一种鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的引物、探针及鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的引 物、探针及鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 很多海洋无脊椎动物，如珊瑚、海葵等，发现会与一类光合自养的海藻 Symbiodinium(又名虫黄藻)共生。最近通过分子生物学研究发现Symbiodinium属的藻类在 不同的海洋生物宿主中存在生物多样性，基于分子分类的方法，把Symbiodinium属分为A-G 屯个类型。其中A-F，G是与造礁珊瑚共生的光合藻类，运些藻类的多样性分布不仅与宿主的 种类相关，还与珊瑚礁的群落，地理位置相关。由于Symbiodinium的群体组成(不同的种类 细胞或个体的丰度)是动态变化的，通常认为运是Symbiodinium为响应环境变化的生理反 应。然而，目前对珊瑚组织中共生的Symbiodinium生理生长特点和与珊瑚宿主的共生关系 还知之甚少，故而W为一些共生的藻类难W培养，运是对Symbiodinium研究的一个重要难 题。
[0003] 珊瑚健康及白化现象一直是国际国内研究的焦点，很多学者一直W来都认为珊瑚 的健康状态与共生藻的共生有紧密的关系，共生藻的"逃跑"或"丢失"被认为是珊瑚疾病或 白化的直接原因。研究发现珊瑚"白化"现象的发生与共生的Symbiodinium群体和多样性动 态变化息息相关。比如，由于海水溫度随季节性动态变化，在遇水溫升高的情况下，具有耐 热性较强的共生藻类的细胞丰度就会出现。目前用于调查藻类细胞数量的方法普遍使用人 工显微镜下的细胞计数，该方法费时耗力，实验误差大，另外从显微镜的形态学观察很难鉴 定共生藻的种类、类型。同时在高细胞密度的情况下，是可行的，但如果藻类细胞密度低，就 难W检测。如何快速，简单，准确，可靠的检测海藻类型或者细胞丰度，具有重要的实际运用 意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的引物和探针。 [000引为实现上述目的，本发明提供一种鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的引物和探 针，其特征在于，所述引物为SEQ ID NO:2-3,探针为SEQ ID NO:4;
[0006] 或引物为沈Q ID NO:5-6,探针为沈Q ID NO:7;
[0007] 或引物为沈Q ID NO:8-9,探针为沈Q ID NO: 10;
[000引或引物为沈Q ID NO:11-12,探针为沈Q ID NO: 13;
[0009] 或引物为沈Q ID NO:14-15,探针为沈Q ID NO: 16;
[0010] 或引物为SEQ ID NO:17-18,探针为SEQ ID NO: 19;
[0011] 所述探针的5 '端、3 '端均分别用FAM报导巧光染料和TAMRA泽灭基团标记。
[0012] -个方面，本发明提供一种用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的试剂盒，其 特征在于，含有所述的引物和探针。
[0013] -个方面，提供所述的试剂盒用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的用途。
[0014] -个方面，提供一种用于鉴定珊瑚共生光合藻类快速分裂型的方法，其特征在于， 采用所述引物和探针或所述的试剂盒。
[001引进一步，步骤为，
[0016] 提取光合藻类DNA;
[0017] PCR扩增，采用所述引物和探针；
[001引结果判定。
[0019] 进一步，所述PCR扩增的程序为:90-100°C，30-60S; 90-100°C，5-30S，50-70°C，20-90s，20~50个循环，在每个循环的延伸结束时进行巧光信号检测，巧光模式设为FAM;泽灭 基团设为TAMRA。
[0020] 进一步，所述PCR扩增的体系为，1/10体积的10倍PCR反应缓冲液，dNTP各0.1~ 0.5mmol/L，Taq DNA聚合酶0.1~5国际单位，探针0.1~0.5mmol/L分离纯化的DNA模板液 0.1~化1，上下游引物各0.1~2mmol/L，加无菌去离子水使总体积达到10~10化1。
[0021] 进一步，所述结果判定为：
