具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽和编码它们的多核苷酸的制作方法

具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽和编码它们的多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明提供具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽。本发明还提供编码这些杂合多肽的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些杂合多肽的方法。
【专利说明】具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽和编码它们的多核苷
酸
[0001 ] 关于在联邦资助的研究和开发下
[0002]完成的发明的权利的声明
[0003]本发明是根据能源部授予的合作协议DE-FC36-08G018080在政府支持下完成的。政府在本发明中拥有一定权利。
[0004]序列表的引用
[0005]本申请包含一个计算机可读形式的序列表，该序列表通过引用结合在此。
[0006]发明背景
发明领域
[0007]本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽、编码这些杂合多肽的多核苷酸、产生这些杂合多肽的方法、以及使用这些杂合多肽的方法。
[0008]相关技术说明
[0009]纤维素是单糖葡萄糖通过β -1, 4-键共价连接的一种聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。 这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在任意位置消化纤维素聚合物，使其打开而被纤维二糖水解酶攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的一种水溶性β -1, 4-连接二聚体。β -葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
[0010]将木质纤维素原料转化成乙醇具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的合意性、以及乙醇燃料的清洁性。现在认为木材、农业残余物、草本作物、和城市固体废物是生产乙醇的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素、以及木质素组成。一旦将木质纤维素转化成可发酵的糖，例如葡萄糖，那么这些可发酵的糖就可以容易地被酵母发酵成乙醇。
[0011]本领域需要新的酶以增加效率并且为纤维素材料的糖化提供成本有效的酶溶液。
[0012]WO 2010/060056 披露了一种由埃默森踩节菌(Talaromycesemersonii)纤维二糖水解酶I和里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I碳水化合物结合结构域组成的杂合多肽。
[0013]本发明提供具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽。
[0014]发明概述
[0015]本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的杂合多肽，这些分离的杂合多肽包含:
[0016](a)包含在该杂合多肽的N-末端处的一个纤维二糖水解酶催化结构域的一个第一多肽片段，该第一多肽片段选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455具有至少96%序列一致性的一个多肽片段；(ii)由与SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或其cDNA序列具有至少96%序列一致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iii)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455或由其组成的一个多肽片段；以及[0017](b)包含在该第一多肽片段的C-末端处的一个碳水化合物结合结构域的一个第二多肽片段，该第二多肽片段选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 4的氨基酸485至529具有至少96%序列一致性的一个多肽片段；(ii)由与SEQ ID NO: 3的核苷酸1453至1587具有至少96%序列一致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iv)包含SEQ IDNO:4的氨基酸485至529或由其组成的一个多肽片段。
[0018]本发明还涉及编码这些杂合多肽的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及产生这些杂合多肽的方法。
[0019]本发明还涉及用于降解或转化一种纤维素材料的方法，该方法包括:在这种具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。
[0020]本发明还涉及用于产生一种发酵产物的方法，这些方法包括:
[0021](a)在这种具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的存在下用一种酶组合物使一种纤维素材料糖化；
[0022](b)用一种或多种(例如，数种)发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且
[0023](C)从发酵中回收该发酵产物。
[0024]本发明还涉及发酵一种纤维素材料的方法，这些方法包括:用一种或多种(例如，数种)发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在这种具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的存在下用一种酶组合物使该纤维素材料糖化。
[0025]附图简要说明
[0026]图1示出质粒pF5的限制性图谱。
[0027]图2示出青霉菌属种(Penicillium sp.)(埃默森)GH7纤维二糖水解酶I催化结构域和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)GH7纤维二糖水解酶I CBM杂合蛋白质对50°C至65°C下一种酶组合物对碾磨的未洗涤的PCS的水解的作用。
[0028]定义
[0029]乙酰木聚糖酯酶:术语“乙酰木聚糖酯酶”意指一种羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α -萘酯、以及乙酸对硝基苯酯的水解。出于本发明的目的，在含有0.01% TWEEN?20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的50mM乙酸钠(pH5.0)中使用0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物来测定乙酰木聚糖酯酶活性。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5、25°C下每分钟释放I微摩尔的对硝基苯酚阴离子的酶的量。
[0030]等位基因变体:术语“等位基因变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，且可导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0031]a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶:术语“ a _L_阿拉伯呋喃糖苷酶”意指一种a _L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化a -L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷 残基的水解。该酶对a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)_键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本发明的目的，使用每ml的10mM乙酸钠(pH5)中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖(麦格酶国际爱尔兰股份有限公司(MegazymeInternat1nal Ireland, Ltd.),爱尔兰威克洛郡布瑞公司(Bray, C0.Wicklow, Ireland)以
总体积200 μ I在40°C下持续30分钟，接着通过AMINEX? HPX-87H柱色谱(伯乐实验室有限公司(B1-Rad Laboratories, Inc.)，美国加州赫拉克勒斯(Hercules, CA, USA)进行阿拉伯糖分析来测定a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
[0032]α -葡糖醛酸糖苷酶:术语“ α -葡糖醛酸糖苷酶”意指一种a -D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(EC3.2.1.139)，其催化a -D-葡糖醛酸糖苷到D-葡糖醛酸和醇的水解。出于本发明的目的，根据德弗里斯(de Vries)，1998，细菌学杂志(J.Bacter1l.) 180:243-249来测定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在PH5、40°C下每分钟释放I微摩尔的葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶的量。
[0033]β -葡糖苷酶:术语“ β -葡糖苷酶”意指一种β -D-葡糖苷葡糖水解酶(Ε.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β -D-葡萄糖残基的水解，并释放β -D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据文丘里(Venturi)等人，2002，来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶:产生、纯化以及一些生物化学特性(Extracellular beta-D-glucosidasefrom Chaetomium thermophilum var.coprophiIum:product1n, purificat1n and someb1chemical properties)，基础微生物学杂志(J.Basic Microb1l.) 42:55-66 的程序使用对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β -葡糖苷酶活性。一个单位的β -葡糖苷酶定义为在25°C、pH4.8下，在含有0.01^TWEEN? 20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。 [0034]β -木糖苷酶:术语“β -木糖苷酶”意指一种β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β (I — 4)_木寡糖的外水解，以从非还原性末端去除连续的D-木糖残基。出于本发明的目的，一个单位的木糖苷酶定义为在40°C、pH5下在含有
0.01%TWEEN? 20的10mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
[0035]碳水化合物结合结构域:术语“碳水化合物结合结构域(CBD) ”意指一种酶的介导该酶与一种碳水化合物底物的结合的区域。该碳水化合物结合结构域典型地是在一种酶的N末端处或C末端端点处发现的。一个碳水化合物结合模块(CBM)被分类为一个碳水化合物结合结构域。
[0036]催化结构域:术语“催化结构域”意指一种酶的含有该酶的催化机构的区域。
[0037]cDNA:术语“cDNA”意指可以通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相对应的基因组DNA中的内含子序列。起始的、初级的RNA转录物是mRNA的前体，它通过一系列的步骤(包括剪接)加工，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
[0038]纤维二糖水解酶:术语“纤维二糖水解酶”意指一种l，4-13_D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β -1, 4-连接葡萄糖的聚合物中的1，4-β -D-糖苷键的水解，从而从链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(泰里(Teeri)，1997,结晶纤维素降解:对纤维二糖水解酶的功能的新认识(CrystalIine cellulosedegradat1n:New insight into the funct1n of cellob1hydrolases),生物技术趋势(Trends in B1technology) 15:160-167 ;泰里等人，1998,里氏木霉纤维二糖水解酶:对结晶纤维素为何如此有效？(Trichoderma reesei cellob1hydrolases:why so efficient oncrystalline cellulose ?)，生物化学学会会刊(B1chem.Soc.Trans.) 26:173-178)。根据里弗(Lever)等人，1972,分析生物化学(Anal.B1chem.) 47:273-279 ;范.帝伯赫(vanTilbeurgh)等人，1982,欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters), 149:152-156 ;范.帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187:283-288 ；以及汤美(Tomme)等人，1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.B1chem.) 170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，汤美等人的方法可以用于测定纤维二糖水解酶活性。
[0039]纤维素分解酶或纤维素酶:术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，数种)水解纤维素材料的酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β_葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括:(I)测量总纤维素分解活性，并且(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，纤维素酶改进的展望:筛选和选择策略(Outlook for cellulase improvement:Screening and select1nstrategies), 2006,生物技术进展(B1technology Advances) 24:452-481 中所综述的。总纤维素分解活性通常使用不溶性底物来测量，这些底物包括瓦特曼(Whatman)I号滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等等。最常见的总纤维素分解活性测定是使用瓦特曼I号滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(Internat1nal Un1n of Pure and Applied Chemistry (IUPAC))(高斯(Ghose),1987,纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities),纯粹与应用化学(Pure App1.Chem.) 59:257-68)确立的。
[0040]出于本发明的 目的，通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比，由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来测定纤维素分解酶活性:l-50mg的纤维素分解酶蛋白/g于PCS中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(例如50°C、55°C、或60°C )下持续3-7天。典型条件为:1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS, 5%不溶性固形物，50mM乙酸钠(pH5)，ImM MnSO4，50°C、55°C、或60°C，72小时，通过AMINEX? HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯)进行的糖分析。
[0041]纤维素材料:术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也包含多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是一种线性β_ (1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。
[0042]纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮、以及穗轴，或树的叶、枝、以及木材中。纤维素材料可以是，但不限于:农业残余物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂残余物、废纸、以及木材(包括林业残余物)(参见，例如，维色洛戈尔(Wiselogel)等人，1995,于生物乙醇手册(Handbook on B1ethanol)(查尔斯.E.怀曼(Charles E.Wyman)编辑)，第105-118页，泰勒弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区(Washington D.C.);怀曼(Wyman)，1994,生物资源技术(B1resource Technology) 50:3-16 ；林德(Lynd)，1990,应用生物化学与生物技术(Applied B1chemistry and B1technology) 24/25:695-719 ；莫思尔(Mosier)等人，1999,木质纤维素的生物转化的最近进展(Recent Progress in B1convers1nof Lignocellulosics),生物化学工程 / 生物技术的进展(Advances in B1chemicalEngineering/B1technology), T ?谢伯(T.Scheper)主编,第 65 卷，第 23-40 页，纽约斯普林格出版社(Springer-Verlag, New York)。在此应理解的是,纤维素可以是呈以下形式:木质纤维素、包含木质素的植物细胞壁材料、纤维素、以及混合基质中的半纤维素。在一个优选方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选方面，纤维素材料是木质纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
