一种培养高产亚硫酸的酵母的方法及用该酵母生产酒类饮料的方法

专利名称：：一种培养高产亚硫酸的酵母的方法及用该酵母生产酒类饮料的方法
技术领域：
：本发明基于酵母的代谢物及基因表达水平的分析结果，提供了一种培养酵母的方法，它可在提高亚硫酸产量的同时不增加可导致异味的硫化氢的产量，这对于在酿造中维持新鲜度非常重要。另外，本发明提供一种用该酵母生产高质量酒类饮料的方法。
背景技术：
：亚硫酸是一种具有高抗氧化作用的化合物，作为抗氧化剂广泛应用于食品、饮料、药物等领域。已知在啤酒酿造中，更长的保质期是通过增加产品中所含的亚硫酸的浓度来实现的。亚硫酸在维持新鲜度方面起到重要作用。因此，如果提高啤酒之类的产品中亚硫酸的含量，则可得到具有稳定口味的产品。同时，硫化氢是一种具有类似"臭鸡蛋"味道的化合物。在啤酒酿造中，硫化氢不仅是产品异味的原因，也是异味的前体。因此，期望酵母具有较低的产生硫化氢的能力。具体地，如果可抑制硫化氢的产生，则可提供具有较少异味和更好味道稳定性的产品，例如啤酒。已报道了涉及使用诸如基因重组技术这样的传统方法的实例，包括高水平表达MET3基因或MET14基因，从而通过硫酸根离子同化途径(硫酸根离子——APS(腺普酰硫酸)——PAPS(磷酸腺苷酰硫酸)——亚硫酸——硫化氬)来增加亚硫酸的产量(例如，参见C.Korchetal，.Proc.Eur.Brew.Conv.，Congress,Lisbon,p.201-208,1991);由于破坏MET10基因(例如，参见J.Hansenetal.,NatureBiotech.,Vol.14,p.1587-1591,1996)或破坏MET2基因(例如，参见J.HansenandM.C.Kielland-Brandt,J.Biotech"Vol.50，p.75-87，1996)来增加亚硫酸的产量。而对于硫化氢，日本专利No.2005398——"酵母硫化氬生成抑制基因以及引入该基因的酿造酵母"，描述了通过引入NHS5基因来降低酵母产生硫化氢能力的方法(日本专利No.2005398)。此外，日本专利No.3514507-"减少硫化氬生成能力的酵母以及用该酵母生产啤酒的方法"，描述了通过组成型表达MET25(=MET17)基因来降低酵母产生硫化氩能力的方法(曰本专利No.3514507)。另夕卜，日本专利公开(Kokai)No.2005-65572——"生产具有亚硫酸抗性和/或降低产生辟u化氩的能力的酵母的方法"，描述了通过增加酵母SSUl基因的转录量和/或表达水平，从而赋予亚硫酸抗性并降低硫化氢产量的方法(日本专利公开(Kokai)No.2005-65572)。然而，所有这些技术均是依据增加或者降低单个基因表达水平的方法。使用这些方法，无法实现对所产生亚硫酸及硫化氢的量的精细调控。作为通过使用非基因工程技术来培养不产生硫化氢气味的酵母的实施例，已有通过赋予针对曱硫氨酸类似物的抗性来选择低水平产生硫化氢的酵母的报道(日本专利公开(Kokai)No.8-214869(1996)"培养不产生硫化氢气味的酵母的方法")。作为通过改良酿造方式来抑制硫化氢产生的方法，已经尝试通过改变麦芽汁组分、控制发酵温度、或控制发酵中的通风来抑制硫化氢的产生。这些方法的困难之处在于，当应用它们时只产生低水平的亚硫酸。与此同时，作为增加亚硫酸产量的酿造方法，也已通过改变酿造中的麦芽汁组分、控制发酵温度、或控制发酵中的通风来尝试增加亚硫酸的产量。当应用这些方法时，会出现由于延緩了酵母生长而导致的发酵不充分并会产生高水平的硫化氢。如上所述，传统方法在亚硫酸及硫化氢的生成上是有问题的，其中一种的生成水平越低，另一种的生成水平也越低。而且，如上所述，传统方法在实际应用方面也是有问题的，由于改变了啤酒原来的味道和风味，因此不利于啤酒生产。通常所做的就是从大量酵母菌抹中选择可高水平产生亚硫酸的菌抹或者可低水平产生硫化氢的菌林。不过，选择这样的菌抹需要耗时的发酵实验，因此这种选择方法效率较低。近年来，使用DNA阵列、DNA芯片或类似的将基因组中的基因或者基因以外区域的DNA片段固定在膜或玻璃上的技术，可对多种生物物种进行详尽的基因分析。例如，对于啤酒酵母，已报道了使用Olesenetal.,femsYeastRes"Vol.2,p.536-573，2002)。此外，通过使用毛细管电泳-质谱(CE-MS)技术可以进行代谢物组分析，由此对细胞内代谢物进行完全直接定量。具体地，将样品注入到毛细管内，然后在两端施加高电压，所有的阳离子化合物向阴极迁移，阴离子化合物向阳极迁移。该技术包括利用迁移速度差异来分离化合物、然后使用与毛细管末端相联的质谱仪根据每种化合物独特的质量数选择性地进行检测。例如，使用该方法(技术)，已检测了在枯草芽孢杆菌中由于碳源改变而造成的细胞内代谢物的改变(T.Sogaetal.,Anal.Chem.，Vol.74，p.2233-2239,2002)以及在水稻叶片中代谢物浓度在24小时的变化(S.Satoetal.,PlantJ.,Vol.40,p.151-163,2004)。关于使用突变、人工突变处理方法的培养方法是已知的，譬如UV(紫外线)照射、EMS(甲磺酸乙酯)、及MNNG(N-甲基-N，-硝基-N-亚硝基胍)。例如，通过EMS处理已获得了一个营养缺陷型突变菌林(G.Lindegrenetal.,Can.J.Genet.Cytol.,Vol.7，p.491-499,1965)。然而，即便通过这些突变方法获得了具有目标性状的突变林，突变也可被随机引入到目标基因之外的位点上，从而改变了目标性状之外的性状，例如，会导致酿造所需的发酵特性的丧失。同时，在微生物群体中突变可以极低频率自发产生。如果可以精确选择并分离这些从自发突变中获得的突变林，那么就无需进行人工突变处理。发明概述在酿造的啤酒、发泡酒、其它混合饮料、葡萄酒、精馏酒精(Woc/m)以及威士忌中，酵母不仅仅进行乙醇发酵，而且生成了多种具有芳香味的组分。可以通过组合使用酵母菌抹、麦芽汁组分及发酵控制方法来实现啤酒、发泡酒和其它混合饮料的风味特征。因此，选择特定的酵母菌抹对于合适的酿造控制而言是核心技术。然而，选择可产生预期风味的酵母需要对非常多的菌抹进行发酵检验，这需要大量的时间和努力。此外，在菌抹库中并非总是能找到所需的菌抹。亚硫酸是可以影响啤酒、发泡酒及葡萄酒保质期的重要化合物。而且，硫化氬在啤酒、发泡酒及葡萄酒产生气味方面是一种可导致不宜特性的气味组分。此外，硫化氢也可以是其它含硫的可导致异味的组分的前体。因此，如果硫化氢的量是可调节的，则可以调节其它的异味物。不过，传统的酿造方法由于"平衡"现象——亚硫酸或者硫化氬中的某个生成水平越低，另一个的生成水平也越低，因此难以解决这个问题。使用非基因工程技术来解决"平衡"现象是非常困难的。考虑到上述情况，本发明的一个目标是提供一种培养不增加硫化氢产量，同时可产生更多亚硫酸的酿酒酵母的方法。此外，本发明的另一个目标是培养能产生不同比率的亚硫酸与硫化氢的、产亚硫酸与硫化氢的酵母，从而可以根据不同的目的培养不同类型的酵母。为了实现上述目标，本发明人已经对同时以低水平产生亚硫酸和硫化氢的面包酵母，以及同时高水平产生亚硫酸和硫化氢的生产用底层发酵酵母使用DNA微阵列进行了基因表达分析，使用毛细管电泳-质谱(CE-MS)、气相色谱(GC)和液相色语(HPLC)根据含石克氨基酸的生物合成途径进行了代谢组分析。结果本发明人发现生产用底层发酵酵母比面包酵母产生更多的亚硫酸和硫化氬，它们是硫酸盐离子同化途径中的中间代谢物。本发明人还发现生产用底层发酵酵母比面包酵母具有更低细胞内浓度的高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸，它们是从天冬氨酸合成高半胱氨酸途径的中间代谢物。根据这些发现，本发明人形成了一个假说在生产用底层发酵酵母中，硫化氢产量的定速因子是胞内O-乙酰高丝氨酸的含量，在高半胱氨酸合成中，作为底物的是O-乙酰高丝氨酸而不是硫化氢。本发明人已确认，当向面包酵母中分别加入20种氨基酸，然后测定亚碌u酸和硫化氢的产量时，加入半胱氨酸或者苏氨酸会使其产量增加。此外，本发明人通过使用DNA微阵列的基因表达分析(在向面包酵母中加入苏氨酸时进行)以及使用CE-MS、GC和HPLC的代谢组分析还确认，当加入苏氨酸时，胞内O-乙酰高丝氨酸的含量降低，而且产生在硫酸盐离子同化途径中位于亚硫酸上游的某个中间代谢物的酶基因的表达水平升高了。