微藻红树林裂殖壶菌的生物质以及用于制备它的方法
【专利说明】微藻红树林裂殖壶菌的生物质以及用于制备它的方法
[0001] 本发明涉及一种微藻的生物质，其富含二十二碳六烯酸（或DHA)，富含棕榈酸以 及富含磷脂，特别是磷脂酰胆碱、破囊壶菌属的微藻生物质，更特别是裂殖壶菌，在这种情 况下是红树林裂殖壶菌（Schizochytrium mangrovei)特定菌株的生物质。
[0002] 脂类与蛋白质和碳水化合物一起构成了大量营养元素的三个主要家族。
[0003] 在脂类中，甘油三酸酯和磷脂尤其突出：
[0004]-甘油三酸脂（也称为三酰甘油酯或三酸甘油酯或TAGs)是甘油酯，其中甘油的三 个羟基被脂肪酸酯化。它们是植物油与动物脂肪的主要成分。
[0005] 甘油三酸脂代表了被人类摄取的大致95%的饮食脂肪。在体内，它们主要存在于 脂肪组织并构成了能量存储的主要形式。
[0006] _磷脂是两亲性脂类，即脂类由一个极性（亲水性）"头"和两个脂肪族的（疏水 性）"尾巴"组成。
[0007] 磷脂是结构性脂质，因为他们是细胞膜的组分，在细胞膜中它们尤其提供流动性。
[0008] 大多数的磷脂是磷酸甘油酯，其头部被用极性分子酯化的甘油-3-磷酸残基围 绕，并且两条尾巴是两个脂肪酸的脂肪链。
[0009]另一种磷脂是鞘磷脂，其结构上衍生自鞘氨醇并非衍生自甘油，鞘氨醇构成两条 脂肪族的尾巴之一。
[0010] 分离自活体组织的第一种磷脂从蛋黄卵磷脂中得以表征-它们更具体是磷脂酰 胆碱。此外，这就是为什么磷脂酰胆碱又称卵磷脂。
[0011] 磷脂酰胆碱由肝脏自然产生。它们是胆汁的重要成分，其中它们乳化存在于十二 指肠中的脂肪。除了胆盐之外，对于防止脂滴重新凝集，它们也是必要的。
[0012] 作为磷脂，磷脂酰胆碱参与到细胞膜中并且用来保存它们的粘弹性。它们是神经 系统的必要成分并且构成了脑的近30%干重和15%的神经。
[0013] 甘油三酸酯和磷脂主要由脂肪酸组成，这些脂肪酸都是由饮食提供，并且对于它 们中的一些，是由生物合成的。
[0014] 生物化学分类（基于脂肪酸分子中包含的双键数量）区分饱和脂肪酸（SFA)、单不 饱和脂肪酸（MUFA)和多不饱和脂肪酸（PUFA)。
[0015] 从生理学角度，区分为以下内容：
[0016]-必需脂肪酸，人体成长和正常运行所必需的，但我们身体不能够产生；
[0017]条件性"必需脂肪酸，其对于细胞正常生长和生理功能是必要的，但如果通过饮 食提供的话，其可以从它们的前体中产生。因此，如果它们必需的前体不存在，它们是严格 必需的。
[0018]-非必需脂肪酸。
[0019] 必需脂肪酸和"条件性"必需脂肪酸的组组成了必要脂肪酸。
[0020] 其它脂肪酸称为非必要脂肪酸。
[0021] 在非必需脂肪酸中，尤其是：
[0022] _ ? 3脂肪酸家族的二十碳五烯酸（EPA)，
[0023]-油酸，在我们饮食中的主要的单不饱和脂肪酸，以及
[0024]-饱和脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸。
[0025] 多不饱和脂肪酸是根据第一双键的位置（从最终甲基官能起始）归类的。
[0026] 因此，在命名中对于《 "x"或"nx"，"x"对应于第一不饱和的位置。
[0027]区分必要脂肪酸的两个主要家族：脂肪酸（或n-6PUFA)，其前体和主要代表是 亚油酸（LA);以及《 3脂肪酸（或n-3PUFA)，其前体是a -亚麻酸（ALA)。
[0028] 生物学上感兴趣的多不饱和脂肪酸的大部分属于家族（花生四烯酸或ARA) 或《 3家族（二十碳五烯酸或EPA，二十二碳六烯酸或DHA)。
[0029] 此外，在命名中，构成链的碳原子数也被定义：从而EPA被描述为C20:5并且DHA 被描述为C22:6。