[0043]在一方面，纤维素材料是农业残余物。在另一方面，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一方面，纤维素材料是废纸。在另一方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
[0044]在另一方面，纤维素材料是芦竹。在另一方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一方面，纤维素材料是竹材。在另一方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一方面，纤维素材料是玉米秸杆。在另一方面，纤维素材料是芒草。在另一方面，纤维素材料是橙皮。在另一方面，纤维素材料是稻草。在另一方面，纤维素材料是柳枝稷。在另一方面，纤维素材料是小麦杆。
[0045]在另一方面，纤维素材料是山杨。在另一方面，纤维素材料是桉树。在另一方面，纤维素材料是冷杉。在另一方面，纤维素材料是松树。在另一方面，纤维素材料是白杨。在另一方面，纤维素材料是云杉。在另一方面，纤维素材料是柳树。
[0046]在另一方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一方面，纤维素材料是棉绒。在另一方面，纤维素材料是滤纸。在另一方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
[0047]在另一方面，纤维素材料是一种水生生物质。如在此所使用，术语“水生生物质”意指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。
[0048]纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法进行预处理，如在此所描述。在一个优选方面，纤维素材料进行了预处理。
[0049]杂合多肽:术语“杂合多肽”意指其中一个多肽的一个区域融合在另一个多肽的一个区域的N-末端或C-末端的一种多肽。
[0050]本发明的杂合多肽具有SEQ ID N0:6的成熟多肽的纤维二糖水解酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、以及至少100%。[0051]编码序列:术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始，并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其组合。
[0052]控制序列:术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的杂合多肽的多核苷酸来说必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包括但不限于:前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
[0053]内切葡聚糖酶:术语“内切葡聚糖酶”意指一种内切-1，4-(1, 3 ;1，4)-β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1，4-β -D-糖苷键和混合β -1, 3葡聚糖如谷类β -D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β_1，4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张等人，2006，生物技术进展24:452-481)。出于本发明的目的，根据高斯，1987，纯粹与应用化学59:257-268的程序，在pH5、40°C下使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
[0054]表达:术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0055]表达载体:术 语“表达载体”意指包含编码一种多肽的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供其表达的控制序列的线性或环形DNA分子。
[0056]家族61糖苷水解酶:术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据亨利萨特B.(Henrissat B.)，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(Aclassificat1n of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities),生物化学杂志(B1chem.J.)280:309-316 ;和亨利萨特B.和贝洛赫A.(Bairoch A.)，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-based classificat1n ofglycosyl hydrolases),生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内切-1，4- β -D葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
[0057]阿魏酸酯酶:术语“阿魏酸酯酶”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸酯(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)也被称为阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-1I1、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-1、或FAE-1I。出于本发明的目的，在50mM乙酸钠(pH5.0)中使用0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物来测定阿魏酸酯酶活性。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5、25°C下每分钟释放I微摩尔的对硝基苯酚阴离子的酶的量。
[0058]片段:术语“片段”意指缺失成熟多肽的氨基和/或羧基末端的一个或多个(例如，数个)氨基酸的多肽，其中该片段具有生物活性。在一方面，片段包含所感兴趣的一种酶的一个多肽或成熟多肽的至少80%的氨基酸残基，例如至少85%的氨基酸残基、至少90%的氨基酸残基、或至少95%的氨基酸残基。
[0059]半纤维素分解酶或半纤维素酶:术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如，数种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如，沙洛姆(Shallom)，D.和肖汉姆(Shoham),Y.微生物半纤维素酶(Microbial hemicellulases),微生物学新见(CurrentOpin1n In Microb1logy)，2003，6 (3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于:乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物即半纤维素是支链和线性多糖的异质群体，这些多糖经由氢与植物细胞壁中的纤维素微纤维键合，从而将它们交联成一个稳固网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模炔基于它们一级序列的同源性，可以被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes) (CAZy)数据库中获得。可以根据高斯和比萨拉(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学59:1739-1752，在适合的温度(例如50°C、55°C、或60 0C )和pH(例如5.0或5.5)下测量半纤维素分解酶活性。 [0060]严格度条件:术语“高严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，根据标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及50%的甲酰胺中进行预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC,0.2% SDS在65°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0061]宿主细胞:术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的该亲本细胞的任何子代。
[0062]分离的:术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括:(I)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其天然相关联的一种或多种或所有天然存在的成分中去除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；⑶相对于在自然界中发现的那种物质通过人工修饰的任何物质；或
(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量(例如，宿主细胞中的重组体产量；编码该物质的基因的多个拷贝；以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)而修饰的任何物质。
[0063]低严格度条件:术语“低严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，根据标准的DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及25%的甲酰胺中进行预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2% SDS在50°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0064]成熟多肽:术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)的混合物。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸19至520。
[0065]成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有生物活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸55至1485。
[0066]中等严格度条件:术语“中等严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，根据标准的DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及35%的甲酰胺中进行预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2% SDS在55°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0067]中-高等严格度条件:术语“中-高等严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，根据标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及35%甲酰胺中进行预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2% SDS在60°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0068]核酸构建体:术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或是合成的单链抑或双链的核酸分子，它包含一个或多个控制序列。
[0069]可操作地连接 :术语“可操作地连接”意指这样一种构型，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列置于适当位置处，这样使得该控制序列指导该编码序列的表达。
[0070]亲本或亲本多肽:术语“亲本”或“亲本多肽”意指其中其片段组合以产生本发明的杂合多肽的两种或更多种(例如，数种)多肽中的一种。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽和/或其变体。术语“亲本”或“亲本多肽”还能以复数形式使用。
[0071]具有纤维素分解增强活性的多肽:术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。出于本发明的目的，通过测量在以下条件下与用相等的总蛋白质负载量而无纤维素分解增强活性(l-50mg纤维素分解蛋白/g于PCS中的纤维素)的对照水解相比，来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性:l-50mg总蛋白质/g于预处理的玉米秸杆(PCS)中的纤维素，其中总蛋白质由50% -99.5% w/w纤维素分解酶蛋白和0.5%-50% w/w具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质组成，在适合的温度(如40V -80°C，例如，50°C、55°C、60°C、65°C、或70V )和适合的pH(如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持续1_7天。在一个优选方面，使用在总蛋白质重量的2% -3%的米曲霉(Aspergillus oryzae) β -葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或总蛋白质重量的2%-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014中所描述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下CELLUCLAST? 1.5L(诺维信公司(Novozymes A/S),丹麦巴格斯瓦尔德(Bagsvaerd , Denmark))的混合物作为纤维素分解活性的来源。
[0072]具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.0l倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少
1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。
[0073]预处理的玉米秸杆:术语“PCS”或“预处理的玉米秸杆”意指通过热和稀硫酸处理、碱预处理、或中性预处理从玉米秸杆得到的纤维素材料。
[0074]序列一致性:两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列一致性”来描述。
[0075]出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular B1logy Open Software Suite),赖斯(Rice)等人，2000,遗传学趋势(Trends Genet.) 16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施，1970,分子生物学杂志(J.Mol.B1l.)48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记为“最长一致性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比一致性并且计算如下:
[0076](一致的残基X100)/(比对长度-比对中的空位总数)
[0077]出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000,同上)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的参数是空 位开放罚分10、空位扩展罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记为“最长一致性”的输出(使用-nobrief?选项获得)作为百分比一致性并且计算如下:
[0078](一致的脱氧核糖核酸X100)/(比对长度-比对中的空位总数)
[0079]子序列:术语“子序列”意指缺失成熟多肽编码序列的5’和/或3’端的一个或多个(例如，数个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有生物活性的片段。在一方面，一个子序列包含一种感兴趣的酶的一个多肽编码序列或成熟多肽编码序列的至少80%的核苷酸，例如至少85%的核苷酸、至少90%的核苷酸或至少95%的核苷酸。
[0080]变体:术语“变体”意指具有生物活性的、包含一个改变(即在一个或多个(例如，数个)位置处的一个取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替代；缺失意指占据一个位置的氨基酸的去除；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
[0081]极高严格度条件:术语“极高严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，根据标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC,0.2% SDS在70°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0082]极低严格度条件:术语“极低严格度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，根据标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3% SDS,200微克/ml剪切的并且变性的鲑鱼精子DNA、以及25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC,0.2% SDS在45°C下洗涤三次，每次15分钟。[0083]含有木聚糖的材料:术语“含有木聚糖的材料”意指包含含有β -(1-4)连接木糖残基主链的植物细胞壁多糖的任何材料。陆生植物的木聚糖是具有i3-(l_4)-D-吡喃木糖主链的杂聚物，其通过短的碳水化合物链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚，L-阿拉伯糖、和/或由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以及D-葡萄糖组成的不同寡糖。木聚糖类型的多糖可以分为均木聚糖和杂木聚糖，这些杂木聚糖包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及复合杂木聚糖。参见，例如，埃伯林格罗瓦(Ebringerova)等人,2005,聚合物科学进展(Adv.Polym.Sc1.) 186:1-67。