如上所述，本发明人已验证了上述假说，在生产用底层发酵酵母中硫化氢产量的定速因子是胞内O-乙酰高丝氨酸的含量，在高半胱氨酸合成中，作为底物的是O-乙酰高丝氨酸而不是硫化氢。同时，在生产用底层发酵酵母中通过破坏或类似手段进行处理YNL311C基因、使得在硫酸盐离子同化途径中产生位于亚硫酸上游的中间代谢物的酶增加时，亚石危酸和^5危化氬的产量均增加了。然而，通过这种处理，亚硫酸的产量所受影响更大，因此，亚硫酸的产量比硫化氢的产量增多了。此外，当下述基因的表达增加时，亚硫酸和硫化氬的产量均降低，所述基因位于通过HOM3基因过表达或类似机制从天冬氨酸合成高半胱氨酸的合成途径；然而，通过这种处理，硫化氩的产量所受影响更大，因此，硫化氢的产量比亚硫酸的产量减少了。由此可通过增加碌u酸盐离子同化途径中的酶的方式，在酿酒酵母中增加亚硫酸的产量。此外，可通过增加从天冬氨酸合成高半胱氨酸途径中的酶的方式，在酿酒酵母中增加胞内O-乙酰高丝氨酸的含量并降低硫化氬的产量。总之，联合使用这些方法可以实现在不增加硫化氢产量的同时单独提高亚硫酸产量的代谢控制。关于由终产物引发的反馈抑制的代谢途径，可通过去除反馈抑制来增加代谢量。例如，可通过使终产物无法结合到被终产物所抑制的酶上的突变、代谢途径中酶基因启动子区域的突变、或酶的过量表达来实现这种反馈抑制的去除。本发明人已了解到，如果获得了对作为硫化氬及亚硫酸代谢途径终产物的含硫氨基酸的类似物(例如，如果是曱硫氨酸则为乙硫氨酸)具有抗性的菌林，则含硫氨基酸合成中所涉及的反馈抑制就能得以去除，而硫酸盐离子同化途径中的代谢酶类会被增强，从而可获得作为中间体的亚硫酸及硫化氢含量都增高的菌林。首先，本发明人已获得了乙硫氨酸抗性菌株，然后从乙硫氨酸抗性菌抹中获得了可高水平产生硫化氢、并且在含硝酸铅的琼脂培养皿上表现为红褐色的菌抹。随后，本发明人测定了所获得的可高水平产生硫化氢的菌林所产生的亚硫酸的量，从而获得了可高水平产生亚硫酸及硫化氢的乙硫氨酸抗性菌抹。其次，本发明人考虑对于这抹可高水平产生亚硫酸与硫化氢的菌株，如果通过获得对苏氨酸的类似物——羟基正缬氨酸具有抗性的菌抹来增强从天冬氨酸合成高半胱氨酸的途径，则培养基中的硫化氢含量会降低，最终获得的菌抹将是可高水平产生亚硫酸、但低水平产生硫化氲的菌林。接下来，本发明人获得了能够在含羟基正缬氨酸的培养基上生长的突变林，然后选择在含硝酸铅的琼脂培养皿上形成白色菌落的低水平产生硫化氬的菌抹。随后，本发明人测定了所获得的可低水平产生硫化氢的菌抹所产生的亚硫酸的量，然后选择仍可高水平产生亚硫酸的菌抹。如上所述，通过在两个阶段获得对不同氨基酸类似物具有抗性的菌抹，本发明人设计了一种培养与亲代菌林相比，能够在不增加硫化氢产量的同时单独提高亚硫酸产量的酵母的方法。因此，本发明人使用两种酿酒酵母成功分离到目标突变菌抹。基于上述发现和结果实现了本发明。本发明涉及培养与亲代菌抹相比能够在不增加硫化氢产量的同时增加亚硫酸产量的酵母的方法，它包括在生成硫化氢与亚硫酸的酵母途径中增加从硫酸盐离子合成硫化氢的途径中的代谢量、以及增加从o-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸的途径中的代谢量。在第一个实施方案中，本发明提供了一种培养酵母菌林的方法，它包括控制特定基因的表达水平或该基因产物的活性。具体地，通过增加SUL1、SUL2、MET3、MET14及MET16中一个或多个基因的表达水平，或者提高这些基因产物的活性来增加从疏酸盐离子合成硫化氢途径中的代谢量。而且，通过增加HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17中一个或多个基因的表达水平或者提高这些基因产物的活性、和/或降低THR1和/或THR4基因的表达水平或者这些基因产物的活性，来增加从O-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸的量。从而获得目标酵母菌林。例如，可通过提高MET14基因产物的活性以及增加HOM3基因的表达水平来获得所需的酵母菌抹。此外，可通过基因启动子的突变、增加或降低基因的水平、抑制基因产物和/或调控稳定因素、改变发酵条件、根据培养基条件来增加或者降低基因产物的量或控制特定活性、控制反馈抑制等来控制基因的表达水平或该基因产物的活性。在第二个实施方案中，本发明中的方法包括以下步骤1)在含有含硫氨基酸类似物的含铅平皿上分离出形成红褐色菌落的突变菌抹，2)在所分离到的突变菌抹中选择亚硫酸产量提高的突变菌林，3)在含有苏氨酸类似物的培养基上培养所选择的突变菌林，然后分离可在含铅平皿上形成白色菌落的突变抹，以及4)从所分离到的突变菌抹中选择与亲代菌林相比，亚硫酸产量提高的突变菌林。在上述步骤1)中所用的含硫氨基酸类似物的实例包括乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸以及S-乙基半胱氨酸，所用的苏氨酸类似物的实施例是羟基正缬氨酸。本发明进一步提供了通过本发明中的方法所培养的、与亲代菌抹相比可以在不增加硫化氬产量的同时亚硫酸产量提高的酵母菌抹。期望与亲代菌抹相比，本发明的酵母所产生的亚硫酸的量可以提高到不会损害风味的程度。本发明中酵母菌抹的一个实例是于2006年1月19日以保藏号FERMBP-10486保藏在独立行政法人产业l支术综合研究所特许生物寄托中心(TsukubaCentral6，l國l國lHigashi,Tsukuba,Ibaraki,Japan)的酵母菌抹。本发明进一步提供了使用由本发明的方法所培养的酵母菌林来生产酒类饮料的方法，以及由所述方法生产的酒类饮料。由所述方法生产的酒类饮料与使用亲代菌抹生产的酒类饮料不同，其特征在于只有亚硫酸的含量提高了，而硫化氢的含量没有增加。因此，由本发明中的方法所生产的酒类饮料在保持新鲜度方面非常优异，并且具有高品质o根据本发明的方法，可以培养出在不产生高水平的硫化氢的同时能产生高水平的亚硫酸的酵母。此外，根据本发明，可以通过在2个量的酵母菌抹，^而可根据不同目的5培养不同类型的酵母^另外^使用本发明中的酵母可以在酿造时改进新鲜度保持期，并抑制异味的产生，从而可生产出高品质的酒类饮料。附图的简要描述图1所示的是在面包酵母细胞中含硫氨基酸的代谢途径以及编码每种酶的基因。大的四方框代表酵母细胞。图2所示的是在面包酵母S288C及生产用底层发酵酵母KBY011中天冬氨酸的胞内浓度随时间的变化图。从酵母细胞中提取相当于OD600=30的量的样品悬浮在50jxL水中，通过CE-MS进行分析，然后测定浓度。图3所示的是在面包酵母S288C及生产用底层发酵酵母KBY011中高丝氨酸的胞内浓度随时间的变化图。从酵母细胞中提取相当于OD600=30的量的样品悬浮在50pL水中，通过CE-MS进行分析，然后测定浓度。图4所示的是在面包酵母S288C及生产用底层发酵酵母KBY011中o-乙酰高丝氨酸的胞内浓度随时间的变化图。从酵母细胞中提取相当于OD600=30的量的样品悬浮在50pL水中，通过CE-MS进行分析，然后测定浓度。图5所示的是在面包酵母S288C的培养基中及生产用底层发酵酵母KBY011的培养基中总亚硫酸浓度随时间的变化图。母KBYOll的培养基中硫化氢浓度随时l't的i化图。'—、图7所示的是在面包酵母S288C及生产用底层发酵酵母KBY011中高半胱氨酸的胞内浓度随时间的变化图。从酵母细胞中提取相当于OD600-30的量的样品悬浮在50pL水中，通过CE-MS进行分析，然后测定浓度。图8所示的是在面包酵母S288C及生产用底层发酵酵母KBY011中曱硫氨酸的胞内浓度随时间的变化图。从酵母细胞中提取相当于OD600=30的量的样品悬浮在50pL水中，通过CE-MS进行分析，然后测定浓度。图9所示的是在面包酵母S288C及生产用底层发酵酵母KBY011中苏氨酸的胞内浓度随时间的变化图。从酵母细胞中提取相当于OD600=30的量的样品悬浮在50iiL水中，通过CE-MS进行分析，然后测定浓度。中s-腺普高半胱氨酸的胞内浓度随时间的变化图。一从酵母细胞中提取相当于OD600=30的量的样品悬浮在50水中，通过CE-MS进行分析，然后测定浓度。中S-腺苷曱硫氨酸的胞内浓度随时间的变化图。从酵母细胞中提取相当于OD600=30的量的样品悬浮在50水中，通过CE-MS进行分析，然后测定浓度。中参与甲硫氨酸合成的基因的表达水平随时间的变化图。