一种检测藤壶幼虫早期附着程度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其设及在主要的海洋污损真核生物中对污损早期藤 壶幼虫附着的测定。
【背景技术】
[0002] 海洋污损生物又称海洋附着生物，是生长在船底、下水管道、石油平台、渔业的网 具及一切海中人为设施表面的有害生物。其中藤壶是最主要的海洋污损之一，藤壶 (Barnacle)又称为"马牙"或"阿彻仔"，属于节肢动物口（Arthropoda)、甲壳纲 (Crustacea)、围胸目（Thoracica)、蔓足类动物，目前发现的藤壶共有8科约541种，其中我 国约有110种。
[0003] 藤壶W其特殊的形态结构、生活史和种群生态成为最主要的海洋污损之一，主要 生活在潮间带及朝下带，附着栖息在海水中固定或浮动的硬物上，若附着在网箱上，不仅堵 塞网箱网衣，易造成养殖的环境变差，而且增大网箱衣阻力，易发生大潮讯期鱼体擦伤;若 附着在船底，增加船舶阻力，使航速降低;若附着在浮标上，能降低浮力。而目前有效果的防 污涂料会对海洋生态系统造成一定得影响，因此，针对藤壶可W试从它生长发育阶段的幼 虫附着期进行有目标的防除。而想要在藤壶早期附着时进行测试其附着率，分子标记方法 成为首选的技术手段，避开生物形态结构差异的干扰，直接通过检测生物体内大分子包含 的稳定遗传信息，定量描述、分析附着情况，提高了早期鉴定主要海洋污损生物物种的准确 度和效率。
[0004] 藤壶的附着测定至少在如下几个方面非常重要：（1)快速比较一批防污涂层在海 洋污损早期（肉眼可见藤壶生长之前)抑制藤壶幼虫附着能力的差异；（2)比较某个涂层在 室内藤壶纯培养体系中幼虫附着率与实际海水中幼虫附着率的差异。（3)优质涂层抑制海 洋污损的机制研究:有时需要测定在某个特定的涂层表面藤壶的附着生长被抑制是由于幼 虫附着被抑制还是附着后生长被抑制。
[0005] 中国专利(CN101654704A)报道了一组引物用来区分不同藤壶的亚种分类，可W区 分白脊藤壶和纹藤壶。本专利设及的引物可W用来测定更多藤壶亚种的幼虫附着。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种在海洋污损中对污损早期藤壶幼虫附着的测定。测定 的特异性是由藤壶特异性引物来保障的。该特异性引物时基于藤壶的18S rDNA设计的，其 序列为AmpRl:5'-ATG CTT TCG CAG TAG TTC GTTG-3'。它与核糖体基因18S rDNA的通用引 物巧66(5'-GGC ATC ACA GAC CTG TTA TTG C-3'）一起使用可W确保藤壶基因扩增的特异 性。扩增结果可W通过qPCR或一般PCR结束后的凝胶扫描来实现定量测定。
[0007] 本发明是通过W下技术方案来实现的：
[000引一种基于分子标记技术，在主要海洋污损真核生物中检测藤壶幼虫附着程度的方 法，该方法包括W下步骤：
[0009] (1)藤壶特异性引物的设计；
[0010] 间污损早期（肉眼可见附着藤壶之前)海水污损样本的采集和基因组提取；
[0011] 间利用藤壶特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来测定藤壶幼虫的附着。
[0012] 而且，藤壶特异性引物设计方法如下：比较主要海洋污损真核生物的18S核糖体基 因序列，找出来藤壶的特异性SNP(单核巧酸多态性)位点。该位点作为引物的3'最末端位置 使用。引物的3'倒数第二位的碱基设计原则是，它与祀序列之间没有错配或形成一个错配 (弱错配:A-CJ-G;或者是中等强度的错配:4-4，(：-(：，6-6)，与非祀序列也形成一个错配(强 错配:T-T，T-C，A-G;或者是中等强度的错配:4-4,0(：，6-6)。运样一来，引物与祀序列完全 配对或只有一个3 '倒数第二位的错配，一般不影响扩增效果，而与非祀序列有两个3 '最末 端的连续两个错配，一般导致扩增失败。如此可W获得藤壶特异性引物。
[0013] 而且，上述方法设计的藤壶特异性引物之一为AmpRl:5'-ATG CTT TCG CAG TAG TTC GTTG-3'。该引物与通用引物F566:5'-GGC ATC ACA GAC CTG TTA TTGC-3'一起使用可 W完成早期污损样品中藤壶幼虫存在与否的测定判断。
[0014] tL间物设计
[0015] 通过某海水污损样本中18S rDNA的扩增（扩增引物为5'-AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT-3'和5'-GAT CCT TCT GCA GGT TCA CCT AC-3'）及克隆测序，获得一批有效克隆， 之后进行BLAST生物信息学分析，确认一批污损真核生物(含藤壶）的各自的18S序列。很多 18S序列也可W通过数据库下载整理得到。通过对上述18S序列的多序列比对和反复比较， 找出来藤壶的若干个特征性SNP(单核巧酸多态性)位点多个。W运些SNP位点作为引物的3' 最末端位置尝试设计引物。引物的3'倒数第二位的碱基设计原则是，它与祀序列之间形成 一个错配，与非祀序列也形成一个错配。运样一来，引物与祀序列只有一个3'倒数第二位的 错配，而与非祀序列有两个3'最末端的连续两个错配。扩增长度在100-500碱基W便于用于 qPCR(也可W用于一般PCR)。运些引物对经过合成后W藤壶18S序列的克隆纯质粒为模板进 行PC閲金证扩增特异性，W及qPC閲金证(要求只扩增出来特异目的条带，Tm值分析只有主带 (不含引物二聚体），确定各对引物的特异性。选出最佳扩增特异性的引物(对）。特异性引物 也可W与通用引物配对使用。原则上可W设计出来不止一对最佳引物。因为藤壶本身的亚 种很多，可W依据上述方法设计某个或某些特定亚种的特异性引物，也可W设计某类藤壶 区分特定其他物种（如盘管虫）的特异性引物。最佳引物对之一为AmpRl: 5 ' -ATG CTT TCG CAG TAG TTC GTTG-3'与通用引物巧66:5'-GGC ATC ACA GAC CTG TTA TTGC-3'。使用该引 物对扩增出来的产物(400左右碱基对)经过DNA测序证明全部为藤壶18S序列。经过分析，该 最佳引物对适用于如下藤壶种类的测定(表格1):
[0016] 表格1特异性引物适用的藤壶种类
[0017]
[001 引
[0019] 间污损早期（肉眼可见附着藤壶之前)海水污损样本的采集和(宏)基因组提取
[0020] 适用于海上现场取样或室内纯培养体系中的污损样本取样。海上早期污损样本的 现场采集和宏基因组提取可采用热酪氯仿抽提法，其具体步骤为：1)将污损样品在海上(现 场)刮下来约200微升，内含各种海洋生物及附着的藤壶幼虫(纯培养体系中就只有藤壶幼 虫），添加600微升饱和酪(P册），剧烈震荡一分钟。带回实验室。2)75度水浴震荡10分钟后， 室溫静置3min，lOOOOr/min离屯、lOmin; 3)吸取上层清液至新EP管中并加入等体积酪，剧烈 震荡Imin后1000化/min离屯、10min;4)取其上层清液再加入等体积酪氯仿（1:1)，混匀Imin 后lOOOOr/min离屯、15min;5)取上层清液再加入等体积的氯仿，混匀Imin后lOOOOr/min离屯、 15min;取上清即为样品的(宏)基因组。
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