一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液及其制备方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液及 其制备方法。
【背景技术】：
[0002] 烟草黑胫病是烟草最具毁灭性的病害之一。烟草黑胫病又称烟草疫病，烟农称为 "黑杆疯"、"黑根"、"乌头病"，是由Phytophthora parasitica var nicotianae引起的，该 病可造成烟株快速死亡，全世界各主要产烟区均有不同程度的发生，发病率一般为5%~ 15%，重病区发病率可达30%以上，能给烟草生产造成毁灭性的打击，是世界性的烟草重要 病害。近年来，随着烟草连作种植年限的延长，全国各烟区病情日趋严重。由于生产上栽培 烟草品种对黑胫病抗性较差或综合抗性不足，黑胫病的防治目前仍然依赖于化学防治。防 治烟草黑胫病的主要农药为甲霜灵锰锌和霜霉威，药剂种类较为单一，且均已有十几年甚 至几十年的使用历史，病菌对化学农药产生抗药性，导致防治效果下降，防治成本增加，环 境污染加剧。此外，随着人们对环境与健康的日益重视，减少农药使用，促进安全优质烟叶 生产，对改善农业生态环境具有重要意义。生物防治对环境友好，在某些情况下防治效果优 于化学药剂，特别是在病害发病高峰期常伴随高温多雨，化学药剂难以发挥作用。因此开 发、研究具有抗烟草黑胫病的生防菌及其培养物是必要的。
[0003] 例如中国专利申请201110231990. 6公开了一种针对烟草黑胫病的生防细菌及 用量的筛选方法，该方法包括以下步骤：a、在培养皿内滤纸上培养无菌烟苗，b、在步骤a的 基础上，向培养皿中添加具有生防潜能的细菌培养液；c、待烟苗和具生防潜能的细菌菌悬 液一起培养24小时后，向培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液；d、在c步骤基础 上，给予烟苗正常生长条件，7天后通过观察烟苗的发病情况来检测添加的具生防潜力细菌 的防治效果，筛选出能够防治烟草黑胫病的生防细菌。再如中国专利申请201210159083X 公开了 一种兼抗烟草黑胫病和青枯病的生防菌株Trb3,为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，所述菌株Trb3制备菌剂的方法是，将所述菌株Trb3在LB培养液28°C，180rpm 振荡培养36-40小时，然后6000rpm离心10分钟，用灭菌水进行稀释配制成菌剂，Trb3菌株 菌剂在烟草移栽前蘸根或移栽时灌根使用，移栽后在烟草黑胫病和青枯病即将进入发病期 时灌根使用。又如中国专利申请2012100216079公开了一种烟草黑胫病病菌液固复合体系 培养方法及培养物应用，该法培养获得的固体物可用于烟草黑胫病的人工接种物，也可用 于制备带烟草黑胫病病菌病土的添加物，以便测定烟草品种对黑胫病的抗感性、筛选防治 烟草黑胫病的药剂或生防菌、天然产物。其培养步骤包括（A)病菌分离，从发病田块中采集 病株，经过分离、纯化、致病力测定，获得病菌；(B)平板培养，将病菌接种于培养基平板上， 24~30°C下培养5~7天；（C)液体培养，将平板菌丝接种于培养液中，24~30°C、150转/ 分钟振荡培养5~7天；(D)固体培养，将液体菌丝接种于固体培养基，24~30°C培养8~ 12天。又如，中国专利申请2007103000874公开了一种防治烟草黑胫病的菌株及菌剂，菌株 采用淡紫拟青霉ZY-19-2,其菌剂为通过原种发酵工艺制成菌剂，以0. 8-2. 0%的胶体几丁 质为碳源，发酵初始pH值为5. 5-7. 0,以0. 8-1. 5%蛋白胨为氮源，0. 1%吐温80作为表面 活性剂，发酵时间为48-72h，接种量为0. 8-2%，摇床转速100-180r/min。
[0004]目前，生防菌剂的开发成为近期研究的热点，多为细菌类生防菌，其中芽孢杆菌、 假单胞菌、链霉菌等细菌类生防因子研究应用较多。也有个别利用真菌的，其中木霉真菌 研究利用较多。最近有人利用拟青霉属的真菌，例如2007103000874的专利申请。而利用 青霉属真菌作为生防菌的研究很少见报道，用于人类病害防治的重要抗生素之一青霉素 来源于青霉属的真菌，因此开展青霉菌属真菌对黑胫病菌的控制研究具有很重要的现实 意义。