[0084]在本发明的方法中，可以使用含有木聚糖的任何材料。在一个优选方面，含有木聚糖的材料是木质纤维素。
[0085]木聚糖降解活性或木聚糖分解活性:术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含有木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括:(1)测量总木聚糖分解活性，并且(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如，内切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶测定的最近进展总结于若干出版物中，这些出版物包括:别雷(Biely)和普乔尔德(Puchard)，2006，食品与农业科学杂志(Journal of theScience of Food and Agriculture) 86 (II): 1636-1647 ;斯帕尼科瓦(Spanikova)和别雷，2006,葡糖醒 酸酯酶-由裂裙菌产生的新颖碳水化合物酯酶(Glucuronoyl esterase-Novelcarbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune)，欧洲生化学会联合会快报580(19):4597-4601 ;赫尔曼(Herrmann)、沃散斯卡(Vrsanska)、尤日奇科娃(Jurickova)、赫西(Hirsch)、别雷、以及库比切克(Kubicek), 1997,里氏木霉的β-D-木糖苷酶是一种多功能 β _D_ 木聚糖木糖水解酶(The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is amultifunct1nal beta-D-xylan xylohydrolase),生物化学杂志 321:375-381。
[0086]总木聚糖降解活性可以通过测定由不同类型的木聚糖(包括例如燕麦(oatspelt)木聚糖、山毛榉木木聚糖、以及落叶松木木聚糖)形成的还原糖，或通过光度法测定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定是基于从聚合4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如贝利(Bailey)、别雷、剖坦恩(Poutanen), 1992,用于木聚糖酶活性的测定方法的实验室间测试(Interlaboratorytesting of methods for assay of xylanase activity)，生物技术杂志(Journal ofB1technology) 23 (3): 257-270 中所述。木聚糖酶活性还可在 37°C下在 0.01% TRITON?X-1OO (4-(I, 1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中用0.2% AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物来测定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°C、pH6下在200mM磷酸钠(pH6)缓冲液中从作为底物的0.2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。
[0087]出于本发明的目的，通过测量在以下典型条件下由一种或多种木聚糖降解酶引起的桦木木聚糖(西格玛化学有限公司(SigmaChemical C0.，Inc.),美国密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO，USA))水解的增加来确定木聚糖降解活性:1ml反应、5mg/ml底物(总固体)、5mg木聚糖分解蛋白/g底物、50mM乙酸钠(pH5)、50°C、24小时，使用如里弗(Lever), 1972,用于碳水化合物的比色测定的新反应(A new react1n for colorimetricdeterminat1n of carbohydrates)，分析生物化学47:273-279所描述的对羟基苯甲酸酸餅(PHBAH)测定进行糖分析。
[0088]木聚糖酶:术语“木聚糖酶”意指1，4- β -D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的l，4-13-D-木糖苷键的内切水解。出于本发明的目的，可以在37°C下在
0.01% TRITON? X-100和200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中用0.2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°C、pH6下在200mM磷酸钠(PH6)中从作为底物的0.2% AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。
[0089]发明详细说明
[0090]本发明涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的杂合多肽，这些分离的杂合多肽包含:
[0091](a)包含在该杂合多肽的N-末端处的一个纤维二糖水解酶催化结构域的一个第一多肽片段，该第一多肽片段选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455具有至少96%序列一致性的一个多肽片段；(ii)由与SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或其cDNA序列具有至少96%序列一致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及
(iii)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455或由其组成的一个多肽片段；以及
[0092](b)包含在 该第一多肽片段的C-末端处的一个碳水化合物结合结构域的一个第二多肽片段，该第二多肽片段选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID N0:4的氨基酸485至529具有至少96%序列一致性的一个多肽片段；(ii)由与SEQ ID NO:3的核苷酸1453至1587具有至少96 %序列一致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iii)包含SEQ ID NO:4的氨基酸485至529或由其组成的一个多肽片段。
[0093]在一个第一方面，在该杂合多肽的N-末端处的第一多肽片段与SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455具有至少96%，例如至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一个实施例中，该第一多肽片段与SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455具有多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的差异。
[0094]在另一个实施例中，该第一多肽片段是至少370个氨基酸，例如，至少380个、至少390个、至少400个、至少410个、至少420个、或至少430个氨基酸。在另一个实施例中，该
第一多肽片段是437个氨基酸。
[0095]在另一个实施例中，该第一多肽片段包含SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455或其等位基因变体或由其组成；或是其一个片段。在另一方面，该第一多肽片段包含SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455或由其组成。
[0096]在另一个第一方面，在该第一多肽片段的C-末端处的第二多肽片段与SEQ IDNO: 4的氨基酸485至529具有至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性。在一个实施例中，该第二多肽片段与SEQ ID NO: 4的氨基酸485至529具有多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的差异。
[0097]在另一个实施例中，该第二多肽片段是至少34个氨基酸，例如，至少36个、至少38个、至少40个、至少42个、或至少44个氨基酸。在另一个实施例中，该第二多肽片段是45
个氨基酸。
[0098]在另一个实施例中，该第二多肽片段包含SEQ ID NO: 4的氨基酸485至529或其等位基因变体或由其组成；或是其一个片段。在另一个实施例中，该第二多肽片段包含SEQ IDNO:4的氨基酸485至529或由其组成。
[0099]在一个第二方面，该第一多肽片段由在极低严格度条件、低严格度条件、中等严格度条件、中-高等严格度条件、高严格度条件、或极高严格度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码:(i)SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485，(ii)SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全长补体(J.萨姆布鲁克(Sambrook)、E.F.弗里奇(E.F.Fritsch)、以及T.马尼亚蒂斯(T.Maniatis)等人，1989,分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning, A Laboratory Manual),第 2 版，冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约(New York))。
[0100]在另一个第二方面，该第二多肽片段由在极低严格度条件、低严格度条件、中等严格度条件、中-高等严格度条件、高严格度条件、或极高严格度条件下与SEQ ID NO: 3的核苷酸1453至1587、或其全长补体杂交的多核苷酸编码(萨姆布鲁克等人，1989，同上)。
[0101]SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或SEQ ID NO: 3的核苷酸1453至1587或其序列、以及SEQ ID NO:2的氨基酸19至455或SEQ ID NO:4的氨基酸485至529或其片段可以用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法由不同属或种的菌株鉴别和克隆编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽或具有碳水化合物结合活性的多肽的DNA。具体地说，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的相应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应该是至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度是至少100个核苷酸，例如长度是至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA探针与RNA探针两者均可以使用。典型地将探针进行标记，以用于检测相应基因(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白 标记)。本发明涵盖这类探针。
[0102]可以针对与以上所描述的探针杂交并且编码具有纤维素分解增强活性的多肽的DNA对由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自这类其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离。来自这些文库的DNA或分离的DNA可以转移到并且固定于硝基纤维素或其他适合载体材料上。为了鉴别与这种探针杂交的克隆或DNA，将该载体材料用于DNA印迹中。
[0103]出于本发明的目的，杂交指示多核苷酸在极低严格度条件至极高严格度条件下与对应于以下各项的标记的核酸探针杂交:SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或SEQ ID NO:3的核苷酸1453至1587 ;或其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针所杂交的分子。
[0104]在一个实施例中，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485。在另一个实施例中，核酸探针是SEQ ID NO:3的核苷酸1453至1587。在另一个实施例中，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的氨基酸19至455的多核苷酸或其片段。在另一个实施例中，核酸探针是编码SEQ ID NO:4的氨基酸485至529的多核苷酸或其片段。
[0105]对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短的探针来说，严格度条件被定义为根据标准DNA印迹程序，在比使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy) (1962，美国国家科学院院刊(Proc.Nat1.Acad.Sc1.USA) 48:1390)的计算计算的Tm低约5 °C至约10°C 下，在 0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl (ρΗ7.6)、6mM EDTA.0.5% NP_40、1X 登哈特氏溶液(Denhardt，s solut1n)、ImM焦憐酸钠、ImM憐酸二氢钠、0.1mM ATP、以及每ml 0.2mg 的酵母RNA中预杂交和杂交持续最佳12至24小时。将载体材料最终在比计算的Tm低5°C至10°C下在6X SCC加0.1% SDS中洗涤一次持续15分钟，并且使用6X SSC洗涤两次，每次15分钟。
[0106]在一个第三方面，该第一多肽片段由与SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或其cDNA序列具有至少96%，例如，至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列一致性的多核苷
酸编码。
[0107]在另一个第三方面，该第二多肽片段由与SEQ ID NO: 3的核苷酸1453至1587具有至少96%，例如，至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列一致性的多核苷酸编码。
[0108]在一个实施例中，具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽包含SEQ ID NO: 6或其成熟多肽、或其具有纤维二糖水解酶活性和碳水化合物结合活性的片段，或由其组成。在另一个实施例中，具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽包含包含SEQ ID N0:6或其成熟多肽，或由其组成。在另一个实施例中，具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸19至520、或其具有纤维二糖水解酶活性和碳水化合物结合活性的片段，或由其组成。在另一个实施例中，具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸19至520，或由其组成。
[0109]在每个以上实施例中，成熟杂合多肽可以进一步包含一个信号肽。在一个实施例中，该信号肽是SEQ ID NO:6的信号肽。在另一个实施例中，该信号肽是SEQ ID NO:6的氨基酸I至18。
[0110]多核苷酸
[0111]本发明还涉及编码具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸包含:
[0112](a)编码在该杂合多肽的N-末端处的一个第一多肽片段的一个第一多核苷酸，该第一多核苷酸选自下组，该组由以下各项组成:(i)编码与SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455具有至少96%序列一致性的一个多肽片段的多核苷酸；(ii)编码与SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或其cDNA序列具有至少96%序列一致性的一个多肽片段的多核苷酸；以及(iii)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸19至455或由其组成的一个多肽片段的多核苷酸；以及
[0113](b)编码在该第一多肽片段的C-末端处的一个第二多肽片段的一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸选自下组，该组由以下各项组成:(i)编码与SEQ ID N0:4的氨基酸485至529具有至少96%序列一致性的一个多肽片段的多核苷酸；(ii)编码与SEQ ID NO:3的核苷酸1453至1587具有至少96%序列一致性的一个多肽片段的多核苷酸；以及(iii)编码包含SEQ ID NO:4的氨基酸485至529或由其组成的一个多肽片段的多核苷酸。
[0114]在一个第一方面，该第一多核苷酸编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19至455具有至少96%，例如至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的第一多肽片段。
[0115]在另一个第一方面，该第二多核苷酸编码在该第一多肽片段的C-末端处的与SEQID NO:4的氨基酸485至529具有至少96%，例如至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的第二多肽片段。[0116]在一个第二方面，编码该第一多肽片段的第一多核苷酸在极低严格度条件、低严格度条件、中等严格度条件、中-高等严格度条件、高严格度条件、或极高严格度条件下与以下各项杂交:⑴SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485，(ii) SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全长补体(萨姆布鲁克等人，1989，同上)。
[0117]在另一个第二方面，编码该第二多肽片段的第二多核苷酸在极低严格度条件、低严格度条件、中等严格度条件、中-高等严格度条件、高严格度条件、或极高严格度条件下与SEQ ID NO: 3的核苷酸1453至1587、或其全长补体杂交(萨姆布鲁克等人，1989，同上)。
