2引所述PCR反应体系为：30-50ng/yL DNA，正向和反向引物各1.0ymol/L，1.5mmol/L dNTPs，?ιL10XPCRBuffer(Mg2+plus)，0.75~1.0UTaq聚合酶（rTaq，TaKaRaLtd.)，加 双蒸水至2化L。
[0026] 所述PCR扩增程序为:95°C预变性5min，95°C变性30sec，60°C复性30sec，72°C延伸 30sec，30个循环后，72°C再延伸5min。
[0027] 所述凝胶电泳检测指采用6%的非变性聚丙締酷胺凝胶，IXTBE电泳缓冲液，于 500V恒压电泳1.5小时分离，最后银染显色。
[0028] 所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的应用所得到的烟草品种、及其种子 和无性繁殖体。
[0029] 含有所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的表达盒。
[0030] 所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的表达盒辅助选择在杂交1代、回交2 代及其后续回交、自交改良系(群体)中的应用。
[0031] 含有所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的转基因细胞系。
[0032] 所述的抗烟草黑腔病Ph基因连锁的分子标记的转基因细胞系辅助选择在杂交1 代、回交2代及其后续回交、自交改良系(群体)中的应用。
[0033] 含有所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的重组菌。
[0034] 所述的抗烟草黑腔病化基因连锁的分子标记的重组菌辅助选择在杂交1代、回交2 代及其后续回交、自交改良系(群体)中的应用。
[0035] 下面结合实施例进行进一步的说明： 材料与方法 亲本选择:云南省烟草农业科学研究院烟草行业烟草生物技术重点实验室W优质烤烟 品种红花大金元为轮回亲本，利用远缘杂交技术并结合母本起源的烟草单倍体育种技术培 育获得的高抗烟草黑腔病0号生理小种和烟草普通花叶病的育种材料RBST(该品种因含有 烟草野生种N.plumbaginifolia的染色体片段而具有烟草黑腔病0号生理小种的极高抗性） (中国发明专利申请号201410819251.2)为非轮回亲本，采用杂交、回交、，导入片段中目的 抗性Ph基因分子标记定位及分子标记辅助选择技术对含有野生烟草染色体导入片段的株 系进行连续4年的黑腔病0号生理小种抗性检测，筛选出高抗烟草黑腔病0号生理小种的导 入系W67-23-115。该导入系的黑腔病0号生理小种抗性与供体亲本一致，其余性状与受体亲 本相当，也即具有受体亲本-红花大金元的遗传背景。所用的亲本及导入系本实验室有保 存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
[0036] 分子引物：由两部分来源构成，一是由Bindler等公开发表的5119对PT序列引物， 详细结果可W参见Bindler等在Theor. Appl. Genet. 2011年第123卷发表的文章 《A high density genetic map of tobacco (NicotianatabacumL.) obtained from large scale microsatellite marker development》；另一部分是由我们依据中国烟草基因组数据库 (CTGDB)自行开发的13648对TM序列引物(该部分数据目前尚未公开）。PCR实验使用宝生物 (TaKaRa Ltd)公司的Taq聚合酶（rTaq，TaKaRa Ltd.)和dNTPs(2.5 ml each，TaKaRa Ltd.);电泳凝胶使用台湾生工公司的30%非变性聚丙締酷胺，将其稀释至6%后使用。
[0037] 实施例1抗黑腔病化基因连锁分子标记的筛选 步骤1，烟草黑腔病表型鉴定 2010年在云南省烟草农业科学研究院试验基地大田W红花大金元为母本，RBST为父本 配制杂交Fi，2011年夏季在基地大田夏季分别种植两行红花大金元和Fi，W红花大金元为父 本，Fi为母本配制杂交产生BCiFi，成熟后全部混收；同时进行Fi自交，获得F2。同年冬季至次 年春季在基地阳光大棚里分别种植两行红花大金元和BCiFi，W红花大金元为父本，BCiFi为 母本配制杂交产生BC2F1，成熟后全部混收。通过杂交、自交、回交，获得Fi、F2及BCiFi、BC2F1群 体。
[0038] 2012年夏季在基地实验大棚中采用采用162孔漂浮育苗盘对红花大金元、RBST和 内、尸2、8(：1。1、8〔2。1进行漂浮育苗，每群体10盘，常规管理至成苗。每群体筛选整齐一致的成 苗1080株移栽小花盆，菌丝块微伤贴接茎基部法测定苗期黑腔病抗性（中国发明专利申请 号201510617233.0)。