对于面包酵母，给出了在6、24、48小时测定的S288C中每种基因的表达水平相对于作为对照的S288C中0小时时这些基因表达水平的比率。对于生产用底层发酵酵母，给出了在6、24、48小时测定的KBY011中每种基因的表达水平相对于作为对照的KBYOll中0小时时这些基因表达水平的比率。图13所示的是当加入或者未加入苏氨酸时，在面包酵母S288C中高丝氨酸的胞内浓度随时间的变化图。从酵母细胞中提取相当于OD600-30的量的样品悬浮在50pL水中，通过CE-MS进行分析，然后测定浓度。图14所示的是当加入或者未加入苏氨酸时，在面包酵母S288C中0-乙酰高丝氨酸的胞内浓度随时间的变化图。从酵母细胞中提取相当于OD600=30的量的样品悬浮在50pL水中，通过CE-MS进行分析，然后测定浓度。图15所示的是当加入或者未加入苏氨酸时，面包酵母S288C的培养基中游离亚硫酸的浓度随时间的变化图。图16所示的是当加入或者未加入苏氨酸时，面包酵母S288C的培养基中硫化氢的浓度随时间的变化图。图17所示的是在面包酵母DBY7286和来源于破坏了YNL311C的DBY7286的菌抹中ScMetl4和LgMetl4蛋白的稳定性。图18所示的是在面包酵母SYTOOl的培养基中和来源于破坏了YNL311C的SYTOOl的菌林的培养基中游离亚硫酸的浓度随时间的变化图。图19所示的是在生产用底层发酵酵母KBY001的培养基中及其减数分裂分离子B43的培养基中游离亚硫酸的浓度随时间的变化图。图20所示的是在生产用底层发酵酵母KBY001的培养基中及其减数分裂分离子B43的培养基中硫化氢的浓度随时间的变化图。图21所示的是在通过破坏B43的Lg类型及Sc类型基因所获得的每个菌林的培养基中游离亚硫酸的浓度随时间的变化图。图22所示的是在通过破坏B43的Lg类型及Sc类型基因所获得的菌抹的培养基中硫化氢的浓度随时间的变化图。图23所示的是在通过破坏B43的Lg类型及Sc类型基因所获得的菌抹的含铅培养基中所测得的硫化氢的产量。将琼脂培养基在20。C培养4天。图24所示的是在过表达B43的Lg类型基因的菌林的培养基中游离亚硫酸的浓度随时间的变化图。图25所示的是在过表达B43的Lg类型基因的菌林的培养基中硫化氢的浓度随时间的变化图。图26所示的是在过表达B43的Lg类型基因的菌林的含铅培养基中所测得的硫化氢的产量。将琼脂培养基在20。C培养4天。图27所示的是在含铅培养基中所测得的酿酒酵母VTT-A67025、可高水平产生亚硫酸及硫化氬的乙硫氨酸抗性菌才朱(从VTT-A67025中分离)、以及YM073的硫化氢的产量。将琼脂培养基在20。C培养4天。图28所示的是在酿酒酵母VTT-A67025的培养基中以及在YM073的培养基中游离亚硫酸的浓度随时间的变化图。图29所示的是在酿酒酵母VTT-A67025的培养基中以及在YM073的培养基中硫化氢的浓度随时间的变化图。KBYOOl的、可高水平产生亚硫酸及硫化氩的乙硫氨酸抗性菌林(从KBYOOl中分离)、以及在YMO106的硫化氬的产量。将琼脂培养基在20。C培养4天。图31所示的是在生产用底层发酵酵母KBYOOl的培养基中以及在YMO106的培养基中游离亚硫酸的浓度随时间的变化图。图32所示的是在生产用底层发酵酵母KBYOOl的培养基中以及在YMO106的培养基中硫化氬的浓度随时间的变化图。图33所示的是制备破坏了B43菌抹中的YNL311C的菌抹的方法，以及通过PCR对每个基因破坏进行确认的结果。图34所示的是在B43菌林的培养基中以及在YM03113菌抹的培养基中游离亚硫酸的浓度随时间的变化图。图35所示的是在含铅培养基中所测得的B43菌林、来自破坏了YNL311C的B43菌株的菌抹、以及来自破坏了YNL311C的B43菌抹并过表达ScH0M3基因的YM03113菌抹的硫化氢的产量。将琼脂培养基在20。C培养4天。本说明书包括了在作为本申请优先权文件的日本专利申请No.2006-15278中所述的部分或全部内容。发明的优选实施方案本发明的目的是通过在酵母硫化氬及亚硫酸代谢途径中增加从硫酸盐离子合成硫化氢途径的代谢量以及增加从0-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸途径的代谢量，来培养与亲代菌抹相比，仅使亚硫酸的产量提高而不使硫化氢的产量提高的酵母。用于改变具体合成途径的代谢量的一般方法的实例包括包含分离出代谢途径所涉及基因的突变抹的方法；及包含利用基因工程技术过表达或者破坏参与代谢途径的基因的方法。因此，下面将对通过基因工程来获得目标酵母的方法以及通过分离突变林来培养目标酵母的方法逐一进4于详细介绍。1.通过基因工程培养酵母的方法在本发明的第一个实施方案中，通过控制或者使用特定基因的表达作为指示来获得亲代菌林相比仅使亚硫酸产量提高而不使硫化氢的产量提高的酵母。上述方法包含以下两个阶萃殳通过提高SUL1、SUL2、MET3、MET14及MET16基因的表达水平或者这些基因产物的活性来获得从硫酸盐离子合成硫化氢途径的代谢量增加的酵母菌抹(第一个阶段)；以及通过提高HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17基因的表达水平或者这些基因产物的活性、和/或降低THR1和/或THR4基因的表达水平或者降低这些基因产物的活性来获得从O-乙酰高丝氨酸合成的高半胱氨酸的量增加的酵母菌林(第二个阶段)。SUL1、SUL2、MET3、MET14及MET16基因编码参与从硫酸盐离子生成硫化氢途径的酶。因此，如果这些基因可高水平表达或者这些基因所编码的酶的活性提高，则可以预期亚硫酸与硫化氢的合成途径的代谢量会增加(参见图1)。HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17基因编码参与从天冬氨酸合成高半胱氨酸途径的酶。可以期望通过增加HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17基因的表达水平或者提高其酶活性，从而增加从O-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸的量(参见图1)。同时，THR1和THR4基因编码参与从高丝氨酸生成苏氨酸途径的酶。可以期望通过降低THR1和THR4的表达水平或者其酶活性来增加从0-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸的量(参见图1)此外，可通过基因启动子的突变、增加或降低基因的水平、抑制基因产物和/或调控稳定因素、改变发酵条件、根据培养基条件来增加或者降低基因产物的量或控制特定活性、控制反馈抑制等来控制基因的表达水平或该基因产物的活性。本发明人证实了HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17基因被破坏的酵母菌林可以高水平产生硫化氬。而且，当与Metl4降解相关的因子——YNL311C基因在酿酒酵母中被破坏时，会稳定Metl4基因产物，从而增加了硫酸盐离子同化途径中的酶量、增加了亚硫酸的产量、并增加了硫化氢的产量。随后，当在YNL311C基因被破坏的菌抹中HOM3基因过表达时，从天冬氨酸合成高半胱氨酸途径中的酶的水平也同时提高了。因此，可获得与亲林相比不改变硫化氢产量的同时能使亚硫酸产量提高的酵母。如上所述，可通过基因工程，具体地，通过培养下述酵母菌林的方式来获得目标酵母菌抹，所述酵母菌抹中从硫酸盐离子合成硫化氢途径的代谢量增加、并且从O-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸的量也增加。此外，上述基因SUL1、SUL2、MET3、MET14和MET16、以及HOM3、HOM2、HOM6、MET2、MET17、THR1和THR4基因的正式名称与GenBank登录号如下所示。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>这些基因中的每一个基因均可用于筛选可产生低水平硫化氢及高水平亚硫酸的酵母，特别地，可用作预测酵母中从硫酸盐离子合成硫化氢的途径以及从0-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸的量的标记物。2.