GGCAAA对该区域进行扩增测序。对40 份自交系ZmGLP基因序列进行比对分析后得到该基因的结构(见图1)。
[0016] Si即alP 4.1 软件化ttp: //www. cbs.化u.dk/services/SignalP/)的预测结果表 明1-24个氨基酸是ZmGLP基因的信号肤区（见图2)，该区域内的7-22个氨基酸是潜在的跨膜 结构域化ttp: //www. sbc. SU. se/~miklos/DAS/tmdas. cgi，见图3)。蛋白质结构域分析结 果表明，自然群体的ZmGLP基因都存在一个典型的Cupin结构域（329~478个氨基酸位置， http://sma;rt. embl-heidelberg.de/)，但该结构域中由于 Indel9 (TTCCCGAACGGGTCCCTG/------------------)的存在而产生较大差异(见图4、5)，可能改变 了Cupin蛋白的桶状折叠化ttp: //swissmodel. expasy. org/)从而影响了不同自交系种子 的萌发。
[0017] 图2中具体数据如下： # Measure Position Value Cutoff signal peptide max. C 25 0.761 max. Y 25 0.850 max. S 16 0.983 mean S 1-24 0.948 D 1-24 0.903 0.450 YES Name=Sequence SP='YES' Cleavage site between pos. 24 and 25: CSA-AA D= 0.903 D-cutoff=0.450 化tworks=SignalP-noTM。
[001引 （2)ZmGLP基因序列的多态性分析 WB73为参考序列（http: //www .maizegdb.org)，通过在线序列比对（http:// WWW. ebi . ac . uk/Tools/msa/muscle/)和BioEdit软件（WWW .mbio .ncsu. edu/BioEdit/ bioedit)中的手工调整，在131份自交系中共检测到112个多态性位点（TASSK^^件包中的 sites功能提取概率〉^)的多态性位点），其中5'和3'非翻译区各有Ξ个indels(插入缺失标 记），编码区共51个多态性位点。编码区中有18个SNPs(单核巧酸多态性)和4个indels引起 氨基酸变异的非同义突变(见表1)，其中SNP6、7、8位于一个LD block，SNP9、10位于另一个 LD blocknSNPl位于信号肤的跨膜域且改变了氨基酸的化学性质（亲水的碱性精氨酸变为 疏水的亮氨酸），5肥13、14、15和111(1619位于保守的0啡111结构域，且111(1619改变了(：啡111结 构域中C螺旋，对ZmGLP基因的功能有重大影响。连锁不平衡化D)分析表明，ZmGLP的衰退很 快(见图6)，可W通过关联分析鉴定ZmGLP基因内的功能标记。
[0019] 在上述分析研究结果的基础之上，开发了5'UTR和3'UTR及信号肤内的SNPl和 化pin结构域中的Indel9的PCR标记，即为本发明玉米发芽势基因 ZmGLP的功能分子标记，其 扩增引物序列为， IDF: TATTCCCGAACGGGTCCC, IDR: CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA； 其内参引物的核巧酸序列为： CF: GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT， CR: CGTTGAAGGCACGGGTAAGCo
[0020] 表1 ZmGLP基因内的非同义突变
[0021 ] (3)表型分析 对自然群体巧08份)的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数进行了两年重复试验，每年 试验设置Ξ个重复，田间采取单行区完全随机区组试验。性状的具体测定方法如下： ① 每份材料分3个重复，每个重复100粒； ② 播种前头一天整地诱水保证±壤湿润，行长4米，行宽0.5米； ③ 开沟撒播； ④ 在出苗后第Ξ天开始记录出苗数(6.20号播种，6.25号出苗，6.27号开始调查），W后 每天记录一次出苗数(6.27、6.28、6.29、6.30、7.1、7.2、7.3天）； ⑤7月4号每行收获整齐一致的10株幼苗，用水冲洗干净，在自然条件下惊晒1周后称 重。性状参数的具体计算方法是： 发芽率=总出苗数/种子数； 发芽指数（germination index, GI)=Xl(Gt/Dt)， 化表示发芽日数，Gt是与化相对应的每天发芽种子数； 活力指数(vigor index，VI)=GI XS，S表示收获后幼苗单株的平均干重(g); 发芽势(germination vigo;r)=发芽过程中日发芽最高峰的种子数/供测样品种子数X !00%〇
