专利名称：部分接种鉴定烟草病毒病抗性的方法
技术领域：
本发明涉及烟草的育种、栽培，具体来说，涉及鉴定烟草病毒病抗性的方法。
背景技术：
烟草上发生的主要病毒病包括烟草普通花叶病毒(TMV)病、黄瓜花叶病毒(CMV) 病、马铃薯Y病毒(PVY)病等。烟草品种病毒病抗性田间鉴定，是不一种不可替代的抗病性鉴定方法，田间鉴定是烟草品种在自然环境下多种因素综合作用的抗病性表现，是最直接、 最真实的抗病性反映。但烟草品种病毒病抗性田间鉴定存在发病率难于控制的问题，烟草品种病毒病抗性田间鉴定通常采用自然发病法、或人工接种病毒法。自然发病法经常出现发病率很低的情况；而人工接种法则会出现全部烟草发病的情况。这两种情况会导致抗病品种与感品种都不发病或都发病，这样就难以准确区分不同品种间的抗病性差异。中国专利数据库中涉及烟草抗性鉴定的技术方案有200610048657. 0号《一种烟草普通花叶病抗性的苗期鉴定方法》、200610048658. 5号《一种烟草黑胫病抗性的苗期鉴定方法》、200910094173. 3号《一种烟草黑胫病抗性的病圃鉴定方法》、200910094174. 8号《一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法》、200910041164. 8号《一种烟草普通花叶病抗性的离体快速鉴定方法》和201010280169. 9号《一种烟草黑胫病抗性的苗期恒温水培鉴定方法》等， 但迄今为止，未见针对可有效控制田间发病率、多种烟草病毒病抗性田间鉴定的方法专利。
发明内容
本发明的目的在于提供部分接种鉴定烟草病毒病抗性的方法，以控制烟草的田间发病率，解决鉴定烟草品种对病毒病抗性的难题。本发明提供的部分接种鉴定烟草病毒病抗性的方法，是在田间进行的，具体做法是(1)择地选择相对较平整、均勻的地块，该地块满足以下条件排灌方便，与周围环境有隔离措施，周围50m内不种植烟草以外的其它茄科作物；(2)种植烟草每个品种每重复种植10株，单行区排列；随机区组，设4个重复；四周设双行保护行；(3)接种在移栽后的 10 15天，选择气温20°C 30°C、无雨的下午对各个小区的每个品种进行部分人工接种， 每个品种均按鉴定株数的30%接种(即对田间每行的第2、5、8、株进行人工接种)，注意避免叶面潮湿；(4)鉴定根据调查记载、病情指数计算，按相应烟草病害调查、烟草品种抗病性鉴定的行业标准划分烟草品种的抗性等级。发明人指出接种时间如遇烟草生长缓慢或无适宜天气等问题，可适当推后。上述第3步中，具体的接种方法是将已鉴定、纯化的烟草病叶(TMV、CMV、PVY)进行仔细研磨，用双层沙布滤除残渣，最终浓度以病叶质量与水的体积之比计为1 20;在病毒液中直接加入质量分数为2%经灭菌的600目金刚砂混勻，作为接种时创造微伤口的介质；采用人工摩擦接种法，每株待接种烟株接种3cm以上两片新生叶；接种时，用手托起叶背，用已灭菌砂布蘸已制备的病毒汁液，在叶正面由内侧向外轻轻摩擦接种。本方法的“部分接种”即是需鉴定抗病性的烟草在田间对部分烟株进行接种。例如一个品种田间种植10株，只对30 %的烟草进行接种，即人工接种病毒3株烟，其余7株不接种，由其自然发病。接种的3株烟的作用，一是观察接种烟株是否对接种病毒有抗病性； 二是使其成为田间自然传染源，观察其它未接种烟株的抗病性。对需接种烟草的确定，是以这3株烟能成为另外7株烟均等传染源为原则。即接种烟草较为均勻的分布在未 接种烟草的中间(以距离计算)。以10株一行为列，通常接种第2、5、8株烟。各品种间接种方法、接种烟株保持一致，各品种间有可比性即可。发明人指出病毒接种即是采用人工手段使病毒进入烟草活细胞内，并在烟草细胞内开始繁殖，致使烟草发病的过程。其关键在于使病毒进入“活细胞”。这需要在烟草表皮细胞上制造出一点“微伤口 ”这些伤口应该是肉眼看不到的，是在活细胞上的伤口，这样的微伤口才能让病毒进入细胞，而细胞也不会死亡，这样才能接种成功。如无伤口则病毒无法侵入、而伤口过大则会使细胞死亡，病毒无法繁殖，这两种情况都会导致接种失败。600 目金刚砂是一种极细的无化学作用的颗粒，病毒汁液混入金刚砂后，通过手的摩擦，金刚砂可划破烟草表皮细胞，造成微伤口，使病毒进入活细胞。传统方法是采用400 500目金刚砂，先用金刚砂摩擦叶片划出伤口，再用病毒汁液涂摸接种。600目金刚砂混入病毒汁液一次接种比传统方法减少步骤，并因颗粒细度的提高而使接种效果明显提高。本发明采用部分接种的方法鉴定烟草病毒病抗病性，可有效控制田间发病率在 30% 80%之间，各品种对病毒病抗病、感病特征表现明显，显著提高病毒病田间鉴定准确性。有效解决了传统田间鉴定自然发病或全部接种时，田间发病率过高过低的问题。使用 1 20的烟草病毒汁液，混入600目金刚砂接种，可提高病毒接种成功率及接种效率。