[0118]在一个第三方面，编码该第一多肽片段的第一多核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或其cDNA序列具有至少96 %，例如，至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 %的序列一致性。在一个实施例中，该第一多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或其cDNA序列，或由其组成。
[0119]在另一个第三方面，编 码该第二多肽片段的第二多核苷酸与SEQ ID NO: 3的核苷酸1453至1587具有至少96 %，例如至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性。在一个实施例中，该第二多核苷酸包含SEQ ID NO: 3的核苷酸1453至1587或由其组成。
[0120]在另一个实施例中，具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽由包含SEQ ID N0:5或其成熟多肽编码序列、或其编码具有纤维二糖水解酶活性和碳水化合物结合活性的片段的子序列；或其cDNA，或由其组成的多核苷酸编码。在另一个实施例中，具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽由包含SEQ ID NO:5的核苷酸55至1680或其编码具有纤维二糖水解酶活性和碳水化合物结合活性的片段的子序列、或由其组成的多核苷酸编码。在另一个实施例中，具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽包含SEQ ID N0:6的成熟多肽、其具有纤维二糖水解酶活性和碳水化合物结合活性的片段，或由其组成。在另一个实施例中，具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸19至520、其具有纤维二糖水解酶活性和碳水化合物结合活性的片段，或由其组成。
[0121 ] 在每个以上实施例中，成熟杂合多肽编码序列可以进一步包含一个信号肽编码序列。在一个实施例中，该信号肽是SEQ IDN0:2的信号肽。在另一个实施例中，该信号肽是SEQ ID NO: 2的氨基酸I至18。在另一个实施例中，该信号肽编码序列是SEQ ID NO:1的信号肽编码序列。在另一个实施例中，该信号肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸I至54。
[0122]核酸构建体
[0123]本发明还涉及包含编码本发明的杂合多肽的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。
[0124]可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供该杂合多肽的表达。取决于表达载体，在将多核苷酸插入载体中之前对其进行操纵可能是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
[0125]该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的杂合多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。[0126]用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项获得的启动子:解淀粉芽孢杆菌α -淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α -淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌crylllA基因(埃盖斯(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus), 1994,分子微生物学(Molecular Microb1logy) 13:97-107)、大肠杆菌Iac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene) 69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、以及原核内酰胺酶基因(维拉-科马罗夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。另外的启动子描述于吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American) 242:74-94 中的“来自重组细菌的有用蛋白质”(“Useful proteinsfrom recombinant bacteria”)；以及萨姆布鲁克等人，1989,见上文。串联启动子的实例披露于 WO 99/43835 中。
[0127]用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子:构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W0 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、镶片镰孢 Daria (W0 00/56900)、镶片镰孢 Quinn (W0 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶
1、里氏木霉内切葡聚糖酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶II1、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木聚糖酶II1、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其 中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6，011，147 中。
[0128]在酵母宿主中，有用的启动子是从以下各项的基因获得:酿酒酵母烯醇酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUPl)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488 描述。
[0129]控制序列还可以是被宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码杂合多肽的多核苷酸的3’末端。可以在本发明中使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
[0130]用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA (rrnB)的基因获得。
[0131]用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得:构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶1、里氏木霉内切葡聚糖酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶II1、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木聚糖酶II1、里氏木霉β -木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子。
[0132]用于酵母宿主细胞的优选终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYCl)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯等人，1992，见上文所描述。
[0133]控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。
[0134]适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得:苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(W094/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacter1logy)177:3465-3471)。
[0135]控制序列还可以是前导序列，即对于宿主细胞的翻译来说重要的mRNA非翻译区。该前导序列可操作地连接至编码该杂合多肽的多核苷酸的5’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
[0136]用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
[0137]用于酵母宿主 细胞的适合前导序列是从酿酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得。
[0138]该控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，即可操作地连接至该多核苷酸的3’ -末端并且在转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列。
[0139]用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得:构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
[0140]用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列是由郭(Guo)和夏尔曼(Sherman),1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular B1l.) 15:5983-5990 所描述。
[0141]控制序列还可以是编码连接至本发明的一个杂合多肽的的N-末端上的一个信号肽并且指导该多肽进入细胞的分泌途径的一个信号肽编码区域。多核苷酸的编码序列的5’_端可以固有地包含在翻译阅读框内与编码该多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’末端可以包含对该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列并不天然地包含信号肽编码序列时，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。
[0142]用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列:芽孢杆菌属NCIBl 1837麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽是由西蒙(Simonen)和帕夫拉(Palva)，1993,微生物学综述(Microb1logical Reviews) 57:109-137 所描述。
[0143]用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0144]用于酵母宿主细胞的有用信号肽是从酿酒酵母α -因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他有用的信号肽编码序列由罗马诺斯等人，1992，见上文所描述。
[0145]控制序列还可以是编码位于本发明的一个杂合多肽的N末端的前肽的一种前肽编码序列。所得多肽被称为酶原(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的，并且可以通过前肽的催化或自催化裂解从多肽原转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(W0 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
[0146]在信号肽和前肽序列二者均存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻一个多肽的N-末端，并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
[0147]还会令人 希望的是添加相对于宿主细胞的生长来调控该杂合多肽的表达的调控序列。调控序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAa -淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因、以及在重金属下扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该杂合多肽的多核苷酸将可操作地连接至该调控序列。
[0148]表达载体
[0149]本发明还涉及包含编码本发明的杂合多肽的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生一个重组表达载体，该重组表达载体可以包含一个或多个便利的限制性位点以允许在这类位点处插入或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生表达载体时，编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
[0150]该重组表达载体可以是能便利地经受重组DNA程序并且可以引起该多核苷酸的表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
[0151]载体可以是自主复制型载体，即作为染色体外实体而存在、其复制独立于染色体复制的载体，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是当被引入宿主细胞中时整合到基因组中并且与它已经整合至其中的一个或多个染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。
[0152]载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一种或多种选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
[0153]细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素、或四环素抗性)的标记物。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于:ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于:adeA(磷酸核糖氨基咪唑-琥拍甲酰胺合酶)、adeB (磷酸核糖-氨基咪唑合酶)、amdS (乙酰胺酶)、argB (鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar (草丁膦乙酰转移酶)、hph (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸还原酶)、pyrG (乳清酸核苷-5’ -磷酸脱羧酶)、sC (硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC (邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、以及pyrG基因。
[0154]选择性标记可以是如WO 2010/039889中所描述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
[0155]载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组或允许载体在细胞中独立于基因组而自主复制的一个或多个元件。
[0156]对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码杂合多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源 重组整合到宿主细胞基因组中一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，如100至10，000个碱基对、400至10，000个碱基对、以及800至10，000个碱基对，这些碱基对与相应的靶序列具有高度的序列一致性以增强同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
[0157]对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制基因。术语“复制起点”或“质粒复制基因”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0158]细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及ρΑΜβ I的复制起点。
[0159]用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARSl与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
[0160]适用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMAl和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因 98:61-67 ;卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究 15:9163-9175 ；W0 00/24883)。AMAl基因的分离以及包含该基因的质粒或载体的构建可以根据在WO 00/24883中所披露的方法达成。[0161]可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加本发明的杂合多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方式获得:将至少一个额外拷贝的序列整合到宿主细胞基因组，或包括可与多核苷酸一起扩增的选择性标记基因，其中可以通过在适当的选择性试剂存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝的细胞，并且由此来选择含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
[0162]用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，同上文)。
[0163]宿主细胞
[0164]本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的杂合多肽的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导该多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或自我复制的染色体外载体，如早先所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的该亲本细胞的任何子代。