[0039] 在种植的四世代群体中，调查黑腔病的抗性表型，计算分离比，使用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计分析，使用SAS 8.0对结果进行卡方测验。
[0040] 结果显示:杂交后代Fi均表现为抗;F2抗感的分离比例经卡方测验符合3:1;回交群 体中，抗感的比例为1:1。由此可验证，烟草黑腔病抗性是由1对核基因控制的，且为显性基 因。
[0041 ] 步骤2，DNA提取和分子标记分析 取烟草植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基Ξ甲基漠化锭)法提取亲本及群体各单株 的基因组DNA。
[0042] PCR反应体系为：总反应体系2化L，30-50ng/yL DNA，正向和反向引物各1.化mol/ L，1.5mmol/LdNTPs，?ιL10XPCRBuffer(Mg2+plus)，0.75~1.0UTaq聚合酶（rTaq， 化KaRa Ltd.)，加双蒸水至2化L。分子引物使用依据中国烟草基因组数据库(CTGDB)自行开 发的13648对TM序列引物(该部分数据目前尚未公开)和Bindler等开发的5119对引物。PCR 扩增程序为:95°C预变性5min，95°C变性30sec，60°C复性30sec，72°C延伸30sec，30个循环 后，72°C再延伸5min，16°C for ever。扩增产物用6.0%非变性聚丙締酷胺凝胶分离，电泳 缓冲液为1.0 X TBE，500V恒压电泳分离1.化，电泳后银染显色，统计带型。
[0043] 步骤3,分子标记筛选、数据统计及连锁图构建 主要包括4步：（1)筛选在父母本间表现出多态且在子一代(Fi)中呈共显性的分子标 记；（2)在BCiFi群体中分别选取抗、感病单株的DNA 15份，根据BSA法构建抗、感2个近等基因 池，并进一步筛选与目的基因（Ph)紧密连锁的标记；（3)利用获得的多态性引物分析BC化群 体各单株基因型；（4)利用化inmap 4.0软件进行连锁图的绘制。
[0044] 分子标记的统计方法:与母本(红花大金元)一致的带型记为曰，与父本(RBST)-致 的带型记为b，杂合的带型记为h，未扩增出的或模糊不清的记为U。
[004引结果显示：用18767( 13648 TM +5119 PT)对分子标记引物对P1 (红花大金元)和P2 (RBST)进行筛选，其中在两个亲本间表现多态的引物有1501对，多态率8%。
[0046] 结合BSA法建池，进一步筛选得到了 32个与目标基因（Ph)连锁的分子标记。
[0047] 利用筛选出的多态性标记对红花大金元XRBST组合的BCiFi群体进行基因型分析， 结合抗性调查数据利用化inmap 4.0构建连锁图。结果显示:共有84个分子标记和目标基因 (Ph)定位在同一连锁群上化00=10)，最终获得与Ph基因紧密连锁的4个分子标记Scf_30K、 TM62、ST141和InDel0617,遗传距离为0.089cM。此4个标记分别位于化基因两侧，其中分子 标记InDel0617与化基因的遗传距离为0.018cM(即与先前报道的标记TM29位于同一侧，但 距化更近；中国发明专利申请号201410250226.7)，分子标记Scf_30K、TM62和ST141呈共分 离状态（即该3个标记间的遗传距离为0)且与化基因的遗传距离为0.071cM(即与先前报道 的标记TM50位于同一侧；中国发明专利申请号201410250226.7)。进一步将本试验得到的连 锁图与已发表的烟草遗传图谱(Bindler et al. ,2011)比较，发现本连锁群与第20染色体 上共有23个共有标记(PT系列序列），据此将化基因定位在第20染色体上。
[004引步骤4,标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617 PCR扩增差异条带的回收纯化及测 序 (1)目的片段的回收 采用煮沸法。具体操作为:先从胶上分别将标记Scf_30K、TM62、ST14巧日InDel0617 PCR 扩增的差异条带挖下来装放入1.5mL的化pendorf管内，向管内加入10化L超纯水，加水量视 胶带颜色深浅而定;常溫下浸泡2地，转入95°C水浴锅(或PCR仪）中煮30min后，500化/m离屯、 3min。产物即可取上清化L做模板进行PCR扩增，剩余产物置-20°C保存备用。
[0049] (2)目的片段的纯化 用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，-20°C过夜放置，1， 2000;r/m离屯、5min就可W得到纯化产物。
[0050] (3)目的片段与载体的连接 反应体系为 10化:PMD18-T Vectorl.O化;Ligation bufferlS.Oyl^;目的片段4.0yL。 [0051 ]在超净工作台上加样，混匀反应物，暂短离屯、，16°C连接约化，过夜也不影响连接 效率。
[0052] (4)连接产物的转化 1)