[0022] (4)关联及进化分析 方差分析结果表明，基因型与环境间互作不显著，遗传因素是种子萌发相关性状表型 差异的主要原因（见表2)。
[0023] 表2关联群体种子萌发相关性状的方差分析
关联分析结果表明，运些核巧酸多态性位点中仅有InDel9与种子发芽势显著关联，其 它多态性位点与表型性状关联不显著。关联分析和最优显性无偏估计（Best Linear Unbiased Predictor BLUP)结果表明，InDel9分别能够解释4.99%和4.43%的种子发芽势表 型变异(表3)。
[0024] 表3 InDel9在130份自交系中的关联分析结果
a仅列出了显著关联位点； blnDel9的等位变异，加粗表示有利等位变异； 表示发芽率；GI表示发育指数；VI表示活力指数；GV表示发芽势； dp-value是通过tassel软件的混合线性模型整合了群体结构和亲缘关系得到的. BLUP是两年数据整合后得到的结果； 6p-value是利用BLUP数据通过AN0VA分析得到的结果； fR2值是利用BLUP数据通过AN0VA分析得到的标记对表型的贡献率。
[0025] 进一步利用527份自交系组成的关联群体进行分析，其结果验证了 InDel9的功能， 可解释4.43%的种子发芽势表型变异(表4)。
[0026] 表4 InDel9在527份自交系中的关联分析结果
a仅列出了显著关联位点； blnDel9的等位变异，加粗表示有利等位变异； 表示发芽率；GI表示发育指数；VI表示活力指数；GV表示发芽势； dp-value是通过tassel软件的混合线性模型整合了群体结构和亲缘关系得到的. BLUP是两年数据整合后得到的结果； 6p-value是利用BLUP数据通过AN0VA分析得到的结果； fR2值是利用BLUP数据通过AN0VA分析得到的标记对表型的贡献率。
[0027] 基于简单PCR扩增得到的功能标记InDel9可直接用于分子标记辅助育种中（见图 7) JnDel9的有利等位变异定义为对种子发芽势有促进作用的变异，因此，18个碱基的插入 是有利等位变异。InDel9在41份大当草中的变异分析表明18个碱基的缺失导致ZmGLP发生 功能丧失突变(见图8)，导致发芽势降低，该突变发生在玉米改良而非驯化过程中。
【主权项】
1. 一种玉米发芽势基因 ZmGLP的功能分子标记，其PCR引物序列为 IDF: TATTCCCGAACGGGTCCC， IDR: CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA； 其内参引物序列为： CF: GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT, CR: CGTTGAAGGCACGGGTAAGC〇2. 权利要求1所述功能分子标记在玉米育种中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，包括以下步骤： (1) 配制15tiL反应体系，包括： DNA模板 lOng/yL 3.0 pL dNTP 2.5mmol/L 1.2 pL 10XPCR Buffer 1.5 pL IDF 10pmol/L 0.3 pL IDR 10pmol/L 0.3 pL CF 10pmol/L 0.3 pL CR 10pmol/L 0.3 pL Taq DNA polymerase 2.5U/yL 0.3 pL ddH2〇 7.8 pL； (2) 进行PCR扩增程序： TD 65 ~56°G; 1 个循环 95°C 3.0min; 10 个循环 95°C1.0min、65°C 退火 1.0min、72°C 延伸 1.5min; 25个循环 95°C变性 1.0min、56°C退火 1.0min、72°C延伸 1.5 min; Delay 72〇C lO.Omin； Soak 4°C 〇
【专利摘要】本发明公开了一种玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记，其PCR引物序列为IDF:？TATTCCCGAACGGGTCCC，IDR:？CGAGGTGGTGAAGCCGAAGAA；其内参引物序列为CF:？GGGGAAGCGAAGGTTGGGTAT，CR:？CGTTGAAGGCACGGGTAAGC。本发明玉米发芽势基因ZmGLP的功能分子标记不依赖于分子遗传作图，利用该功能标记可大大提高分子标记辅助选择的效率，并可直接应用于实践，为通过分子标记辅助选择的方法选育发芽率高的优良自交系或杂交种提供技术支撑。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105506147
【申请号】CN201610050403
【发明人】付志远, 汤继华, 丁冬, 李卫华, 李浩川, 薛亚东, 郭占勇
【申请人】河南农业大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月26日