具体实施例方式实施例2009年贵州省烤烟品种区域试验马铃薯Y病毒(PVY)抗性鉴定，需鉴定烟草品系 14份，对照品种2份，计16个品种(系)。田间试验地在海拔IOOOm的贵州省烟科所福泉实验基地进行。田间试验设4重复， 随机排列，每小区每品种10株。试验地5月20日移栽，除不采摘烟叶外其余管理按田间生产规范进行。田间鉴定于移栽后18天，对各个小区的每个品种(系)的第2、5、8三株烟草进行病毒汁液人工摩擦接种，作为传染源。每株接种两片叶，接种浓度以病叶质量与水的体积之比计为1 20。将已鉴定、纯化的PVY病叶进行仔细研磨，用双层沙布滤除残渣，最终浓度以病叶质量与水的体积之比计为1 20。在病毒液中直接加入2%灭菌600目金刚砂混勻。 采用人工摩擦接种的方法，每株待接种烟株接种3cm以上两片新生叶。接种时，用手托起叶背，用已灭菌砂布蘸已制备的病毒汁液，在叶正面由内侧向外轻轻摩擦接种。田间记载分在打顶后10天一次记载，调查所有烟株，病级分级按相关标准执行。 计算病情指数后进行抗病性初判。病害严重度分级(以株为单位分级调查)0级全株无病。1级心叶脉明或轻微花叶，病株无明显矮化。3级1/3叶片花叶但叶不变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上。
5级1/3 1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的 2/3 3/4。7级1/2 2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2 2/3。9级全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的1/2以上。病情指数(D)计算公式D=E (各级病株数X该病级数)X 100/ (调查总株数X最高级数)抗性评价分级标准
免疫病指为0抗病病指为0.1 20中抗病指为20. 1 40中感病指为40. 1 60感病病指为60. 1 80高感病指为80.1 100感病对照的病情指数不低于60时方可认为试验及评价有效。结果PVY抗病对照TN90病指为0，对照K326病指为60，实验发病程度属正常范围。在鉴定材料中其余均表现为感病至中感。各材料鉴定结果见下表
权利要求
1.部分接种鉴定烟草病毒病抗性的方法，是在田间进行的，其特征包括(1)择地选择相对较平整、均勻的地块，该地块满足以下条件排灌方便，与周围环境有隔离措施，周围 50m内不种植烟草以外的其它茄科作物；(2)种植烟草每个品种每重复种植10株，单行区排列；随机区组，设4个重复；四周设双行保护行；(3)接种在移栽后的10 15天，选择气温20°C 30°C、无雨的下午对各个小区的每个品种进行部分人工接种，每个品种均按鉴定株数的30%接种，即对田间每行的第2、5、8、株进行人工接种，注意避免叶面潮湿；(4)鉴定根据调查记载、病情指数计算，按相应烟草病害调查、烟草品种抗病性鉴定的行业标准划分烟草品种的抗性等级。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述第3步中，具体的接种方法是将已鉴定、纯化的烟草病叶(TMV、CMV、PVY)进行仔细研磨，用双层沙布滤除残渣，最终浓度以病叶质量与水的体积之比计为1 20;在病毒液中直接加入质量分数为2%经灭菌的600目金刚砂混勻，作为接种时创造微伤口的介质；采用人工摩擦接种法，每株待接种烟株接种3cm 以上两片新生叶；接种时，用手托起叶背，用已灭菌砂布蘸已制备的病毒汁液，在叶正面由内侧向外轻轻摩擦接种。
全文摘要
本发明公开了部分接种鉴定烟草病毒病抗性的方法，包括(1)择地选择相对平整、均匀，排灌方便，与周围环境有隔离措施，周围50m内不种植其它茄科作物的地块；(2)种植每个品种重复种植10株，单行区排列；随机区组，设4个重复；四周设双行保护；(3)接种在移栽后10～15天，选择气温20℃～30℃、无雨的下午对各小区每个品种进行部分接种；(4)鉴定根据调查记载、病情指数计算，按相应烟草病害调查、烟草品种抗病性鉴定的行业标准划分烟草品种的抗性等级。本方法有效控制田间发病率在30％～80％，各品种对病毒病抗病、感病特征表现明显，显著提高病毒病田间鉴定准确性；有效解决了传统田间鉴定自然发病或全部接种时，发病率过高过低的问题。
文档编号C12Q1/18GK102220437SQ201110106440
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者任学良, 张吉顺, 李莉, 王仁刚, 谢升东 申请人:贵州省烟草科学研究所