通过分离突变抹进行酵母育种的方法在本发明的第二个实施方案中，通过分离突变抹的方法来获得与亲代菌林相比亚硫酸产量提高而硫化氢产量不提高的酵母。上述培养方法包含下述2个阶段及4个步骤(1)获得可高水平产生硫化氢的、具有含硫氨基酸类似物抗性的菌林，(2)从中选择可高水平产生亚硫酸的菌林(第一个阶段)；以及(3)获得具有苏氨酸类似物抗性的菌抹，其中由于增强了高半胱氨酸合成途径从而使得硫化氢的代谢量高；(4)从中选择可高水平产生亚硫酸的菌林(第二个阶段)。在第一个阶段，通过获得对作为硫化氩及亚硫酸代谢途径终产物的含硫氨基酸类似物具有抗性的菌抹，可以解除参与含硫氨基酸合成的反馈抑制，从而获得作为中间物的亚硫酸与硫化氬的含量均增加的菌林。可通过下述方法获得对含硫氨基酸类似物具有抗性、并且可高水平产生硫化氢的菌抹。具体地，在合适的液体培养基中培养酵母，通过离心等手段获得酵母菌体，然后在含有含硫氨基酸类似物、葡萄糖、无机氮源、维生素、无机盐、硝酸铅及琼脂的培养基(下文中均称之为含有含硫氨基酸类似物的铅基本培养基)中培养酵母。将所获得的红褐色菌落在含有硝酸铅、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、硫酸铵及琼脂的培养基(下文中均称之为含硝酸铅的培养基)中进行单菌落分离，/人而分离并选4奪红褐色菌落。优选地，对这种分离过程重复3次或以上。培养在含硝酸铅的培养基中具有良好增殖率的可形成红褐色菌落的菌林。将表现出良好增殖的菌抹在合适的液体培养基中进行厌氧振荡培养。选择比亲代菌抹可产生更多硫化氳及亚硫酸的菌抹作为可高水平产生亚硫酸及硫化氢、并且对含硫氨基酸类似物具有抗性的菌抹。在本说明书中，"含硫氨基酸"是指在酵母细胞中所含的含硫氨基酸，譬如甲硫氨酸或者半胱氨酸。"含硫氨基酸类似物"是指含硫氨基酸的结构类似物，它通常是酵母细胞中所没有的，包括但不限于，譬如乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸或者S-乙基半胱氨酸。因为酵母对含硫氨基酸类似物的抗性会因目标酵母菌抹而异，故培养基中所含的含硫氨基酸类似物的使用浓度没有特别的限定，推荐当乙硫氨酸是DL-乙硫氨酸时，为2.5mg/ml或者更多，优选地，在5mg/ml到20mg/ml范围之间。在含乙硫氨酸的铅培养基中，除了乙硫氨酸之外的其它培养基组分没有特别的限制，只要培养基是不含氨基酸的合成培养基即可。例如，完全可以使用已商品化的合成培养基，譬如通过向0.17%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)中添加0.5%硫酸铵、2%葡萄糖、0.1%硝酸铅及2%琼脂而制备的培养基。在含有含硫氨基酸类似物的铅基本并没^特:的限制。、通常:例如，i荐在口20。C维持约1。天的需氧条件。例如，可通过使用含有硝酸铅的琼脂培养基对硫化氬的产量进行目测。具体地，当被测酵母菌抹生成硫化氢时，硫化氬可与培养基中的硝酸铅反应，在菌落周围生成硫化铅，菌落的颜色会变成红褐色。通过从中选择红褐色的菌落可以获得可高水平产生硫化氢的菌抹。通过从中选择淡褐色到白色的菌落可以获得低水平产生硫化氢的菌林(G.J.CostandJ.D.Boeke，Yeast,Vol.12,p.939-941,1996)。此外，用于获得酵母细胞的培养基没有特别的限制，只要酵母可以生长、可以获取酵母细胞即可。优选地，使用YPD10(l。/。酵母提取物、2%蛋白胨及10%葡萄糖)。培养温度也没有限制，只要酵母能够生长即可。推荐的温度通常在18。C到25。C之间，优选地为20°C。使用液体培养基进行培养的方法也没有特别的限制，可以是静置培养或者振荡培养。用于收集生长在液体培养基中的生物体的方法也没有特别的限制，通常通过约3000rpm的离心收集生物体。在此时，需要用无菌水对所获得的细胞清洗一次或多次。在第二个阶段，通过从可高水平产生亚疏酸及硫化氢的菌抹中获得对苏氨酸类似物具有抗性的菌抹，可获得其中从天冬氨酸合成高半胱氨酸的途径增强的、可低水平产生硫化氬的菌林(即，在硫化氢代谢中的限速步骤被取消了)。通过下述方法可获得生长在含有苏氨酸类似物的基本培养基上的、低水平产生硫化氢的菌林。具体地，在合适的液体培养基中培养酵母，通过离心等手段获得酵母菌抹，然后在含有苏氨酸类似物、葡萄糖、无机氮源、维生素及无机盐的培养基(下文中称之为含有苏氨酸类似物的基本培养基)中培养酵母。在本说明书中，"苏氨酸类似物"是指苏氨酸的结构类似物，它通常是活酵母细胞中所没有的，包括但不限于羟基正缬氨酸。随后，使用含有硝酸铅的琼脂培养基从所获得的具有苏氨酸类似物抗性的酵母中选择专门抑制硫化氬产量的菌林。如上所述，当被测酵母菌林生成硫化氢时，硫化氢可与培养基中的硝酸铅反应，在菌落周围生成硫化铅，菌落的颜色会变成红褐色。通过从中选择白色的菌落可以选出低水平产生硫化氢的目标菌抹。对于含有硝酸铅的培养基，可以使用含有0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%硫酸铵、0.1%硝酸铅及2%琼脂的培养基(下文中称之为含硝酸铅的琼脂培养基)。在含硝酸铅的琼脂培养基上培养酵母的条件没有特别的限制，只要酵母可在此条件下生长即可。通常，在18。C到25°C培养酵母4到8天。优选地，推荐在20。C的有氧条件下培养5天。优选地，在含硝酸铅的培养基中进一步培养所获得的可形成白色菌落的酵母菌抹3次或更多次，然后选择生长良好的酵母菌抹。随后，使用合适的液体培养基进行厌氧振荡培养。选择与亲代相比在不产生更多硫化氢的同时可产生更多亚硫酸的菌抹作为目标酵母菌抹。这样即可分离到在含有含硫氨基酸类似物的含铅平皿上可形成红褐色菌落的突变林。从中选择可高水平产生亚硫酸的菌林(第一个阶段)。然后在含有苏氨酸类似物的基本培养基中培养菌抹，分离在含铅平皿上形成白色菌落的突变菌林，测定所获得的低水平产生硫化氢的菌林所产生的亚硫酸产量，然后选择可维持高产亚硫酸的能力的菌才朱(第二个阶段)。从而，可培养出目标酵母。3.酒类饮料的酿造通过本发明方法所获得的酵母菌抹与已知酵母相比较，可在更高水平产生对于酿造过程中保持新鲜度非常重要的亚硫酸，同时，它可低水平产生作为导致异味的原因之一的硫化氢。因此，使用本发明中的酵母菌林通过酿造所获得的酒类饮料具有良好的风味且品质优异。特别地，本发明还提供了使用本发明中的酵母菌抹来生成酒类饮料的方法，以及通过这种方法所生成的酒类饮料。使用本发明中的酵母所酿造的"酒类饮料"的实例包括啤酒、发泡酒以及其它混合饮料及葡萄酒。啤酒是通过向从麦芽所制备的糖溶液中加入啤酒花的苦味、然后用酵母进行发酵与熟化所生成的具有相对较低酒精含量的澄清发泡饮料。发泡酒是指使用麦芽作为部分原材料所生产的属于酒类饮料的混合发泡液体。其它混合饮料是指使用除麦芽以外的原材料通过酵母发酵与熟化所生产的酒类饮料。葡萄酒是使用葡萄作为原材料通过酒精发酵所生产的饮料。生产酒类饮料的方法包括，例如以啤酒为例，从大麦中生产麦芽原材料的麦芽制造步骤、从麦芽中生成麦芽汁的麦芽汁制造(W/bmO步骤、通过酵母进行酒精发酵的发酵步骤及随后的熟化、以及将所生产的啤酒进行过滤及包装的包装步骤。关于产生酒类饮料的方法的细节，请参见FermentationHandbook(KYORITSUSHUPPANCO.,LTD,supervisionofShinrokuroTochikura,HideakiYamada，TeruhikoBeppu,andKenjiSouda)。例如，可通过下述方法对酒类饮料中的硫化氢进行定量。具体地，对所获得的酿造饮料进行取样，在小瓶中使硫化氢气化，然后使用硫化学发光检测器(SCD)通过气相色谱对小瓶中液面上空间中的硫化氬进行定量(A.K.Vickers，J.EllisandC.George,GulfCoastConference,Poster#75)。依所用的亲代菌抹的不同本发明中在第一天对硫化氢的产量进行比较，或者在第二天进行相同比较(在检验开始后)。此外，例如可通过下述方法对酒类饮料中的亚硫酸进行定量。具体地，对所获得的酿造饮料进行取样，之后过滤除去微生物。然后将产物与甲醛反应，从而获得稳定的羟基曱磺酸。将产物注射入HPLC,P逸后通过片主后焚光监观J(ShimadzuCorporationApplicationNews,No.L258)对荧光进行监测和定量。依所用的亲代菌抹的不同本发明中在第二天对亚硫酸的产量进行比较，或者在第三天进行相同比较(在检验开始后)。