[0022] 如果Ct值在0-40之间，优选的，Ct值在0-38之间；判定为阳性，表示样品检出珊瑚 共生光合藻类的快速分裂型为Clade A;
[0023] 如果Ct值为0或者大于等于40,判定为阴性，表示样品未检出珊瑚共生快速分裂型 光合藻类。
[0024] 进一步，还包括根据标准曲线，依据Ct值计算出快速分裂型为Clade A的浓度值Y; 所述标准曲线为Y clade A = -0.3098x巧.4468，r2 = 0.9992。
[0025] 所述珊瑚共生快速分裂型的光合藻类Clade A,是指在中国海域，珊瑚共生的光合 藻类Clade A，具有在溫度25°C正常光照培养下，其藻体生长速度及细胞分裂速率远远快于 Clade C和Clade F的光合藻类类型，其检测鉴定特征序列为：
[0026] CAATAGTGGAAGGTCCAAAAGGGACCAATGACGATGGGCAATAGCCAGAACATACACTCTGGGTGCAGCTCCGAGTA CGCCCACTCGCCCATAGCTTCCACTTG。记为沈Q ID N0:1。
[0027] 本发明主要依据物种的基因序列特异性，利用运段序列的分子标记可W特异的鉴 定共生光合藻Clade A，同时区别于非A型的珊瑚共生藻；另外经过前期的序列比对及实验 验证，通过运段序列GC含量介于45-60 % ;长度介于100-15化P;扩增效率高。同时设计所得 的引物不易形成二聚体；引物的退火溫度60°C，探针的退火溫度68°CW上，二者相差8°C，探 针适合携带巧光标记。故选择此段序列作为分型鉴定的分子标记。
[0028] 为了实现上述目的，本发明的珊瑚共生快速分裂型的光合藻类Clade A分子检测 方法，首先是依据Clade A类型的特征序列，设计用于实时定量化qman PCR的若干引物和 Taqman探针组合FAM-Clade A。
[0029] 从2014年开始，申请人通过对中国海域珊瑚样品调查采样及Symbiodinium的生物 地理学研究，初步鉴定中国海域珊瑚共生的Symbiodinium常见有Clade A和C两种类型。通 过不同其培养研究表明，Clade A，F和C在相同的培养状态下分裂速率完全不同，Clade A的 分裂速度和生长速度明显快于Clade C和Clade F。说明Symbiodinium Clade A是快速分裂 的类型，运一发现可能与珊瑚"白化"或者珊瑚组织的共生藻类丰度的动态变化密切相关。 为此，如何对中国海域珊瑚共生光合藻类快速分裂型Symbiodinium Clade A进行快速的检 测鉴定，对研究珊瑚"白化"机理及其防控防治具有十分重要的意义。
[0030] 为了确保参试藻种为珊瑚共生光合藻类的快速分裂型Clade A，本发明通过离体 纯化培养和口S-PCR方法对所采集的样品进行了藻类Clade A的鉴定。
[0031] 本发明的优点:本发明W快速分裂型藻种Clade A的口S序列易变异区设计特异引 物和化nMan探针组合(FAM-Clade A)，通过化qman PCR技术可实现对快速分裂型藻种Clade A的快速定量检测和细胞快速分裂类型的准确鉴定。进而换算得出共生藻的数量。
[0032] 本发明首先通过共生藻的培养实验，比较各种共生藻的分裂速度，确定A型为快速 分裂性，选择鉴定A型的意义主要是考虑到快速分裂型共生藻未来可W利用其分裂，生长速 度快的优势，运用于珊瑚的修复。通过选择最具有针对A型的特异的DNA位点作为标记，设计 引物及探针，同时又能准确区分其他非A型的共生藻，通过前期大量实验验证，比较多对探 针引物组合的特异性，另外考虑到引物自身的退火溫度，GC含量，引物长度等综合因素，本 发明的引物和探针鉴定A型较为理想，最终达到准确的鉴定区分A型共生藻的目的。并且充 分利用定量PCR灵敏性特点，需要的共生藻dna摄入量少，对珊瑚组织的取样量少，不但可W 最大限度减少对珊瑚的破坏，而且可W动态监测珊瑚组织的A型共生藻的数量变化，探讨A 型共生藻与珊瑚健康状态的关系，研究及应用价值大。在我国，关于海洋环境监测的指标及 技术有很大的缺陷，对珊瑚生活环境及健康状态的评价更是一片空白，对我国珊瑚礁的保 护缺乏法律依据及相关标准。本发明W此目的作为出发点，通过准确鉴定及定量测定珊瑚 组织内共生藻的细胞数量，从珊瑚共生藻的细胞数量鉴定及检测作为一项指标，W此为角 度进而评判珊瑚的健康状态，未来有望成为行业内的一项标准。
【附图说明】
[0033] 图1是不同藻种培养时间与藻体细胞的光密度吸收关系图。