玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体设及一种玉米发芽势基因 ZmGLP的功能分子标记 及其在育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 在玉米生产投入中，种子是最基本、最有效的投入，也是最特殊的生产资料，直接 影响着生产者、经营者和使用者的经济利益。在诸多衡量种子质量的指标中，发芽率是最直 接有效的评价标准，对于种子收购、储藏、调运等有重要意义，同时也是田间确定播种量的 依据。在我国的农业生产中几乎每年都有因种子发芽率低而导致玉米减产的案例，近些年 来，一些大型跨国种子企业如先锋、先正达等先后进入中国市场，除具有品牌优势外，其生 产的玉米杂交种子同时还具有发芽率高、能够实现单粒播种的质量优势，运是其迅速占据 国内市场的一个主要原因。因此，如何提高种子发芽率、培育适宜单粒点播的玉米新品种是 增强我国玉米种业参与国际和国内竞争所亟待解决的问题，对保证我国粮食安全具有重要 意义。
[0003] 尽管种子发芽率是环境和遗传因素共同作用的结果，但其本身的遗传特性是造成 不同品种间发芽率差异的主要原因。种子萌发能力的强弱是决定发芽率的关键因素，因此， 阐明玉米种子萌发相关基因与发芽率之间的关系、发掘影响玉米萌发特性的优良等位基 因，是选育高发芽率玉米新品种、确保种子质量的有效途径。大量的育种和生产实践证明不 同玉米自交系的发芽率存在广泛的遗传变异，因此，可W利用现有种质资源发掘玉米发芽 率相关的优良等位基因，进而通过分子标记辅助选择的方法选育发芽率高的优良自交系和 杂交种，对提高我国玉米种子质量具有重要意义。
[0004] 种子萌发特性是决定种子发芽率的一个最基本指标，许多学者对种子萌发相关基 因进行了大量研究，但运些研究主要集中在麦类和拟南芥等植物中。如Dunwell等在小麦萌 发早期的胚中发现了一种对热异常稳定的萌发素蛋白，该蛋白包含cupin蛋白的保守结构 域，同时与萌发素蛋白相似的类萌发素蛋白也具有cupin蛋白的保守结构域。而cupin蛋白 广泛存在于生物体中，它由一类结构相似、功能各异的蛋白组成超蛋白家族，cupin超蛋白 家族具有保守的桶状折叠特征。在小麦、大麦和水稻的萌发过程中，萌发素蛋白具有草酸氧 化酶活性，能够催化依赖儘离子的氧化脱簇反应，在植物的抗病性反应中起作用;在苔薛和 高等植物中，天然萌发素和特定类型的类萌发素具有超氧化物歧化酶的活性，能够清除生 长发育过程产生的活性氧自由基，在植物的抗胁迫反应中有重要作用;在拟南芥种子萌发 过程中，信号转导相关G蛋白α亚基的互作因子是具cupin结构域的AtPirinl蛋白；Lapik等 利用插入突变和体外实验证实了 cupin蛋白对拟南芥种子萌发和幼苗发育的调控作用。可 见，具有cupin结构域的基因在多种植物的种子萌发过程中起到重要作用。
[000引玉米种子发芽率是一个复杂的数量性状，在自然群体中存在广泛的遗传变异，且 玉米基因组的核巧酸多态性非常丰富，为利用关联分析方法解析种子发芽率相关性状奠定 了基础。与连锁分析相比，关联分析不但能大大缩短研究年限，而且能同时检测同一基因座 位的多个等位基因，作图精度可w达到单基因水平，更有可能检测到引起表型变异的真正 核巧酸位点。因此，利用候选基因关联分析方法挖掘基因内对目标性状有正向贡献的等位 基因，在植物的多个重要农艺性状的研究中得到了广泛应用，并在实际生产中得到了验证， 如玉米类胡萝h素合成途径关键酶编码基因的关联分析和功能标记应用（Hajes et al， 2008;化η et al. 2008;Fu et al. 2010)，已展现了候选基因关联分析方法研究数量性状 的美好前景。
【发明内容】
[0006]针对上述问题，本发明根据种子萌发过程中鉴定的差异表达蛋白质，克隆了该蛋 白质的编码基因，通过候选基因关联分析发掘基因内的有利等位变异，并开发出了相应的 功能分子标记，为通过分子标记辅助选择的方法选育发芽率高的优良自交系和杂交种提供 技术支撑。
[0007 ]为解决上述问题，本发明通过W下技术方案实现： 本发明W我国农业生产上大面积使用的农大108、郑单958、先玉335、豫玉22、竣单20和 竣单18等玉米杂交种及其相应的亲本为基础材料，利用蛋白质双向电泳技术研究了不同杂 交种及其相应亲本种子萌发过程中的蛋白质组学差异，在多个杂交种及其对应亲本萌发过 程中均发现一个差异表达的蛋白，质谱分析结果表明该蛋白具有cupin蛋白的保守结构域。 在此基础上，克隆该候选基因，并命名为ZmGLP，其核巧酸序列如序列1所示。通过候选基因 关联分析方法证明该基因与玉米种子发芽势显著关联，并开发了PCR功能分子标记，对 ZmGLP基因在生产中的应用提供了技术支撑。利用该功能分子标记辅助选择结合常规育种 实现有利等位基因的定向转移，提高现有自交系的发芽率并创制高发芽率的新种质，组配 出发芽率高的玉米新品种，有助于解决部分玉米杂交种及自交系种子发芽率低的问题。