使用作为原材料的哞酒麦芽汁，以及含硫氨基酸类似物抗性菌抹、含硫氨基酸类似物抗性且对苏氨酸类似物抗性菌抹、及其亲代菌林来进行哞酒酿造。比较这些啤酒中的硫化氢浓度。结果，在使用KBYOl1(酿酒酵母)酿造的啤酒中检测的游离亚硫酸为14.7ppm(50小时后)，而在基于乙硫氨酸抗性及羟基正缬氨酸抗性所选择的突变菌林(通过上述方法获得)中游离亚硫酸的水平为39.2ppm(50小时后)。而且，亲代菌抹与每个突变菌抹之间在硫化氬的产量上没有观测到显著性差异。实施例下面将通过参考实施例进一步详细描述本发明。但本发明不受这些实施例的限制。l.用于建立假说的发现对于可高产亚硫酸及硫化氲的底层发酵酵母以及亚硫酸及碌u化氢产量低的面包酵母在相同条件下进行了发酵检验。分析每个样品中的基因表达水平与代谢水平，以揭示处于表达控制下的位点，并识别代谢瓶颈的位置。为了说明在生成亚硫酸及硫化氬途径中的限速步骤进行了下面的实验。将生长在添加了2%琼脂的YPD琼脂培养基上的生产用底层发酵酵母巴斯德酵母(51.;aWon'a""s)KBY011菌林(由KirinBreweryCompany的菌抹保藏获得)或者面包酵母酿酒酵母(<S.cwecWWae)S288C菌4朱(由KirinBreweryCompany的菌才朱保藏获得，H.Takagietal.,J.Bacteriol.Vol.182,p.4249-4256，2000)的单菌落，每个均接种到5mLYPD液体培养基中，然后在20。C培养1天。将每个培养液接种到500mLYPD10(1%酵母提取物、2%蛋白胨及10%葡萄糖)中，然后在20。C进行有氧振荡培养3天。离心(3000rpmx5分钟)培养液，获得酵母菌体部分，之后将其悬浮在无菌水中。将酵母菌抹(0.5%(w/v))接种到含有0.4%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.2%硫酸铵、10%葡萄糖的液体培养基(下文中称之为SD基本培养基)中，然后在20。C进行厌氧振荡培养3天以制备酵母醪。于20。C在含有1000mLSD基本培养基的1000mL瓶中对酵母醪(0.5%(w/v))进行厌氧振荡培养以进行发酵。在培养起始后的0、6、12、22、46、70、94、118、142及166小时共10个时间点上取样。测定细胞浓度(OD)、糖消耗(通过培养液密度测量来获得)、亚硫酸的产量及硫化氢的产量。对于相同的样品，使用CE-MS进行代谢组分析、使用HPLC进行氨基酸分析、使用DNA微阵列进行基因表达分析。结果如图2至11所示。通过底层发酵酵母与面包酵母间代谢物的比较，发现代谢物可以前者中的代谢物包括硫化氢、高半胱氨酸、S-腺苷曱硫氨酸等。此外，发现后者中代谢物的浓度，譬如高丝氨酸和o-乙酰高丝氨酸，在底层发酵酵母中比酿酒酵母中要低。基于这些结果可以认为底层发酵酵母高产亚硫酸及硫化氢的能力高是因为在作为生成高半胱氨酸底物的o-乙酰高丝氨酸与硫化氢之间，由于o-乙酰高丝氨酸的浓度低，硫化氢未被使用所以累积起来。此外，比较了底层发酵酵母与面包酵母间的基因表达水平。在硫基化合物的代谢途径中，观察到MET16、METIO、HOM3及MET2基因的表达模式存在差异。结果如图12所示。基于这些结果可以确认在底层发酵酵母与面包酵母中代谢物的瓶颈存在于从高丝氨酸到O-乙酰高丝氨酸的途径上；在MET16、METIO、HOM3及MET2基因中观察到基因表达调控的差异。因此，可通过使用CE-MS的代谢组分析以及使用DNA微阵列的基因表达分析来确认底层发酵酵母与面包酵母中的代谢瓶颈及基因表达调控中的差异。根据上述发现，建立了一个假说在底层发酵酵母与面包酵母中代谢物的瓶颈是O-乙酰高丝氨酸，生成硫化氢的限速因子是O-乙酰高丝氨酸。此外，如在MET14过表达中所示，可以知道通过增加参与合成亚硫酸的代谢途径的基因来提高亚硫酸的产量。所以认为从硫酸盐离子到亚硫酸的代谢量在调控亚硫酸生成方面是很重要的(U.E.B.DonaliesandU.Stahl，Yeast,Vol.19,p.475-484,2002)。2.假说的验证为了证明是否O-乙酰高丝氨酸是生成硫化氢过程中的限速因子，进行了向面包酵母中添加或者不添加苏氨酸的发酵检验。在基因表达水平及代谢水平对所获得样品进行了分析。具体地，进行了下面的实验。将生长在添加了2%琼脂的YPD琼脂基本培养基上的面包酵母S.cera:WWaeS288C的单菌落接种到5mLYPD液体培养基中，然后在20。C培养1天。将培养液接种到4000mLYPD10(1%酵母提取物、2%蛋白胨及10%葡萄糖)中，然后在20。C进行有氧振荡培养3天。离心(3000rpmx5分钟)培养液。获得酵母菌体组分，之后将其悬浮在无菌水中。将酵母(0.5%(w/v))接种到含有0.4%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.2%硫酸铵、10%葡萄糖的液体培养基(下文中称之为SD培养基)中，然后在20。C进行厌氧振荡培养3天以制备酵母醪。于20。C在含有4500mLSD基本液体培养基的5000mL瓶中对酵母醪(0.5%(w/v))进行厌氧振荡培养以进行发酵。在培养起始后的0、6、24及48小时共4个时间点上进行取样。测定细胞浓度(OD)、糖消耗(通过培养液密度测量来获得)、亚硫酸的产量及硫化氢的产量。对于相同的样品，使用CE-MS进行代谢组分析、使用HPLC进行氨基酸分析、使用DNA微阵列进行基因表达分析。结果如图13至16及表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表2给出了在添加苏氨酸的实验中与作为对照的0时刻(在添加苏氨酸之前)酵母的表达水平相比较，在6、24和48小时表达水平增加了2倍或更多的基因的数目与名称、通过比较6次测量所得的表达水平数据的平均值以及标准差。编码甲硫氨酸转运蛋白的MUP1基因的表达与编码水解苏氨酸的酶的CHA1基因的表达在添加苏氨酸后的48小时内一直都受到诱导。在其它方面，参与曱硫氨酸合成的一组基因(MET5、MET14、MET17、MET3和MET32)在添加苏氨酸后24小时受到诱导，但其表达在6小时及48小时时没有诱导。观察到硫化氢的生成模式在24小时时达到最高，对曱硫氨酸合成基因表达的诱导与生成的硫化氢的量一致(在二者之间观察到相关性)。此外，O-乙酰高丝氨酸的量在6小时时达到最大，其峰比代表硫化氢产量的峰出现的要早一些。这个结果与底层发酵酵母与面包酵母间相互比较的实验结果相一致。上述结果表明，当加入苏氨酸时，减少了细胞内o-乙酰高丝氨酸的量，增加了硫化氢的产量。因此，获得了支持假说的结果。面包酵母有大约6000个基因。已经通过基因破坏技术制备了完备的基因破坏菌抹。OPENBIOSYSTEMS已经将其中任一基因被破坏的一系列酵母菌抹市场化。为了分离到可在含铅琼脂培养基上形成红褐色菌落的高产硫化氢的突变菌林，使用以BY4742为亲代菌林所制备的一系列非必需基因被破坏的大约5000个菌林来进行全面筛选。从而，鉴定了其中hom3、hom2、hom6、met2、metl7和ynl311c分别被破坏的菌林。HOM3、HOM2、HOM6、MET2和MET17基因均参与O-乙酰高丝氨酸代谢或合成。已表明O-乙酰高丝氨酸的合成与硫化氢产量有密切联系。如使用酵母双杂交系统所进行的详尽分析所揭示的那样，已有YNL311C基因可与MET14基因相互作用的报道(P.Uetzetal.，Nature,Vol.403,p.623-627,2000)。Ynl31lc与哺乳动物Fbox蛋白SKP2具有同源性，表明其参与细胞内蛋白的泛素化。本发明中发现Ynl311c与Metl4蛋白的稳定性相关，在YNL311C被破坏的菌林中Metl4蛋白是稳定的。具体地，将其中5，末端添加了c-Myc抗原决定簇的ScMET14基因或者LgMET14基因连接到pYES2.0的半乳糖诱导启动子的下游，从而构建表达质粒。将每个质粒转入到尿嘧啶营养缺陷的面包酵母DBY7286(H.Yoshimotoetal.,J.Biol.Chem.，Vol.277，p.31079-31088，2002)中。于30。C在含有0.67%YeastNitrogenBasew/oAminoAcids及10%半乳糖的20ml液体培养基(下文中称之为含有半乳糖的基本培养基)中进行有氧振荡培养1天。