青霉属真菌的种类较多，例如，产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum)，桔青霉菌 (Penicillium citrinum)，指状青霉（Penicillium dititatum)，音夂枝青霉（Penicillium divaricatum)，扩展青霉(Penicillium expansum)，粒状青霉(Penicillium granu/ atum)，马尔尼菲青霉菌（Penicillium marneffei)，特异青霉菌（Penicillium notatum)， 产紫青霉（Penicillium purpurogenum)，娄地青霉（Penicillium roqueforti)，尖抱青 霉（Penicillium spiculisporum)，变异青霉(Penicillium varians)，马德里青霉菌 (Penicillium madriti)等等。
[0005] 淡紫拟青霉与马德里青霉菌的区别为：
[0006] 淡紫拟青霉在分类地位上属于拟青霉菌属，学名为：Penicilliopsis，拟青霉菌属 真菌是虫生真菌的重要类群，其中许多是害虫的控制因子，用于害虫的生物防治研究的较 多。淡紫拟青霉属于内寄生性真菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能够寄生于卵，也能 侵染幼虫和雌虫，可明显减轻多种作物根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等植物线虫病的危害。
[0007] 马德里青霉在分类地位上属于青霉菌属，学名为：Penicillium，青霉菌属的真菌 多营腐生生活，生长在腐烂的水果、蔬菜、肉类和各种潮湿的有机物上。有些也会引起桔子、 橙子变质。有关马德里青霉菌的研究国内尚未见详细报道，在国外的数据库中只查到1篇 文献，其中仅一句话叙述，将其应用于棉花红腐病的生物防治。
【发明内容】
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[0008] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种对人畜与环境安全性 好，对烟草黑胫病防治效果好的防治烟草黑胫病的青霉QMYCS-2菌株发酵液及其制备方 法。
[0009] 为了实现上述目的，本发明提供了一种防治烟草黑胫病的青霉QMYCS-2菌株发酵 液及其制备方法，其中，
[0010] 以马德里青霉菌QMYCS-2作为生防菌株，此菌株于2014年11月14日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC N0. 9856 ;保藏地址：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0011] 以马铃薯液体培养基、燕麦片液体培养基或查彼液体培养基制备防治烟草黑胫病 的马德里青霉QMYCS-2菌株发酵液，所述马德里青霉QMYCS-2菌株是菌种保藏号为CGMCC N0. 9856的保藏菌株；
[0012] 所述马铃薯液体培养基为：马铃薯200g、葡萄糖10_20g、蒸馏水1000ml，自然pH ;
[0013] 所述燕麦片液体培养基为：30g燕麦片，1000mL水，自然pH，
[0014] 所述查彼液体培养基为：NaN032g，K2HP04lg，KC10. 5g，MgS040 . 5g，FeS040 . 01g，蔗糖 30g，水 1000ml，pH 自然。
[0015] 防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液及其制备方法，其中，包括如下步骤：
[0016] A、以马德里青霉菌QMYCS-2菌株作为生防菌株，此菌株于2014年11月14日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC N0. 9856 ;
[0017] B、在燕麦片琼脂培养基上培养马德里青霉菌QMYCS-2菌株；
[0018] C、从燕麦片培养基上培养4d的马德里青霉菌QMYCS-2菌株的菌落边缘取直径为 5mm菌饼，将该菌饼接种于含100mL马铃薯液体培养基、容量为250mL的三角瓶中，28°C， 180rpm 振荡培养 15-20d ;
[0019] D、纱布过滤除去菌丝体，再经8000r/分钟离心5分钟，镜检无细胞，获得发酵液；
[0020] E、用生物测定的方法确定发酵液活性；
[0021] F、确定发酵液具有生物活性后，用清水将发酵液稀释10倍、50倍和100倍（V/V); 用于防治烟草黑胫病。
[0022] 步骤B在燕麦片