[0165]宿主细胞可以是在本发明的杂合多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
[0166]原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于:芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、肠球菌、土芽孢杆菌、乳酸杆菌、乳球菌、大洋芽孢杆菌、葡萄球菌、链球菌、以及链霉菌。格兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌、大肠杆菌、黄杆菌、梭杆菌、螺杆菌、泥杆菌、奈瑟氏菌、假单胞菌、沙门氏菌、以及脲原体。
[0167]细菌宿主细胞 可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
[0168]细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于:似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽疫亚种细胞。
[0169]细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不限于:不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、以及变铅青链霉菌细胞。
[0170]可以通过如下方式实现将DNA引入芽孢杆菌细胞中:原生质体转化(参见，例如，常(Chang)和科恩(Cohen), 1979,分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.) 168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，扬(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacter1l.) 81:823-829、或Dubnau 和达维多夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson), 1971,分子生物学杂志56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower),1988，生物技术(B1techniques)6:742-751)、或接合(参见，例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。可以通过如下方式实现将DNA引入大肠杆菌细胞中:原生质体转化(参见，例如，哈纳汉(Hanahan)，1983，分子生物学杂志166:557-580)、或电穿孔(参见，例如，道尔等人，1988，核酸研究16:6127-6145)。可以通过如下方式实现将DNA引入到链霉菌细胞中:原生质体转化、电穿孔(参见，例如贡(Gong)等人，2004，微生物学报(Folia Microb1l.(布拉格(Praha)) 49:399-405)、接合(参见，例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或转导(参见，例如，布尔克(Burke)等人，2001，美国科学院院刊98:6289-6294)。可以通过如下方式实现将DNA引入到假单胞菌细胞中:电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microb1l.Methods)64:391_397)、或接合(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(App1.Environ.Microb1l.)71:51-57) 0 可以通过如下方式实现将DNA引入链球菌细胞中:天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，传染与免疫(Infect.1mmun.) 32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和约里克(Jollick)，1991，微生物(Microb1s)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，布克莱(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)、或接合(参见，例如，克莱怀尔(Clewell)，1981，微生物学综述(Microb1l.Rev.)45:409-436) 0 然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
[0171]宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
[0172]宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basid1mycota)、壶菌门(Chytrid1mycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’ s Dict1nary of The Fungi)，第 8 版，1995，国际应用生物科学中心(CAB Internat1nal)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge, UK)中进行定义的)。
[0173]该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内抱霉目(Endomycetale))、产担子酵母(basid1sporogenousyeast)、以及属于半知 菌类(Fungi Imperfecti)(芽生菌(Blastomycete))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(B1logy and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9 (Soc.App.Bacter1l.SymposiumSeries N0.9)，1980)中所描述来定义。
[0174]酵母宿主细胞可以是假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁维氏酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。
[0175]该真菌宿主细胞可以是一种丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌的特征一般在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，并且碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽，并且碳分解代谢可以是发酵的。
[0176]丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟錯菌属(Ceripor1psis)、金抱子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Cor1lus)、隐球菌属(Cryptococcus)、网孢菌属(Filibasidium)、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻痕病菌属(Magnaporthe)、毛霉菌(Mucor)、毁丝霉属(Mycel1phthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂裙菌属(Schizophyllum)、踩节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)细胞。
[0177]例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟赌菌(Ceripor1psis aneirina)、Ceripor1psis caregiea、浅黄拟腊孔菌(Ceripor1psis gilvescens)、Ceripor1psispannocinta>Ceripor1psis rivulosa>Ceripor1psis subrufa、虫拟腊菌(Ceripor1psissubvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金抱子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、租金抱子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金抱子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Cor1lus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉菌、黄抱平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺疗侧耳(Pleurotus ery ngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
[0178]真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式来转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988,生物 / 技术(B1/Technology)6:1419-1422 中描述。用于转化镰孢菌属种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因78:147-156、以及WO96/00787描述。酵母可以使用以下各文献中所描述的程序转化:贝克尔(Becker)和古伦特(Guarente)，艾本尔森 J.N.(AbeI son, J.N.)和塞蒙 Μ.1.(Simon, Μ.1.)编辑，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular B1logy),酶学方法(Methodsin Enzymology),第194卷，第182-187页，纽约学术出版社有限公司；埃托(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacter1l.) 153:163 ;以及辛伦(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
[0179]产生方法
[0180]本发明还涉及产生本发明的具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的方法，这些方法包括:(a)在适合于该杂合多肽的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；并且任选地(b)回收该杂合多肽。
[0181]使用本领域已知的方法在适合于产生该杂合多肽的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过在一种合适培养基中并且在允许该多肽表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、进料分批发酵、或固态发酵)来培养细胞。培养是使用本领域中已知的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的一种适合的营养培养基中进行的。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)来制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么该多肽可直接从该培养基中回收。如果多肽没有分泌，那么其可从细胞裂解物中回收。
[0182]可以使用本领域已知的对杂合多肽特异的多种方法来检测该杂合多肽。这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，酶测定可以用于确定该杂合多肽的活性。
[0183]可以通过本领域已知的方法来回收该杂合多肽。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该多肽，这些常规程序包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。在一方面，回收了包含本发明的具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的整个发酵液。
[0184]可以通过本领域中已知的多种程序来纯化杂合多肽以获得基本上纯的杂合多肽，这些程序包括但不限于:色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见,例如，蛋白质纯化(Protein Purificat1n), J.-C.詹森(Janson)和拉尔斯.赖登(Lars Ryden)编辑，VCH 出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
[0185]在一个替代方面，没有回收杂合多肽，而是将表达该多肽的本发明的一种宿主细胞用作该多肽的一个来源。
[0186]发酵液配制品或细胞组合物
[0187]本发明还涉及包 含本发明的多肽的一种发酵液配制品或一种细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片、以及培养基的细胞杀死全液。
[0188]如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。举例来说，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且分泌到细胞培养基中时,发酵液产生。该发酵液可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶、以及有活力和/或无活力的微生物细胞。
[0189]在一个实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含一种第一有机酸组分和一种第二有机酸组分，该第一有机酸组分包含至少一种I至5个碳的有机酸和/或其盐，并且该第二有机酸组分包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。
[0190]在一方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。一个实施例中，从细胞杀死的全液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
[0191]这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨糖醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
[0192]这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，数种)酶，该组由以下各项组成:纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白(swollenin)。这些发酵液配制品或细胞组合物还可以包含选自由下组的一种或多种(例如，数种)酶，该组由以下各项组成:水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α -葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酶、β -木糖苷酶、碳水化物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
[0193]该细胞杀死的全液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地，该细胞杀死的全液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，纤维素酶和/或一种或多种葡糖苷酶的表达)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀死的全液或组合物包含用过的细胞培养基、胞外酶、以及杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，在细胞杀死的全液或组合物中存在的微生物细胞可以使用本领域中已知的方法进行渗透和/或裂解。
[0194]如在此所描述的全液或细胞组合物典型地是一种液体，但是可以包含不溶性组分，如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
[0195]本发明的全液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或W02010/096673中所
描述的方法来产生。
[0196]以下给出了本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。
[0197]酶组合物
[0198]本发明还涉及包含本发明的一种多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示该组合物的纤维二糖水解酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。
[0199]这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，数种)酶，该组由以下各项组成:纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。这些组合物还可以包含选自下组的一种或多种(例如，数种)酶，该组由以下各项组成:水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α -半乳糖苷酶、α -葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酶、β -木糖苷酶、碳水化物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白分解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。这些组合物可以根据本领域中已知的方法来制备，并且可以呈液体或干燥组合物的形式。这些组合物可以根据本领域中已知的方法进行稳定化。
[0200]以下给出了本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。
[0201]用途
[0202]本发明还涉及用于使用杂合多肽、或其组合物的以下方法。
[0203]本发明还涉及用于降解纤维素材料的方法，这些方法包括:在本发明的具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。在一方面，这些方法进一步包括回收所降解的或转化的纤维素材料。该纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可以使用本领域中已知的方法(例如像离心、过滤、或重力沉降)与不溶性纤维素材料分离。