离心(3000rpmx5分钟)培养液。获得酵母菌体组分，之后悬浮在含有0.67%yeastNitrogenBasew/oAminoAcids及10%葡萄糖的液体培养基(下文中称之为含有葡萄糖的基本培养基)中。随后于30。C进行有氧振荡培养12.5小时，然后取样。离心(3000rpmx5分钟)每次取样时的培养基。获得酵母菌体组分，并将其悬浮在SDS-PAGE上样緩冲液中。将等体积的悬浮液进行SDS-PAGE电泳，然后转移到PVDF膜上。随后，使用抗c-Myc抗体(Sigma,单克隆抗体)通过Western印迹来确认ScMetl4和LgMetl4蛋白的稳定性。结果如图17所示。基于这些结果可以确认，YNL311c净皮石皮坏的菌4朱与过表达MET14基因的菌才朱表现出相同的效应。在含有0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、10%葡萄糖及0.02%硫酸铵的培养基中对野生型面包酵母SYT001菌抹(通过用野生型面包酵母URA3基因片段转化具有尿嘧啶营养缺陷的ura3突变的DBY7286而制备的URA3+菌林)和其中YNL311C基因被破坏的菌抹(通过将G418抗性标记基因插入到SYT001来破坏YNL311C基因而制备的菌林)进行厌氧振荡培养。使用HPLC来测量所得到的硫化氬产量。结果如图18所示。可以确认菌林(ynl311c破坏林)除了硫化氢外还可以高产亚硫酸。具体地，对这个通过筛选基因破坏的面包酵母菌抹所分离到的菌抹(ynl31lc破坏抹)进行的分析结果并不与"硫化氢生成的限速因子是O-乙酰高丝氨酸"这个假说相矛盾。相反，它们支持了"在硫化氢生成调控中从硫酸盐离子到亚硫酸的代谢量是至关重要的"这个事实。3.用于建立培养突变菌抹的方法的发现底层发酵酵母具有异源多倍性，即，它是由约含有各两套Sc型及Lg型基因的基因簇所组成的四倍体。由于在底层发酵酵母中进行完全基因破坏需要破坏掉4个基因，所以制备其中某个基因被完全破坏的菌抹是很困难的。因此，使底层发酵酵母进行减数分裂，然后选择与亲代菌抹具有类似性质的减数分裂分离抹，从而获得用于制备后续基因破坏菌4朱的亲代菌抹。从而，从KBYOll中选出了与KBY011具有相似亚硫酸及硫化氩产量的、作为减数分裂分离抹的B43。结果如图19和20所示。然后，使用B43制备hom3、thrl、metl7、ynl311c破坏才朱。关于基因破坏菌抹的制备，对HOM3、THR1、MET17及YNL311C基因的Lg型基因LgHOM3、LgTHRl、LgMET17及LgYNL311C基因进行了全长克隆。为了克隆这些基因，对其中已插入KBYOll来源的基因组DNA的粘粒(其中克隆两端的核苷酸序列已确定)基于每个Sc型基因的序列进行同源性检索。从而鉴定出含有全长的每种基因的粘粒克隆。随后，测定这种粘粒克隆中的核普酸序列。然后基于序列信息设计引物通过PCR来分离全长的各个基因。这些基因编码区的核苷酸序列分别如SEQIDNOs:1到4所示。关于基因破坏菌抹的制备，通过向基因编码区插入G418抗性标记来破坏Sc型基因；通过向基因编码区插入杀稻瘟菌素S抗性标记来破坏Lg型基因。通过使用YPD10培养基的厌氧振荡培养来测定这些菌抹中亚硫酸与硫化氩的产量。此外，也测定在含铅培养基中的硫化氩产量。结果如图21到23所示。与亲代菌林B43相比较，hom3、metl7、ynl311c破坏抹其亚硫酸及碌"匕氢的产量均有所增加。然而，ynl311c石皮坏才朱与其它两个石皮坏冲朱相比较，硫化氢产量仅略有提高。使用B43制备分别过表达LgHOM3、LgTHRl和LgMET17基因的菌林。为了构建用于过表达的质粒，用连接有可赋予G418抗性的标记基因的面包酵母来源的PGK启动子替代pYES2.0(Invitrogen)的半乳糖诱导启动子，并在pYES2.0A^eI剪切位点插入含有酵母来源的GAP启动子的表达盒及一个PGK终止子。从而构建了用于在酵母中过表达目标基因的质粒(pYES2-PGK-G418)。将全长的LgHOM3、LgTHRl和LgMET17基因分别插入到pYES2-PGK-G418的表达盒位点，从而构建了用于过表达各基因的质粒。通过使用含有300pg/mlG418的YPD培养基的厌氧振荡培养来分别测定4吏用质粒所制备的过表达LgHOM3、LgTHRl和LgMET17基因的菌抹中亚硫酸与硫化氢的产量。此外，也在400pg/mlG418的含铅琼脂培养基中测定硫化氬的产量。结果如图24到26所示。发现在过表达LgHOM3基因和LgMET17基因的菌林中硫化氬的产量显著降低，亚硫酸的产量也有所下降。在过表达LgTHRl基因的菌林中，硫化氢的产量增加，亚硫酸的产量也略有上升。基于上述基因破坏菌林及基因过表达菌林的结果表明，在硫基化合物的代谢控制中，过表达参与从天冬氨酸到高半胱氨酸生物合成系统的基因会显著影响硫化氢的产量，过表达参与从硫酸盐离子到硫化氬还原过程的基因会显著影响亚硫酸的产量。根据上述有关硫化氢及亚硫酸在酵母代谢途径中的发现，我们认为通过增加从硫酸盐离子合成硫化氢途径中的代谢量以及增加从0-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸途径中的代谢量，能培养出与亲代菌抹相比，在不增加硫化氢产量的同时可使亚硫酸的产量提高的酵母。因而，本发明人进行了下面实施例1到3中所示的试验，其中包括了对假说的验证。实施例1通过下述方法从生产用底层发酵酵母VTT-A69025菌林(由KirinBreweryCompany的酵母库获得)获得DL-乙硫氨酸抗性菌抹。具体地，将生长在添加了2%琼脂的YPD琼脂培养基上的VTT-A69025的单菌落接种到5mLYPD液体培养基中，然后在20。C培养3天。离心(3000rpmx5分钟)培养基，获得酵母菌体组分。向细胞部分加入10mL无菌水，将产物充分振荡，然后离心产物再次获得酵母菌体组分。重复此过程以洗涤酵母细胞。将清洗后的酵母细胞沉淀悬浮在5mL无菌水中。用150pL悬浮液涂布添加了10mg/mLDL-乙硫氨酸、0.17%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸铵、2%葡萄糖、0.1%硝酸铅及2%琼脂的琼脂培养基。在小Petri平皿中的琼脂培养基涂布2xl()S个酵母细胞。于20。C培养10天后，平均可获得200个具有乙硫氨酸抗性的菌落。共用了约5.8xl0"个酵母细胞，所以获得了654个红褐色的具有乙硫氨酸抗性的菌落。使用添加了0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%疏酸铵、0.1%硝酸铅及2%琼脂的含硝酸铅琼脂培养基以及添加了10mg/mLDL-乙硫氨酸、0.17%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸铵、2%葡萄糖及2%琼脂的含乙硫氨酸琼脂培养基来培养获得的菌落。获得了162个可高水平产生硫化氬的DL-乙硫氨酸抗性的菌林。经单菌落分离后，将其在含有硝酸铅的琼脂培养基及含有乙硫氨酸的琼脂培养基上培养，选出了43个可高水平产生硫化氢的DL-乙硫氨酸抗性的菌林。这些菌才朱在含有DL-乙辟b氨酸的琼脂培养基上具有良好的增殖率，并且在含有硝酸铅的琼脂培养基上可形成代表具有高硫化氢产量的红褐色菌落。使用YPD10液体培养基测定所获得的43个可高水平产生硫化氢的DL-乙硫氨酸抗性的菌林中IO林的硫化氢及亚硫酸的产量，并将其亚硫酸的产量与亲代菌林的亚硫酸产量进行比较。具体地，将包括亲代菌抹在内的酵母菌抹从琼脂培养基上接种到YPD10液体培养基中，然后于20。C进行有氧振荡培养3天。离心(3000rpmx5分钟)培养基。获得酵母菌体组分，然后悬浮在无菌水中。再次将酵母(0.5%(w/v))接种到YPD10液体培养基中，然后于2(TC进行厌氧振荡培养3天，以制备酵母醪。于20。C在含有200mLYPD10液体培养基的250mL瓶中对酵母醪(0.5%(w/v))进行厌氧振荡培养以进行发酵。在培养起始后的第三天使用HPLC测定培养基中亚硫酸的产量。从这些受检菌林中选出3个表现出极高亚硫酸产量的菌林(YM012、YM0222及YM0433菌林)，然后再进行类似的厌氧振荡培养。此时，除了亚硫酸产量外，还测定细胞浓度(OD)与糖消耗(通过培养液密度测量来获得)，以检查发酵过程。此外，也使用GC测定硫化氢的产量。