[0030] 因此该"5"和"6"对应于碳链的不饱和数目，该碳链分别由EPA和DHA表示。
[0031] w 3脂肪酸家族的DHA是生物可以从a -亚麻酸合成的或通过消耗富含油脂的鱼 (金枪鱼、鲑鱼、鲱鱼等）提供的一种脂肪酸。
[0032] DHA在膜结构以及脑的和视网膜的发育和功能中发挥了重要作用。
[0033] 鱼油主要用作《 3脂肪酸例如DHA和EPA的来源，但《 3脂肪酸也发现于微藻油， 其中它们是作为一种混合物或分开地进行提取，如在这种情况下，例如这些油衍生自某些 选择的菌株，例如裂殖壶菌属的那些，其仅包含痕量的EPA，但包含高DHA含量。
[0034] 可获得富含DHA的微藻生物质的商业制品。
[0035] 例如，可以由此提到的是：
[0036]-建议用于在轮虫水产养殖中的营养，Algamac系列产品，由阿卡福纳生物海洋公 司(AquafaunaBio-MarineInc)销售，或
[0037]-由DSM公司以商标名DHAGold?销售的产品。
[0038] 然而，仍需要提供有以下品质的微藻生物质：具有高DHA含量，并且具有长链饱和 或多不饱和脂肪酸的以及磷脂的完全特定谱。
[0039] 首先，本申请公司的荣誉在于提供了一种富含DHA的微藻的新颖生物质，该生物 质具有：
[0040] -除DHA以外的低含量的多不饱和脂肪酸（例如EPA)，
[0041] -有限含量的某些长链饱和脂肪酸（例如肉豆蔻酸和月桂酸）。
[0042] _高含量的磷脂（高达两倍于商业制品中常见的数量），更具体的是磷脂酰胆碱。
[0043] 同样，急于研发一种比现有技术中描述的那些更有效且便宜得多的生产方法，在 其研宄过程中，本申请公司已经鉴定了一种生产DHA并且具有以下各项生产特性的红树林 裂殖壶菌的新颖菌株：
[0044]-极少的高胆固醇的饱和脂肪酸（少于6%的月桂酸和肉豆蔻酸，这些是本领域技 术人员知道的已知的最高胆固醇的），
[0045]-多于40%的棕榈酸，
[0046](在此％应理解为按总脂肪酸的重量计）。
[0047] 棕榈酸的也称十六烷酸或鲸蜡酸，是在动物和植物中最常见的C16:0饱和脂肪酸 之一。
[0048] 在脂肪生成过程中，棕榈酸是产生的第一种脂肪酸，较长的脂肪酸可以从所述的 棕榈酸产生。
[0049] 此外，脂肪酸被优先用于合成ATP。其燃烧的能量平衡表示为129个ATP。因此， 它构成了一种优秀的能量食品
[0050] 在工业上，棕榈酸还被用于人造黄油和肥皂的生产。
[0051] 在涂料领域，鉴于棕榈酸是饱和的，它不能聚合并且一旦与大气中的氧气接触它 就变得坚硬（不像油酸、亚油酸和亚麻酸）。因此，它仍处于其软固体形式并且作（与硬脂 酸）为一种用于聚合油粘合剂的增塑剂。因此，与硬脂酸一起，它针对随时间推移的含油图 片材料的完好保存提供了所需的弹性。
[0052] 此外，根据本发明的红树林裂殖壶菌生物质具有：
[0053]-在1. 5%和2%之间的磷脂含量，其中的1 %至1. 3%由磷脂酰胆碱组成，
[0054]-如NX6. 25表示的在10%和20%之间的一个总氨基酸含量，
[0055](在此％应理解为按相对于处于99%干物质的100g生物质的重量计）。
[0056] 这种红树林裂殖壶菌菌株于2012年11月22日存放在法国巴斯德研宄所的法国 微生物保藏中心[National Collection of Microorganism Cultures] (CNCM)，法国，巴黎 市，邮政编码75724,15号信箱，du docteur Roux街25号，在编号CNCM 1-4702下。
[0057] 它以测序编码18 S rRNA的基因来表征：
[0058] 1 GGTTTTACAT TGCTCTCATT CCGATAGCAA AACGCATACA CGCTTCGCAT CGATATTTCT