[0204]本发明还涉及产生一种发酵产物的方法，这些方法包括:(a)在本发明的具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的存在下，用一种酶组合物使纤维素材料糖化；(b)用一种或多种(例如，数种)发酵微生物发酵糖化的 纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(C)从发酵中回收该发酵产物。
[0205]本发明还涉及发酵一种纤维素材料的方法，这些方法包括:用一种或多种(例如，数种)发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在本发明的具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的存在下用一种酶组合物使该纤维素材料糖化。在一方面，发酵该纤维素材料产生一种发酵产物。在另一方面，这些方法进一步包括从发酵中回收该发酵产物。
[0206]本发明的方法可以用于将该纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将这些可发酵糖转化成许多有用的发酵产物，例如燃料、饮用乙醇、和/或平台化学品(例如酸类、醇类、酮类、气体等)。由该纤维素材料产生所希望的发酵产物典型地涉及预处理、酶水解(糖化)、以及发酵。
[0207]根据本发明的纤维素材料的加工可以使用本领域常规的方法来完成。此外，本发明的方法可以使用被配置成根据本发明来操作的任何常规生物质加工设备来实施。
[0208]分开或同时的水解(糖化)和发酵包括但不限于:分开水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、杂合的水解和发酵(HHF)、分开水解和共发酵(SHCF)、杂合的水解和共发酵(HHCF)，以及直接微生物转化(DMC)，有时还被称为合并的生物加工(CBP)。SHF使用单独的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体，并且然后将这些可发酵糖发酵成乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖发酵成乙醇被组合在一个步骤中(菲利皮迪斯*G.P.(Philippidis, G.P.)，1996,纤维素生物转化技术(Cellulose b1convers1n technology),生物乙醇手册:生产和利用(Handbook on B1ethanol:Product1n and Utilizat1n),怀曼 *C.E (Wyman, C.E.)编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis),华盛顿特区(Washington, DC),179-212))。SSCF涉及多种糖的共发酵(希恩.J.(Sheehan，J.)和希默尔.Μ.(HimmeI，Μ.)，1999，酶、能量与环境:美国能源部研究和开发生物乙醇活性的战略性观点(Enzymes, energy and the environment:A strategic perspective on the U.S.Departmentof Energy’ s research and development activities for b1ethanol),生物技术进展(B1technol.Prog.) 15:817-827)。HHF涉及一个单独的水解步骤，并且另外涉及一个同时糖化和水解步骤，这些步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下进行，即高温酶糖化，接着在发酵菌株能够耐受的更低温度下进行SSF。DMC将全部三个过程(酶产生、水解以及发酵)组合在一个或多个(例如，数个)步骤中，其中相同生物体被用来产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖的酶并且将可发酵糖转化成最终产物(林德.L.R.(Lynd, L.R.)、韦默.P.J.(ffeimer, P.J.)，范泽尔.W.H.(van Zyl, W.H.)、以及普利特瑞斯.1.S.(Pretorius, 1.S.)，2002，微生物纤维素利用:基础与生物技术(Microbialcellulose utilizat1n !Fundamentals and b1technology)，微生物分子生物学综述(Microb1l.Mol.B1l.Reviews) 66:506-577)。在此应理解的是，本领域中已知的包括预处理、酶水解(糖化)、发酵、或其组合的任何方法，可以用于实施本发明的方法。
[0209]常规设备可以包括进料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器、和/或连续活塞流柱式反应器(费尔南达.德.卡斯蒂柳斯.柯瑞芝(Fernandade Castilhos Corazza)、弗拉维奥.法里亚.德.莫赖斯(Flciv1 Faria de Moraes)、吉塞拉.玛丽亚.扎宁(GisellaMariaZanin)以及伊沃.雷特泽尔(IvoNeitzel),
2003,用于纤维二糖水解的进料分批反应器的优化控制(Optimal control in fed-batchreactor for the cellob1se hydrolysis),科技学报(自然科学版)(Acta Scientiarum.Technology) 25:33-38 ;古萨科夫.A.V.(Gusakov, A.V.)和辛捏特西.A.P.(Sinitsyn, A.P.)，1985，纤维素的酶水解动力学:1.分批反应器加工的数学模型(Kinetics of theenzymatic hydrolysis of cellulose: 1.A mathematical model for a batch reactorprocess)，酶与微生物技术(Enz.Microb.Technol.) 7:346-352);摩擦反应器(隆.S.K.(Ryu, S.Κ.)和李.J.M.(Lee, J.Μ.)，1983，通过使用摩擦生物反应器进行的废弃纤维素的生物转化(B1convers1n of waste cellulose by using an attrit1n b1reactor),生物技术与生物工程(B1 technol.B1eng.)25:53-65);或具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(古萨科夫.A.V.、辛涅特西.A.P.、谢尔盖.1.Y.(Davydkin, 1.Y.)、谢尔盖.V.Y.、普罗塔斯.0.V.(Protas, 0.V.)，1996，使用具有由电磁场引起的强烈搅拌的新型反应器增强酶纤维素水角军(Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel typeof b1reactor with intensive stirring induced by electromagnetic field),应用生物化学与生物技术(Appl.B1chem.B1technol.) 56:141-153)。另外的反应器类型包括:用于水解和/或发酵的流化床反应器、升流层(upflowblanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。
[0210]预处理。在本发明的方法的实践中，可以使用本领域已知的仟何预处理方法来破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(钱德拉(Chandra)等人，2007，底物预处理:木质纤维素的有效酶水解的关键？(Substrate pretreatment:The key to effective enzymatichydrolysis of lignocellulosics ?)，生物化学工程 / 生物技术的进展(Adv.B1chem.Engin./B1technol.) 108:67-93 ;盖博(Galbe)和小林(Zacchi)，2007，用于高效生物乙醇生产的木质纤维素材料的预处理(Pretreatment of lignocellulosic materials forefficient b1ethanol product1n),生物化学工程/生物技术的进展108:41-65 ;亨德里克斯(Hendriks)和季曼(Zeeman), 2009,用以增强木质纤维素生物质的消化性的预处理(Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic b1mass),生物资源技术(B1resource Technol.) 100:10-18 ;莫热(Mosier)等人，2005,用于木质纤维素生物质的预处理的有前景技术的特征(Features of promising technologies for pretreatmentof lignocellulosic b1mass)，生物资源技术 96:673-686 ;塔希尔扎德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi), 2008,预处理木质纤维素废弃物以改善乙醇和生物气体产生:综述(Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and b1gas product1n:Areview),分子科学国际杂志(Int.J.0f Mol.Sc1.) 9:1621-1651 ;杨(Yang)和怀曼，2008，预处理:释放低成本纤维素乙醇的关键(Pretreatment:the key to unlocking low-costcellulosic ethanol)，生物燃料、生物产品与生物精炼(B1fuels B1products andB1refining-B1fpr.) 2:26-40)。
[0211]纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤、和/或调理。
[0212]常规预处理包括但不限于:蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H20、臭氧、离子性液体、以及Y辐射预处理。
[0213]可以在水解和/或发酵之前对纤维素材料进行预处理。预处理优选在水解之前进行。可替代地，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身引起生物质到可发酵糖的些许转化(即使不存在酶)。
[0214]蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素、以及纤维素，以使酶可接触纤维素和其他级分，例如，半纤维素。使纤维素材料经过或通过反应容器 ，其中注入蒸汽以将温度增加至所需的温度和压力，并且在其中保持所希望的反应时间。蒸汽预处理优选在140°C至250°C，例如160°C至200°C、或170°C至190°C下进行，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选是I至60分钟，例如I至30分钟、I至20分钟、3至12分钟、或4至10分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆炸放料组合，这被称为蒸汽爆炸，即，迅速闪变至大气压和材料湍流，以通过破碎增加可及的表面积(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，生物资源技术855:1-33 ;盖博和小林，2002，应用微生物学与生物技术(Appl.Microb1l.B1technol.) 59:618-628 ;美国专利申请号20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且所得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。
[0215]化学预处理:术语“化学处理”是指能促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。这种预处理可以将结晶纤维素转化为无定形纤维素。适合的化学预处理方法的实例包括:(例如)稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体、以及有机溶剂预处理。
[0216]经常在蒸汽预处理之前添加催化剂，如H2SO4或SO2 (典型地0.3 %至5 % w/w)，这降低时间和温度、增加回收率、并且改善酶水解(巴列斯特罗斯(Ballesteros)等人，2006，应用生物化学与生物技术129-132:496-508 ;瓦尔加(Varga)等人，2004，应用生物化学与生物技术113-116:509-523 ;萨斯那(Sassner)等人，2006,酶与微生物技术(EnzymeMicrob.Technol.)39:756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(典型地H2SO4)和水混合以形成浆料，通过蒸汽加热至所希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可以用许多反应器设计来进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器(达夫和默里，1996，见上文，舍尔(Schell)等人，2004，生物资源技术91:179-188;李(Lee)等人，1999，生物化学工程与生物技术的进展65:93-115)。
[0217]还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于:氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。
[0218]用氧化钙或氢氧化钙，在85°C至150°C的温度下进行石灰预处理，并且停留时间为从I小时到几天(怀曼等人，2005，生物资源技术96:1959-1966 ;莫热等人，2005，生物资源技术 96:673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900、以及 WO2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
[0219]湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂(如过氧化氧或过压氧)的情况下在180 V至200 V下持续5-15分钟进行(施密特(Schmidt)和汤姆森(Thomsen)，1998，生物资源技术64:139-151 ;帕罗内(Palonen)等人，2004，应用生物化学与生物技术117:1-17 ;瓦尔加等人，2004，生物技术与生物工程(B1technol.B1eng.)88:567-574 ;马丁 (Martin)等人，2006，化学技术与生物技术杂志(J.Chem.Technol.B1technol.) 81:1669-1677)。预处理优选以 I %M 40%干物质，例如 2%至 30%干物质或5%至20%干物质进行，并且经常通过添加碱如碳酸钠来增加初始pH。
[0220]被称为湿爆 炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30 %的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间之后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压来终止预处理(W02006/032282)。
[0221]氨纤维爆炸(AFEX)涉及在如90°C至150°C的中等温度和如17至20bar的高压下，用液体或气态氨处理纤维素材料5至10分钟，其中干物质含量可以高达60% (格拉帕里(Gollapalli)等人,2002,应用生物化学与生物技术98:23-35 ;俊达瓦特(Chundawat)等人，2007，生物技术与生物工程(B1technol.B1eng.) 96:219-231 ;阿里扎德(Alizadeh)等人，2005，应用生物化学与生物技术121:1133-1141 ;泰莫里(Teymouri)等人，2005，生物资源技术96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-碳水化合物复合物被裂解。
[0222]有机溶剂预处理通过使用含水乙醇(40% -60%乙醇)在160°C _200°C下萃取30至60分钟而将纤维素材料脱木质素(潘(Pan)等人，2005，生物技术与生物工程90:473-481 ;潘等人，2006，生物技术与生物工程94:851-861 ;库拉比(Kurabi)等人，2005，应用生物化学与生物技术121:219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素被去除。
[0223]适合的预处理方法的其他实例由舍尔等人，2003，应用生物化学与生物技术，第105-108卷，第69-85页、和莫热等人，2005，生物资源技术96:673-686、以及美国公开申请2002/0164730 描述。
[0224]在一方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理形式进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。弱酸处理优选在I至5，例如I至4或I至2.5的pH范围中进行。在一方面，酸浓度在优选从0.0.1wt %至1wt %酸，例如0.05wt %至5wt %酸或0.1wt %至2wt%酸的范围中。使酸与纤维素材料相接触，并且保持在优选140°C至200°C，例如165°C至190°C范围中的温度下，持续从I至60分钟范围内的时期。
[0225]在另一方面，预处理在含水浆料中进行。在优选方面，在预处理过程中纤维素材料以优选在10wt%至80wt%之间，例如20wt%至70wt%或30wt%至60wt%,如大约40wt%的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗漆。
[0226]机械预处理或物理预处理:术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒大小减少的任何预处理。例如，这种预处理可以涉及各种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨、或振动球磨)。
[0227]纤维素材料可以物理地(机械地)且化学地预处理。机械或物理预处理可以与以下相结合:蒸汽/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波福射)、或其组合。在一方面，高压意指在优选约100至约400psi，例如约150至约250psi范围中的压力。在另一方面，高温意指在约100°C至约300°C，例如约140°C至约200°C范围中的温度。在一个优选方面，机械或物理预处理在分批过程中使用蒸汽枪水解器系统，例如从顺智公司(Sunds Defibrator AB),瑞典(Sweden)可获得的Sunds水解器(SundsHydrolyzer)来进行,该系统使用如上所定义的高压和高温。这些物理预处理和化学预处理可以根据需要顺序地进行或同时进行。
[0228]因此，在一个优选 方面，使纤维素材料经受物理(机械)或化学预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。