基于上述结果，确认了YM012、YM0222及YM0433菌抹具有乙硫氨酸抗性，并能够高水平产生亚硫酸与硫化氢。随后，根据下述方法从YM0222菌抹中获得了低水平产生硫化氬的DL-羟基正缬氨酸抗性的菌抹。将生长在添加2%琼脂的YPD琼脂培养基上的YM0222单菌落接种到5mLYPD液体培养基中，然后于20。C培养3天。离心(3000rpmx5分钟)培养基，随后获得酵母菌体组分。向各组分加入10mL无菌水后，将产物充分振荡，然后再次离心从而获得酵母菌体组分。重复此过程以洗涤酵母细胞。将所获得的(清洗后的)酵母细胞沉淀悬浮在5mL无菌水中，然后将100nL产物加入到5mL添加100mg/mLDL-羟基正缬氨酸、0.17%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸铵及2%葡萄糖的培养基中。于25。C进行5天有氧培养。将每个培养液稀释10000倍后，用100pL稀释液涂布含有0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%硫酸铵、0.1%硝酸铅及2%琼脂的含硝酸铅琼脂培养基。用1.5xl()S个酵母细胞涂布小Petri平皿中的琼脂培养基。于20。C培养7天后，平均可获得1到2个淡褐色菌落。一共涂布了约1.4><105个酵母细胞，所以获得了172个淡褐色菌落。将获得的菌落再次涂布含硝酸铅的琼脂培养基。确认了所获得的菌落形成了淡褐色菌落。分离单菌落后，将其在含硝酸铅的琼脂培养基上培养，选出了41个低水平产生硫化氢的菌林。这些菌抹在含硝酸铅的培养基上形成了代表低硫化氬产量的淡褐色菌落，并具有良好的增殖率。从所获得的低水平产生硫化氢的DL-乙硫氨酸抗性、DL-羟基正缬氨酸抗性菌林中选出13个菌林。使用YPD10液体培养基测定亚硫酸的产量，然后与亲代菌林的亚硫酸产量进行比较。此处所用培养方法如下所述。具体地，将包括亲代菌抹在内的酵母菌林从琼脂培养基上接种到YPD10液体培养基中，然后于2(TC进行3天有氧振荡培养。离心(3000rpmx5分钟)培养基。从而获得酵母菌体组分，然后悬浮在无菌水中。再次将酵母(0.5%(w/v))接种到YPD10液体培养基中，然后于20。C进行4天厌氧振荡培养，以制备酵母醪。于20。C在含有200mLYPD10液体培养基的250mL瓶中对酵母醪(0.5%(w/v))进行厌氧振荡培养以进行发酵。在培养起始后的第三天使用HPLC测定培养基中亚硫酸的产量。使用YPD10液体培养基对受检菌抹中表现出极高亚硫酸产量的YM073菌抹以及VTT-A69025菌抹(亲代菌林)再次进行类似的厌氧振荡培养。比较亚硫酸与硫化氢的产量。此处所用培养方法如下所述。具体地，将包括亲代菌林在内的酵母菌抹从琼脂培养基上接种到YPD10液体培养基中，然后于2(TC进行3天有氧振荡培养。离心(3000rpmx5分钟)培养基。从而获得酵母菌体组分，然后悬浮在无菌水中。将酵母(0.5%)接种到500mLYPD10液体培养基中，然后于20。C进行4天厌氧振荡培养，以制备酵母醪。随后于20。C在含有500mLYPD10液体培养基的500mL瓶中对酵母醪(0.5%)进行厌氧振荡培养以进行发酵。此时，除了检测亚硫酸产量外还检测发酵过程，比较细胞数目上的变化，并通过测定细胞培养液密度的变化来比较糖的消耗。在培养起始后的第三天使用HPLC测定培养基中亚硫酸的产量。此外，使用GC测定硫化氢的产量。上述实验重复3次，其中一个示例的结果如图27到29所示。通过上述结果表明，具有乙硫氨酸抗性及羟基正缬氨酸抗性的突变菌抹——YM073菌株，产生硫化氢的能力降低了，产生亚硫酸的能力却增强了。该YM073菌抹于2006年1月19日以保藏号FERMBP-10486保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(TsukubaCentral6,1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki,Japan)。实施例2通过以下方法从生产用底层发酵酵母KBY011菌林中获得DL-乙硫氨酸抗性的菌林。具体地，将生长在添加2%琼脂的YPD琼脂培养基上的KBYOll的单菌落接种到5mLYPD液体培养基中，然后在20。C培养3天。离心(3000rpmx5分钟)培养基，获得酵母菌体组分。向每部分加入lOmL无菌水后，将其充分振荡并再次离心，以获得酵母菌体组分。重复此过程以洗涤酵母细胞。将所获得的(清洗后的)酵母细胞沉淀悬浮在5mL无菌水中，然后用200nL悬浮液涂布添加了10mg/mLDL-乙硫氨酸、BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸铵、2%葡萄糖、0.1%硝酸铅及2%琼脂的琼脂培养基。用2xl06个酵母细胞涂布小Petri平皿中的琼脂培养基用来培养，然后于20°C培养细胞14天。从而，平均获得了200个具有乙硫氨酸抗性的菌落。一共涂布了约1.4><108个酵母细胞，所以获得了14个具有乙硫氨酸抗性的红褐色的菌落。使用添加了0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%硫酸铵、0.1%硝酸铅及2%琼脂的含硝酸铅的琼脂培养基以及添加了10mg/mLDL-乙硫氨酸、0.17%BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸铵、2%葡萄糖及2%琼脂的琼脂培养基来培养获得的菌落。确认了所获得的菌抹是可高水平产生硫化氬的DL-乙硫氨酸抗性菌抹。随后，对14个菌抹进行单菌落分离后，将其接种在含硝酸铅的琼脂培养基及含乙硫氨酸的琼脂培养基上。从而选出了13个可高水平产生碌u化氢并具有DL-乙硫氨酸抗性的菌林。这13个菌冲朱在含DL-乙碌u氨酸的培养基中具有良好的增殖率，并可在含硝酸铅的培养基上形成代表高硫化氬产量的红褐色菌落。使用YPD10液体培养基测定所获得的13个可高水平产生硫化氬的具有DL-乙硫氨酸抗性的菌林中的3林的亚硫酸及石危化氢的产量，并将其亚硫酸的产量与亲代菌林的亚硫酸产量进行比较。此处所用培养方法如下所述。具体地，将包括亲代菌抹在内的酵母菌抹从琼脂培养基上接种到YPD10液体培养基中，然后于20。C进行3天有氧振荡培养。离心(3000rpmx5分钟)培养基。获得酵母菌体组分，然后悬浮在无菌水中。再次将酵母(0.5%(w/v))接种到YPD10液体培养基中，然后于20。C进行3天厌氧振荡培养，以制备酵母醪。于20°C在含有200mLYPD10液体培养基的250mL瓶中对酵母醪(0.5%(w/v))进行厌氧振荡培养以进行发酵。使用HPLC测定培养3天后培养基中亚硫酸的产量。此外，使用GC测定硫化氢的产量。上述结果表明上述3个菌林具有乙硫氨酸抗性，并且可高水平产生亚硫酸及硫化氢。为了从来自上述3个菌林的YM02菌株中获得低水平产生硫化氢的菌抹，通过下述方法获得了具有DL-羟基正缬氨酸抗性的菌林。具体地，将生长在添加2%琼脂的YPD琼脂培养基上的YM02菌林的单菌落接种到5mLYPD液体培养基中，然后在2(TC培养3天。离心(3000rpmx5分钟)培养基，获得酵母菌体组分。向每部分加入10mL无菌水后，将其充分振荡并再次离心，以获得酵母菌体组分。重复此过程以洗涤酵母细胞。将所获得的(清洗后的)酵母细胞沉淀悬浮在5mL无菌水中，然后向20mL添加了10mg/mLDL-羟基正缬氨酸、0.17。/。BactoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、0.5%硫酸铵及2%葡萄糖的培养基中加入100悬浮液，随后于20。C有氧培养3天。用200iiL培养液涂布含有0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%硫酸铵、0.1%硝酸铅及2%琼脂的含硝酸铅琼脂培养基。用1.0><108个酵母细胞涂布小Petri平皿中的琼脂培养基，在20。C培养7天。因此获得了IO个淡褐色菌落。再次使用含硝酸铅的琼脂培养基培养获得的菌落。确认了所获得的菌抹可形成淡褐色菌落。使用YPD10液体培养基测定所获得的IO个可低水平产生硫化氢的具有DL-羟基正缬氨酸抗性的菌抹中亚硫酸的产量，并将亚硫酸的产量与亲代菌林的亚硫酸产量进行比较。此处所用培养方法如下所述。