCAAAGGTT-3'。
[0021] 所述的含有化基因的烟草育种材料为抗黑腔病菌0号生理小种。
[0022] 本发明所述的抗烟草黑腔病Ph基因连锁的分子标记的应用为所述的抗烟草黑腔 病化基因连锁的分子标记辅助选择在杂交1代、回交2代及其后续回交、自交改良系(群体） 中的应用。
[0023] 本发明所述的抗烟草黑腔病Ph基因连锁的分子标记的应用为所述的抗烟草黑腔 病化基因连锁的分子标记在黑腔病抗性改良中的应用，包括W下具体步骤： (1) 采用所述分子标记的引物对改良烟草品种的基因组DNA分别进行PCR扩增； (2) 对扩增结果进行凝胶电泳检测； (3) 从检测结果中筛选扩增出同时含有如SEQ ID No. 1~4所示扩增产物核巧酸序列片 段的材料。
[0024] 所述的改良烟草品种的轮回亲本罕为红花大金元，非轮回亲本巧祁BST。
[00