[0229]生物预处理:术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，舒.T.-A.(Hsu, T.-A.)，1996，生物质的预处理(Pretreatment of b1mass),生物乙醇手册:生产和利用，怀曼.C.E.编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团，华盛顿特区，179-212 ;高希(Ghosh)和辛格(Singh)，1993，用于纤维素生物质的酶/微生物转化的物理化学与生物处理(Physicochemical and b1logicaltreatments for enzymatic/microbial convers1n of cellulosic b1mass),应用微生物学进展(Adv.Appl.Microb1l.) 39:295-333 ;麦克米兰.J.D.(McMillan, J.D.)，1994，预处理木质纤维素生物质:综述(Pretreating lignocellulosic b1mass: a review),用于燃料生产的生物质的酶转化(Enzymatic Convers1n of B1mass for Fuels Product1n),希默尔.Μ.Ε.、贝克.J.0.、以及奥弗伦.R.P.(Overend, R.P.)编辑，美国化学学会讨论会系列 566 (ACS Symposium Series566),美国化学学会(American Chemical Society),华盛顿特区，第 15 章；贡.α S.(Gong, C.5.)、卡奥*1丄(Cao，N.J.)、杜.J.(Du，J.)、以及曹 *G.T.(Tsao, G.T.), 1999,由可再生资源生产乙醇(Ethanol product1n from renewableresources)，生物化学工程/生物技术的进展，舍佩尔.Τ.编辑，施普林格出版社德国海德堡柏林(Berlin Heidelberg, Germany),65:207-241);奥尔森(Olsson)和哈恩 _ 哈格达尔(Hahn-Hagerdal), 1996,用于乙醇生产的木质纤维素水解物的发酵(Fermentat1nof lignocellulosic hydrolysates for ethanol product1n),酶与微生物技术(Enz.Microb.Tech.) 18:312-331 ;以及瓦蓝德(Vallander)和埃里克松(Eriksson), 1990,由木质纤维素材料生产乙醇:技术现状(Product1n of ethanol from lignocellulosicmaterials:State of the art),生物化学工程/生物技术的进展42:63-95)。
[0230]糖化。在水解步骤(还称为糖化)中，将(例如预处理的)纤维素材料水解，以将纤维素和/或半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解由如在此所描述的酶组合物在本发明的杂合多肽的存在下酶促进行。这些组合物的酶可以同时或顺序地添加。
[0231]酶水解优选在适合的含水环境中在可以由本领域技术人员容易确定的条件下进行。在一方面，水解在适合于一种或多种酶的活性，即对于该一种或多种酶来说最佳的条件下进行。水解可以作为进料分批过程或连续过程进行，其中将纤维素材料逐渐进料至例如含酶的水解溶液中。
[0232]糖化通常在受控的pH、温度以及混合条件下在搅拌釜反应器或发酵罐中进行。适合的处理时间、温度以及PH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是典型地进行优选约12至约120小时，例如约16至约72小时或约24至约48小时。温度在优选约25 °C至约70 V，例如约30 V至约65°C、约40 °C至约60 V、或约50°C至55°C的范围中。pH在优选约3至约8，例如约3.5至约7、约4至约6、或约5.0至约5.5范围中。干燥固体含量在优选约5wt%至约50wt%,例如约10wt%至约40wt%或约20wt %至约30wt %的范围中。
[0233]这些酶组合物可以包含适用于降解纤维素材料的任何蛋白。
[0234]在一方面，该酶组合物包含或进一步包含选自下组的一种或多种(例如，数种)蛋白质，该组由以下各 项组成:纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。在另一方面，该纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如，数种)酶，该组由以下各项组成:内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶。在另一方面，该半纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如，数种)酶，该组由以下各项组成:乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。
[0235]在另一方面，该酶组合物包含一种或多种(例如，数种)纤维素分解酶。在另一方面，该酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如，数种)半纤维素分解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种或多种(例如，数种)纤维素分解酶和一种或多种(例如，数种)半纤维素分解酶。在另一方面，该酶组合物包含选自纤维素分解酶和半纤维素分解酶的组的一种或多种(例如，数种)酶。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶。在另一方面，该酶组合物包含一种纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种β -葡糖苷酶。在另一方面，该酶组合物包含一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶和一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种纤维二糖水解酶和一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种β_葡糖苷酶和一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶和一种纤维二糖水解酶。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶和一种葡糖苷酶。在另一方面，该酶组合物包含一种纤维二糖水解酶和一种β -葡糖苷酶。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种纤维二糖水解酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。在另一方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、以及一种β -葡糖苷酶。在另一个方面，该酶组合物包含一种内切葡聚糖酶、一种纤维二糖水解酶、一种β-葡糖苷酶、以及一种具有纤维素分解增强活性的多肽。
[0236]在另一方面，该酶组合物包含一种乙酰甘露聚糖酯酶。在另一方面，该酶组合物包含一种乙酰木聚糖酯酶。在另一方面，该酶组合物包含一种阿拉伯聚糖酶(例如，α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一方面，该酶组合物包含一种阿拉伯呋喃糖苷酶(例如，a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一方面，该酶组合物包含一种香豆酸酯酶。在另一方面，该酶组合物包含一种阿魏酸酯酶。在另一方面，该酶组合物包含一种半乳糖苷酶(例如，a-半乳糖苷酶和/或半乳糖苷酶)。在另一方面，该酶组合物包含一种葡糖醛酸糖苷酶(例如，a-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一方面，该酶组合物包含一种葡糖醛酸酯酶。在另一方面，该酶组合物包含一种甘露聚糖酶。在另一方面，该酶组合物包含一种甘露糖苷酶(例如，β_甘露糖苷酶)。在另一方面，该酶组合物包含一种木聚糖酶。在一个优选方面，该木聚糖酶是一种家族10木聚糖酶。在另一方面，该酶组合物包含一种木糖苷酶(例如，β -木糖苷酶)。
[0237]在另一方面，该酶组合物包含一种酯酶。在另一方面,该酶组合物包含一种苹果菌素。在另一方面，该酶组合物包含一种漆酶。在另一方面，该酶组合物包含一种木质素分解酶。在一个优选方面，该木质素分解酶是一种锰过氧化物酶。在另一个优选方面，该木质素分解酶是一种木质素过氧化物酶。在另一个优选方面，该木质素分解酶是一种H2O2产生酶。在另一方面，该酶组合物包含一种果胶酶。在另一方面，该酶组合物包含一种过氧化物酶。在另一方面，该酶组合物包含一种蛋白酶。在另一方面，该酶组合物包含一种膨胀蛋白。
[0238]在本发明的方法中，可以在糖化、糖化和发酵、或发酵之前或期间添加该一种或多种酶。
[0239]该酶组合物的一种或多种(例如，数种)组分可以是野生型蛋白、重组蛋白、或野生型蛋白与重组蛋白的组合。例如，一种或多种(例如，数种)组分可以是用作宿主细胞以重组表达该酶组合物的一种或多种(例如，数种)其他组分的细胞的天然蛋白质。该酶组合物的一种或多种(例如，数种)组分可以作为单组分产生，然后将这些单组分组合以形成该酶组合物。该酶组合物可以是多组分蛋白制剂与单组分蛋白制剂的组合。
[0240]在本发明的方法中使用的酶可以处于适合于使用的任何形式，例如像，发酵液配制品或细胞组合物、含或不含细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶制剂、或作为这些酶的来源的宿主细胞。酶组合物可以是干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体、或稳定化受保护的酶。液体酶制剂可以根据已确立的工艺，例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或另一种多元醇、和/或乳酸或另一种有机酸)来进行稳定化。
[0241]酶和杂合多肽的最佳量取决于几个因素，包括但不限于:纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶组分的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的一种或多种预处理、温度、时间、pH、以及所包含的发酵生物体(例如，用于同时进行糖化和发酵的酵母)。
[0242]在一方面，纤维素分解酶或半纤维素分解酶对纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg,例如，约0.5至约40mg、约0.5至约25mg、约0.75至约20mg、约0.75至约15mg、约0.5至约10mg、或约2.5至约10mg/g纤维素材料。
[0243]在另一方面，具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽对纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg,例如，约0.01至约40mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约 10mg、约 0.01 至约 5mg、约 0.025 至约 1.5mg、约 0.05 至约 1.25mg、约 0.075 至约 1.25mg、约0.1至约1.25mg、约0.15至约1.25mg、或约0.25至约1.0mg/g纤维素材料。
[0244]在另一方面，具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽对纤维素分解酶或半纤维素分解酶的有效量是约0.005至约L 0g，例如，约(λ 01至约L 0g、约(λ 15至约(λ 75g、约0.15至约0.5g、约0.1至约0.5g、约0.1至约0.25g、或约0.05至约0.2g/g纤维素分解酶或半纤维素分解酶。
[0245]具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽，以及适用于纤维素材料的降解的其他蛋白质/多肽，例如具有纤维素分解增强活性的GH61多肽(在下文统称为“具有酶活性的多肽”)可以源自或获自任何适合的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物、或哺乳动物来源。术语“获得的”在此还意指该酶可能已在宿主生物体中采用在此所描的方法重组产生，其中重组产生的酶对于宿主生物体是原生的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个(例如，数个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶为天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或通过本领域已知的核酸改组方法产生的酶。天然酶的含义中涵盖天然变体，而外源酶的含义中涵盖重组(如通过定点诱变或改组)获得的变体。
[0246]具有酶活性的 多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，如具有酶活性的芽孢杆菌、链球菌、链霉菌、葡萄球菌、肠球菌、乳酸杆菌、乳球菌、梭菌、土芽孢杆菌、热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor)、热酸菌(Acidothermus)、角质酶产生菌(Thermobifidia)、或大洋芽孢杆菌多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如具有酶活性的大肠杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、螺杆菌、黄杆菌、梭杆菌、泥杆菌、奈瑟氏菌、或脲原体属多肽。
[0247]在一方面，该多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌多肽。
[0248]在另一方面，该多肽是具有酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种多肽。
[0249]在另一方面，该多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、或变铅青链霉菌多肽。
[0250]具有酶活性的多肽还可以是真菌多肽，并且更优选地是一种具有酶活性的酵母多肽，如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属多肽；或更优选地是一种具有酶活性的丝状真菌多肽，如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟腊菌属、毛_壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、IE齿菌属、蘑燕属、小腔球菌属、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、根毛霉菌属、裂裙菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属多肽。
[0251]在一方面，该多肽是具有酶活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、或卵形酵母多肽。
[0252]在另一方面，该多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、租金抱子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆抱状键抱、谷类键抱、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉菌、黄抱平革菌、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢壳霉、Thielavia fimet1、小孢梭孢壳霉、卵孢梭孢壳霉、Thielaviaperuviana、瘤孢梭孢壳霉、毛梭孢壳霉、Thielavia subthermophila、土生梭孢壳霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、或褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)多肽。
[0253]还可以使用具有酶活性的多肽的化学修饰或蛋白质工程化的突变体。
[0254]酶组合物的一种或多种(例如，数种)组分可以是重组组分，即，通过克隆编码该单一组分的DNA序列并且随后用该DNA序列转化细胞并且在宿主中表达产生(参见，例如，WO 91/17243和WO 91/17244)。该宿主优选是异源宿主(酶对于宿主来说是外源的)，但该宿主在某些条件下也可以是同源宿主(酶对于宿主来说是原生的)。单组分纤维素分解蛋白还可以通过从发酵液中纯化这种蛋白质来制备。
[0255]在一方面，该一种或多种(例如，数种)纤维素分解酶包含商业纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业纤维素分解酶制剂的实例包括:(例如)CELLIC?CTec (诺维信 Α/S 公司)、CELLIC? CTec2 (诺维信 A/S 公司)、CELLIC? CTec3 (诺维信Α/S公司)、CELLUCLAST?(诺维信Α/S公司)、NOVOZYMtmI88 (诺维信Α/S公司)、CELLUZYME?(诺维信Α/S公司)、CEREFL0?(诺维信A/S公司)、以及ULTRAFL0?(诺维信Α/S 公司)、ACCELERASE? (杰能科国际公司(Genencor Int.)), LAMINEX?(杰能科国际)、SPEZYME?CP (杰能科国际)、FILTRASE? NL (帝斯曼(DSM)) ； METHAPLUS? S/LlOO (帝斯曼)、R0HAMENT?7069W(罗姆股份有限公司(R0hm GmbH))、FIBREZYME?LDI (Dyadic 国际有限公司(Dyadic Internat1nal, Inc.))、FIBREZYME? LBR(Dyadic国际有限公司)、或VISCOSTAR? 150L(Dyadic国际有限公司)。以从约0.001wt%至约5.0wt %的固体,例如0.025wt%至约4.0wt %的固体、或约0.005wt%至约2.0wt %的固体的有效量添加纤维素酶。
[0256]可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于:解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(W0 91/05039 ；W0 93/15186 ;美国专利号 5，275，944 ；W0 96/02551 ;美国专利号 5，536，655 ；W0 00/70031 ；W0 05/093050);褐色高温双歧菌(Thermobifidafusca)内切葡聚糖酶III (WO 05/093050);以及褐色高温双歧菌内切葡聚糖酶V(TO05/093050)。