具体地，将包括亲代菌抹在内的酵母菌抹从琼脂培养基上接种到YPD10液体培养基中，然后于20。C进行3天有氧振荡培养。离心(3000rpmx5分钟)培养基。获得酵母菌体组分，然后悬浮在无菌水中。再次将酵母(0.5%(w/v))接种到YPD10液体培养基中，然后于20。C进行3天厌氧振荡培养，以制备酵母醪。于2(TC在含有200mL对酵母醪(0.5%)进行厌氧振荡培养以进行发酵。使用HPLC测定培养3天后培养基中亚硫酸的产量。使用啤酒麦芽汁对所检测菌林中具有极高亚硫酸产量的YMO106菌林以及亲代菌抹一起进行相同的厌氧振荡培养，比较亚硫酸与硫化氢的产量。此处所用培养方法如下所述。具体地，将包括亲代菌林在内的酵母菌抹从琼脂培养基上接种到YPD10液体培养基中，然后于20。C进行3天有氧振荡培养。离心(3000卬mx5分钟)培养基。获得酵母菌体组分，然后悬浮在无菌水中。再次将酵母(0.5%(w/v))接种到500mL啤酒麦芽汁中，然后于20。C进行3天厌氧振荡培养，以制备酵母醪。随后于20。C在含有900mL麦芽汁的1000mL瓶中对酵母醪(0.5%)再次进行厌氧振荡培养以进行发酵。此时，除了检测亚硫酸产量外还检测发酵过程，比较细胞数目上的变化，并通过测定细胞培养液密度的变化来比较糖的消耗。使用HPLC测定培养了3天的培养基中亚硫酸的产量。此外，使用GC测定硫化氢的产量。所获得的结果如图30到32所示。如图31和32所示，在使用KBYOll(酿酒酵母)酿造的啤酒中检测的游离亚硫酸为14.7ppm(50小时后)，而在基于乙硫氨酸抗性及羟基正缬氨酸抗性所选择的突变菌抹YMO106酿造的啤酒中游离亚硫酸的水平为39.2ppm(50小时后)。而且，亲代菌抹与突变菌林之间在硫化氢的产量上没有观测到显著性差异。基于上述结果可以确认，所分离的具有乙硫氨酸抗性及羟基正缬氨酸抗性的YMO106菌抹在硫化氢产量上略有降低，而在亚硫酸产量上有很大提高。实施例3随后，为了培养与亲代菌抹相比，由于在酵母硫化氢及亚硫酸代谢途径中增加了从硫酸盐离子合成硫化氢途径中的代谢量、并增加了从0-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸途径中的代谢量，而可在不增加硫化氢产量的同时提高亚硫酸产量的菌林，利用基因重组方法进行了实验。使生产用底层发酵酵母KBYOll菌抹形成孢子并进行减数分裂。利用所分离到的减数分裂分离林B43,通过下面的方法获得了基因重组子。破坏参与稳定Metl4蛋白的YNL311C基因，以增加从硫酸盐离子合成疏化氢途径中的代谢量。然后过表达HOM3基因，以增加从0-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸途径中的代谢量。根据常规的方法，通过电转化依次破坏LgYNL311C及ScYNL311C基因，从而制备了原本存在于B43中的YNL311C基因被完全破坏的菌抹。通过PCR验证了该基因被完全破坏。结果如图33所示。通过将含有来源于面包酵母的GPD启动子、来源于面包酵母的PGK终止子、以及全长ScHOM3基因的表达盒插入到具有金担子素A抗性标记的质粒pAUR101,构建了用于过表达ScHOM3的质粒pAUR-ScHOM3。使用pAUR-ScHOM3来转化其中YNL311C被完全石皮坏的B43菌4朱，从而获得YM03113菌才朱。使用YPD10液体培养基测定YM03113菌抹中亚硫酸的产量，并与亲代菌抹的亚硫酸产量进行比较。此处所用培养方法如下所述。具体地，将包括亲代菌抹在内的酵母菌抹从琼脂培养基上接种到YPD10液体培养基中，然后于20。C进行3天有氧振荡培养。离心(3000rpmx5分钟)培养基。获得酵母菌体组分，然后悬浮在无菌水中。再次将酵母(0.5%)接种到YPD10液体培养基中，然后于20。C进行4天厌氧振荡培养，以制备酵母醪。随后，于20。C在含有200mLYPD10液体培养基的250mL瓶中对酵母醪(0.5%)进行厌氧振荡培养以进行发酵。此外，为了在检测亚硫酸产量外还检测发酵过程，比较了细胞数目上的变化，并通过测定细胞培养液密度的变化来比较糖的消耗。使用HPLC测定培养了4天的培养基中亚硫酸的产量。所获得的结果如图34所示。此外，于20。C在含有0.5%酵母提取物、0.3%蛋白胨、4%葡萄糖、0.02%硫酸铵、0.1%硝酸铅及2%琼脂的含硝酸铅琼脂培养基上培养4天，测定硫化氢的产量，然后用目测观察菌落的颜色。所获得的结果如图35所示。基于上述结果可以确认，YM03113菌抹具有高产亚硫酸的能力，而硫化氢的产量却与亲代菌抹相同。本描述中所引用的全部出版物、专利及专利申请均作为参考完全并入在本申请中。工业应用根据本发明，能够培养出可高水平产生亚硫酸却不产生更多硫化氢的酵母。这使得在抑制可导致异味的硫化氢产量的同时，增加维持酿造中新鲜度所必需的亚硫酸的产量成为可能。这也使得生产高品质的酒类饮料等成为可能。因此，本发明可用于生产包括酒类饮料在内的食品、药物及其它。序列表文本SEQIDNO:1-来源于KBY011菌林的LgHOM3基因的编码区SEQIDNO:2-来源于KBY011菌林的LgTHRl基因的编码区SEQIDNO:3-来源于KBY011菌抹的LgMET17基因的编码区SEQIDNO:4-来源于KBYOll菌抹的LgYNL311C基因的编码区权利要求1.培养与亲代菌株相比，在不增加硫化氢产量的同时可增加亚硫酸产量的酵母的方法，该方法包括，在酵母硫化氢及亚硫酸代谢途径中，增加从硫酸盐离子合成硫化氢途径的代谢量，并且增加从O-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸途径的代谢量。2.权利要求1所述的方法，包括通过增加SUL1、SUL2、MET3、MET14及MET16中一个或多个基因的表达水平或者提高这些基因产物的活性来增加从硫酸盐离子合成硫化氩途径中的代谢量；及通过增加HOM3、HOM2、HOM6、MET2及MET17中一个或多个基因的表达水平或者提高这些基因产物的活性、和/或减少THR1和/或THR4基因的表达水平或者降低这些基因产物的活性来增加从O-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸的量。3.权利要求2所述的方法，包括提高MET14基因产物的活性及增加HOM3基因的表达水平。4.根据权利要求1到3任一项所述的方法所培养的、与亲代菌抹相比在不增加硫化氩产量的同时可增加亚硫酸产量的酵母菌抹。5.生产酒类饮料的方法，包括使用权利要求4所述的酵母。6.酒类饮料，它是通过权利要求5所述的方法生产的。7.培养与亲代菌林相比，在不增加硫化氩产量的同时可增加亚硫酸产量的酵母的方法，包括以下步骤1)分离出可在含有含硫氨基酸类似物的含铅平皿上形成红褐色菌落的突变菌才朱；2)从所分离到的突变菌抹中选出亚硫酸产量增加的突变菌抹；3)在含有苏氨酸类似物的培养基中培养所选出的突变菌抹，然后分离出可在含铅平皿上形成白色菌落的突变菌林；及4)从所分离到的突变菌林中选出与亲代菌林相比亚硫酸产量增加的突变菌才朱。8.权利要求7所述的方法，其中所述的含硫氨基酸类似物是乙硫氨酸、硒代甲硫氨酸或S-乙基半胱氨酸，所述的苏氨酸类似物是羟基正缬氨酸。9.通过权利要求7或8所述的方法培养的、与亲代菌林相比在不增加硫化氬产量的同时可增加亚硫酸产量的酵母菌林。10.保藏号为FERMBP-10486的酵母菌抹。11.用权利要求9或10所述的酵母菌抹生产酒类饮料的方法。12.酒类饮料，它是通过权利要求11所述的方法生产的。全文摘要基于酵母代谢物及酵母基因表达水平的分析结果，本发明涉及培养可高水平产生对于在酿造中维持新鲜度非常重要的亚硫酸、却不产生更多可导致异味的硫化氢的酵母的方法。本发明还涉及使用该酵母来生产高品质的酒类饮料的方法。具体地，本发明涉及培养通过在酵母硫化氢及亚硫酸生成途径中增加了从硫酸盐离子合成硫化氢途径中的代谢量以及增加了从O-乙酰高丝氨酸合成高半胱氨酸的量，从而与亲代菌株相比亚硫酸增加却不产生更多硫化氢的酵母的方法。本发明进一步涉及使用该酵母来生产酒类饮料的方法。文档编号C12C11/00GK101421389SQ20078001053公开日2009年4月29日申请日期2007年1月24日优先权日2006年1月24日发明者吉田聪,善本裕人,曾我朋义,港纪子申请人:麒麟控股株式会社;学校法人庆应义塾