[0059] 61 CGTCCTACCT CGTGGAGTCC ACAGTGGGTA ATTTACGCGC CTGCTGCTAT CCTTGGATAT
[0060] 121 GGTAGCCGTC TCTCAGGCTC CCTCTCCGGA GTCGAGCCCT AACTCTCCGT CACCCGTTAT
[0061] 181 AGTCACCGTA GTCCAATACA CTACCGTCGA CAACTGATGG GGCAGAAACT CAAACGATTC
[0062] 241 ATCGACCAAA AWAGTCAATC TGCTCAATTA TCATGATTCA CCAATAAAAT CGGCTTCAAT
[0063] 301 CTAATAAGTG CAGCCCCATA CAGGGCTCTT ACAGCATGTA TTATTTCCAG AATTACTGCA
[0064] 361 GGTATCCATA TAAAAGAAAC TACCGAAGAA ATTATTACTG ATATAATGAG CCGTTCGCAG
[0065] 421 TCTCACAGTA CAATCGCTTA TACTTACACA GCAG(SEQ ID No 1)
[0066] 该序列可以鉴定其为红树林裂殖壶菌型的一个菌株。
[0067] 因此，本发明涉及2012年11月22日保藏于CNCM编号1-4702下的红树林裂殖壶 菌菌株。
[0068] 在本申请中这种菌株随后可以被表示为"CNCM 1-4702"。
[0069] 本发明还涉及这种菌株的变体或涉及衍生自其的菌株，所述变体或所述衍生菌株 保留了生产高含量DHA和棕榈酸的性质。
[0070] 具体而言，它涉及了通过诱变或通过基因转化从CNCM 1-4702菌株获得的红树林 裂殖壶菌菌株。该诱变可以是定位诱变和/或随机诱变。这种菌株保留了生产高含量的DHA 和棕榈酸的性质。具体来说，特别是当它在实例1中所描述的条件下进行培养时，它能够产 生多于35 %的DHA和多于40 %的棕榈酸，这两个％按总脂肪酸的重量计来表示。此外，它 产生了按处于99%干物质的生物质的重量计表示的在1%和1. 3%之间的磷脂酰胆碱。
[0071] 本发明还涉及制备此类菌株的方法，该方法包括CNCM 1-4702菌株的诱变或基因 转化以及可任选地，一个用于对生产以下各项的菌株进行选择的筛选步骤：
[0072] -多于 35% 的 DHA，
[0073]-多于40%的棕榈酸，
[0074](这两个％按总脂肪酸的重量计来表示），
[0075]-在1%和1. 3%之间的磷脂酰胆碱，
[0076](该％按处于99%干物质的生物质的重量计来表示）。
[0077] 本发明涉及培养CNCM 1-4702菌株或其保留了生产DHA和棕榈酸能力的变体的方 法，该方法包括在适当的介质和合适的发酵条件下培养这种菌株的步骤。
[0078] 此外，本发明涉及用于制备红树林裂殖壶菌的生物质的方法，其特征在于它通过 以下步骤的顺序进行制备：
[0079] 〇在异养条件下培养该菌株以便生产一种生物质，该生物质具有按总脂肪酸的重 量计表示的在35 %和40 %之间的DHA，按总脂肪酸的重量计表示的在40 %和50wt %之间的 棕榈酸，以及在1%和1. 3%之间的磷脂酰胆碱，％按生物质的重量计来表示，
[0080] 。收集由此制备的该生物质
[0081] 。干燥所述生物质。
[0082] 在异养条件下进行该培养。总的来讲，该培养步骤包括预培养步骤（为了使该菌 株复苏），然后是适当的培养或发酵步骤。后一步骤相对应于生产感兴趣的脂类化合物的步 骤。
[0083] 申请公司推荐对CNCM 1-4702菌株采取三步骤需氧发酵，如将在下文中举例说明 的。
[0084] 在前面的预培养步骤之后，三步发酵步骤是以在一种介质中培养CNCM 1-4702菌 株为特征，在该介质中碳源的提供是根据由微生物消耗的葡萄糖来调节。