[000引上述玉米发芽势基因 ZmGLP的功能分子标记的PCR引物序列如下： IDF: TATTCCCGAACGGGTCCC， IDR: CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA； 其内参引物的核巧酸序列为： CF: GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT， CR: CGTTGAAGGCACGGGTAAGCo
[0009] 上述玉米发芽势基因 ZmGLP的功能分子标记检测方法，包括W下步骤： (1)配制15y L反应体系，包括： DNA模板 lOng/yL 3.0 yL dNTP 2.5mmol/L 1.2 μL 10XPCR Buffer 1.5 μL IDF 10叫lol/L 0.3 μL IDR 10叫lol/L 0.3 μL CF lOymol/L 0.3 μL CR lOymol/L 0.3 μL Taq DNA polymerase 2.抓/μL 0.3 μL dd出0 7.8 化； (2)进行PCR扩增程序： TD 65 ~56°C; 1 个循环 95°C S.Omin; 10 个循环 95°C1.0min、65°C 退火 1.0min、72°C 延伸 1.5min; 25个循环 95°C变性 1.0min、56°C退火 1.0min、72°C延伸 1.5 min; Delay 72°C lO.Omin； Soak 4°C; 其它步骤同常规方法。
[0010] 本发明具有W下积极有益的技术效果： (1)本发明得到的是基于功能基因内开发的引起表型变异的功能标记，是建立在关联 群体中等位基因的功能性基序中单核巧酸多态性位点基础上的一类新型显性分子标记，它 不依赖于分子遗传作图，利用该功能标记可大大提高分子标记辅助选择的效率。
[0011] (2)玉米自然群体中不同自交系的发芽率及萌发特性具有广泛的遗传变异，因此 本发明通过候选基因关联分析发掘的ZmGLP基因内影响种子萌发特性的优异等位基因位点 及其核屯、序列，开发的功能分子标记，可直接用于生产实践。
【附图说明】
[0012] 图1. ZmGLP基因结构及核巧酸多态性信息图； 其中，TSS表示转录起始位点，其余黑色方框表示外显子，SP表示信号肤区域，3'端的Ξ 角表示化lyA尾己； 图2. ZmGLP基因的信号肤预测图谱； 图3. ZmGLP基因的跨膜结构域预测图谱； 图4. ZmGLP基因化pin结构域内的二级结构变异图谱之一； 其中，方框标出的为InDel9引起的蛋白质二级结构变异区； 图5. ZmGLP基因化pin结构域内的二级结构变异图谱之二； 其中，方框标出的为InDel9引起的蛋白质二级结构变异区； 图6. ZmGLP基因的LD图； 图7. InDel9的PCR标记图； 其中，100-250bp之间的带表示18个碱基插入的有利等位变异，500bp附近的带表示内 参对照片段； 图8. InDel9在大当草中的核巧酸状态图； 其中，100-250bp之间的带表示18个碱基插入的有利等位变异，500bp附近的带表示内 参对照片段。
【具体实施方式】
[0013] W下是对本发明的【具体实施方式】进一步的详细说明。下述实施中所设及的方法， 如无特别说明均为常规方法，所设及的原料无特别说明，则均为市售原料。
[0014] 实施例1:玉米种子发芽势基因 ZmGLP功能分子标记的开发 (1)玉米ZmGLP基因序列结构分析 发明人在前期对农大108、郑单958、先玉335、豫玉22、竣单20和竣单18等玉米杂交种及 其相应的亲本种子萌发过程中的差异表达蛋白质进行分析研究的基础之上，获得了影响种 子萌发特性的gi 1195606798蛋白质，提取ZmGLP基因的参考序列，并设计了多对扩增和测序 引物对40份玉米自交系的ZmGLP基因进行扩增，确定用包含5 ' UTR、外显子、内含子和3 ' UTR 在内的两对引物（cupinF2: CGTAGCACCAGAAAGAAATGTA/ cupinRl: CACAGGTAGGCGGTAGCAGC， C叫inF6 :GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT/ cupinR7 :ACAAACGGTCACTGCGGGAC)对其它自交系的 ZmGLP基因序列进行扩增和测序。
[001引利用在线软件预测了该基因的启动子区（Promoter 0.98 score http:// molbiol-tools. ca/Promoters. htm http: //132.248.32.45/cgi-bin/ribex. cgi)，用引物 P-6F: TGCTATGCGGAGGGGTCTA/ P-6R:AAGAGAAGGGCAAA