[0257]可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于:里氏木霉内切葡聚糖酶I (彭蒂莱(Penttila)等人，1986，基因45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANK?登录号M15665);里氏木霉内切葡聚糖酶II (萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，基因63:11-22)，里氏木霉&15八内切葡聚糖酶II (GENBANK?登录号M19373);里氏木霉内切葡聚糖酶III (奥卡达(Okada)等人，1988,应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microb1l.)64:555-563，GENBANK?登录号AB003694);里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，分子微生物学(Molecular Microb1logy) 13:219-228，GENBANK? 登录号Z33381);棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人，1990，核酸研究18:5884);川地曲霉(spergillus kawachii)内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人，1995,当代遗传学(CurrentGenetics) 27:435-439);胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，基因90:9-14);尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK?登录号L29381);灰腐质霉高温变种内切葡聚糖酶(GENBANK?登录号AB003107);热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GENBANK? 登录号 MAL515703);粗糙链孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK?登录号XM_324477);特异腐质霉内切葡聚糖酶V ;嗜热毁丝霉CBSl 17.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basid1mycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133 内切葡聚糖 酶(GENBANK? 登录号 Ml5665)。
[0258]适用于本发明的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于:棘孢曲霉纤维二糖水解酶II (W0 2011/059740)、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶1、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I1、特异腐质霉纤维二糖水解酶1、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II (W0 2009/042871)、Thielaviahyrcanie纤维二糖水解酶II (W02010/141325)、土生梭孢壳霉纤维二糖水解酶II (CEL6A，WO 2006/074435)、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶I1、以及褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶II (W0 2010/057086)。
[0259]适用于本发明的β_葡糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的β-葡糖苷酶:棘孢曲霉(川口(Kawaguchi)等人，1996，基因173:287-288)、烟曲霉(TO 2005/047499)、黑曲霉(丹(Dan)等人，2000，生物化学杂志(J.B1l.Chem.)275:4973-4980)、米曲霉(W0 2002/095014)、巴西青霉菌 IBT20888 (W0 2007/019442和TO 2010/088387)、土生梭孢壳霉(W02011/035029)、以及褐孢长毛盘菌(W02007/019442)。
[0260]葡糖苷酶可以是一种融合蛋白。在一方面，葡糖苷酶是米曲霉葡糖苷酶变体BG融合蛋白(W0 2008/057637)或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(W0 2008/057637)。
[0261]其他有用的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β_葡糖苷酶披露于使用根据以下的分类的许多糖基水解酶家族中:亨利萨特.B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类，生物化学杂志280:309-316 ;以及亨利萨特.Β.和贝洛赫.Α.，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类，生物化学杂志316:695-696。
[0262]可以用于本发明的其他纤维素分解酶描述于以下文献中:W0 98/13465、WO98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、WO 2002/101078、WO 2003/027306, WO 2003/052054, W02003/052055, WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、W02004/016760, WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065, W02005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005,W02006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、W02008/008793、美国专利号5，457，046、美国专利号5，648，263、以及美国专利号5，686，593。
[0263]在本发明的方法中，具有纤维素分解增强活性的任何GH61多肽都可以用作酶组合物的组分。
[0264]适用于本发明的方法的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的实例包括但不限于来自以下各项的GH61多肽:土生梭孢壳霉(W0 2005/074647、WO 2008/148131、以及 TO 2011/035027)、金黄色嗜热子囊菌(W02005/074656 和 WO 2010/065830)、里氏木霉(W0 2007/089290)、嗜热毁丝霉(W0 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、以及W02009/085868)、烟曲霉(W0 2010/138754);来自以下各项的GH61多肽:嗜松青霉(W02011/005867)、嗜热子囊菌属菌种(W0 2011/039319)、青霉菌属种(W0 2011/041397)、以及甲壳嗜热子囊菌(W0 2011/041504)。
[0265]在一方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在根据W02008/151043的可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。
[0266]在另一方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在二氧基化合物、双环化合物、杂环化合物、含氮 化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料(如预处理的玉米秸杆(PCS))获得的液剂的存在下使用。
[0267]二氧基化合物可以包括含有两个或更多个氧原子的任何适合的化合物。在一些方面，二氧基化合物包含如在此所描述的取代的芳基部分。二氧基化合物可以包含一个或多个(例如，数个)羟基和/或羟基衍生物，而且包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基部分。二氧基化合物的非限制性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3，4- 二羟基苯甲酸；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯二醇；连苯三酚；没食子酸；3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯；2，3，4-三羟基二苯甲酮；2，6- 二甲氧基苯酚；芥子酸；3，5- 二羟基苯甲酸；4_氯-1，2-苯二醇；4_硝基-1，2-苯二醇；丹宁酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基富马酸；2_ 丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2，4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2，4，4’ -三羟基二苯甲酮；顺-2- 丁烯-1，4- 二醇；3，4- 二羟基-3-环丁烯-1，2- 二酮；二羟基丙酮；丙烯醛缩醛；4_羟基苯甲酸甲酯；4_羟基苯甲酸；以及3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯；或其盐或溶剂化物。
[0268]双环化合物可以包括如在此所描述的任何适合的取代的稠合环系统。这些化合物可以包含一个或多个(例如，数个)另外的环，并且除非另外说明，否则不限于具体数目的环。在一方面，双环化合物是一种类黄酮。在另一方面，双环化合物是一种任选取代的异类黄酮。在另一方面，双环化合物是一种任选取代的花色离子(flavylium 1n),如一种任选取代的花色素或任选取代的花色素苷、或其衍生物。双环化合物的非限制性实例包括:表儿茶素、槲皮素、杨梅黄酮、紫衫叶素、堪非醇、桑色素、刺槐素、柚皮素、异鼠李素、芹黄素、矢车菊素、矢车菊素苷、黑豆多酚、花青素鼠李葡糖苷、或其盐或溶剂合物。
[0269]杂环化合物可以是如在此所描述的任何适合的化合物，如包含一个杂原子的一种任选取代的芳香族或非芳香族环。在一方面，杂环是包含一个任选取代的杂环烷基部分或一个任选取代的杂芳基部分的一种化合物。在另一方面，任选取代的杂环烷基部分或任选取代的杂芳基部分是一个任选取代的5元杂环烷基或一个任选取代的5元杂芳基部分。在另一方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基部分是选自以下各项的一个任选取代的部分:吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基、二氢噻吩并-吡唑基、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基、氮杂环庚三烯基、硫杂环庚三烯基、哌啶基、以及氧杂环庚三烯基。在另一方面，任选取代的杂环烷基部分或任选取代的杂芳基部分是一个任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限制性实例包括:(1，2-二羟乙基)-3，4-二羟呋喃-2(5H)_酮、4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮、5-羟基_2(5H)_呋喃酮、[1，2- 二羟乙基]呋喃-2,3,4 (5H)-三酮、α-羟基-Y-丁内酯、核糖酸内酯、己醒糖酸Y -内酯(aldohexuronicaldohexuronic acid Y-lactone)、葡糖酸 δ -内酯、4_ 羟基香豆素、二氢苯并呋喃、5-(羟甲基)糠醛、联糠醛、2 (5Η)-呋喃酮、5，6- 二氢-2Η-吡喃-2-酮、以及5，6- 二氢-4-羟基-6-甲基-2Η-吡喃-2-酮、或其盐或溶剂化物。
[0270]含氮化合物可以是具有一个或多个氮原子的任何适合的化合物。在一方面，含氮化合物包含一个胺、亚胺、羟胺、或氮氧化物部分。含氮化合物的非限制性实例包括:丙酮肟、紫尿酸、吡啶-2-醛肟、2-氨基苯酚、I, 2-苯二胺、2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧基、5，6，7，8-四氢生物蝶呤、6 ，7- 二甲基-5，6，7，8-四氢蝶呤、以及马来酰胺酸、或其盐或溶剂化物。
[0271]醌化合物可以是如在此所描述的包含一个醌部分的任何适合的化合物。醌化合物的非限制性实例包括:1，4-苯醌、1，4-萘醌、2-羟基-1，4-萘醌、2，3- 二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌或辅酶Qq、2，3，5,6-四甲基-1，4-苯醌或杜醌、1，4-二羟基蒽醌、3-羟基-1-甲基-5，6-吲哚啉二酮或肾上腺素红、4-叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯醌、吡咯并喹啉醌、或其盐或溶剂化物。
[0272]含硫化合物可以是包括一个或多个硫原子的任何适合的化合物。在一个方面，含硫化合物包含一个选自以下各项的部分:亚硫酰基、硫醚、亚磺酰基、磺酰基、硫酰胺、磺酰胺、磺酸以及磺酸酯。含硫化合物的非限制性实例包括乙硫醇；2_丙硫醇；2_丙烯-1-硫醇；2_巯基乙磺酸；苯硫酚；苯-1，2- 二硫醇；半胱氨酸；蛋氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或其盐或溶剂化物。
[0273]在一方面，以上所描述的这种化合物对纤维素材料的有效量，作为与纤维素的葡糖基单元的摩尔比是约10_6至约10，例如，约10_6至约7.5、约10_6至约5、约10_6至约2.5、约I(T6至约1、约I(T5至约1、约I(T5至约10'约I(T4至约10'约I(T3至约10'或约I(T3至约10_2。在另一方面，以上所描述的这种化合物的有效量是约0.1 μΜ至约1Μ，例如，约0.5 μ M 至约 0.75Μ、约 0.75 μ M 至约 0.5Μ、约 I μ M 至约 0.25Μ、约 I μ M 至约 0.1Μ、约 5 μ M至约50mM、约10 μ M至约25mM、约50 μ M至约25mM、约10 μ M至约10mM、约5 μ M至约5mM、或约0.1mM至约ImM。
[0274]术语“液剂(liquor) ”意指在如在此所描述的条件下，由处理浆料中的木质纤维素和/或半纤维素材料、或其单糖(例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖等)所产生的溶液相(水相、有机相抑或其组合)、以及其可溶性内容物。用于GH61多肽的纤维素分解增强的液剂可以通过，任选在催化剂(例如酸)的存在下、任选在有机溶剂的存在下、并且任选与物理破坏一种木质纤维素或半纤维素材料(或原料)组合，通过施加热和/或压力来对该材料进行处理，并且然后将溶液与残余固体分离来产生。这类条件确定在由纤维素酶制剂水解纤维素底物的过程中，通过液剂与GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。该液剂可以使用本领域中的标准方法(如过滤、沉积、或离心)与处理的材料分离。
[0275]在一方面，该液剂对纤维素的有效量是约10_6至约10g/g纤维素，例如，约10_6至约7.5g、约ICT6至约5g、约ICT6至约2.5g、约ICT6至约lg、约ICT5至约lg、约ICT5至约104、约I(T4至约10、、约I(T3至约10、、或约I(T3至约l(T2g/g纤维素。
[0276]在一方面，该一种或多种(例如，数种)半纤维素分解酶包含商业半纤维素分解酶制剂。适用于本发明的商业半纤维素分解酶制剂的实例包括:(例如)SHEARZYME?(诺维信公司 A/S)、CELLIC? HTec (诺维信公司 A/S)、CELLIC? HTec2 (诺维信公司 A/S)、CELLIC? HTec3 (诺维信公司 A/S)、VISCOZYME? (诺维信公司A/S)、ULTRAFLO? (诺维信公司A/S)、PULPZYME? HC (诺维信公司 A/S)、MULTIFECT?.木聚糖酶(杰能科)、ACCELLERASE? XY (杰能科)、ACCELLERASE? XC(杰能科)、ECOPULP? TX-200A(AB 酶制剂公司(AB Enzymes))、HSP6000木聚糖酶(帝斯曼)、DEP0L?333P (生物催化剂有限公司(B1catalysts Limit)，英国威尔士(Wales, UK))、DEP0L?740L(生物催化剂有限公司，英国威尔士)以及DEP0L?762P(生物催化剂有限公司，英国威尔士 )。
[0277]适用于本发明的方法的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下各项的木聚糖酶:棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790 ；W0 94/21785)、烟曲霉(W02006/078256)、嗜松青霉菌(W02011/041405)、青霉菌属种(W02010/126772)、土生梭孢壳霉 NRRL8126(W0 2009/079210)、以及褐孢长毛盘菌GHlO (W0 2011/057083)。
[0278]适用于本发明的方法的β -木糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的β -木糖苷酶:粗糙链孢菌(SwissProt登录号Q7S0W4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)、以及埃默森踩节菌(Talaromyces emersonii) (SwissProt 登录号 Q8X212)。
[0279]适用于本发明的方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自以下各项的乙酰木聚糖酯酶:棘孢曲霉(W0 2010/108918)、球毛壳菌(Uniprot登录号Q2GWX4)、细毛壳菌(Chaetomium gracile) (GeneSeqP 登录号 AAB82124)、特异腐质霉 DSM1800 (W02009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina) (TO 2005/001036)、嗜热毁丝霉(W02010/014880)、粗糙链孢菌(UniProt 登录号 q7s259)、颖枯壳针孢(Phaeosphaerianodorum) (Uniprot 登录号 Q0UHJ1)、以及土生梭孢壳霉 NRRL8126 (W02009/042846)。
[0280]适用于本发明的方法的阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)(阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase))的实例包括但不限于来自以下各项的阿魏酸酯酶:特异腐质霉 DSM1800 (W0 2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri) (UniProt 登录号A1D9T4)、粗糙链孢菌(UniProt登录号Q9HGR3)、橘灰青霉菌(WO 2009/127729)、以及土生梭孢壳霉(W0 2010/053838 和 WO 2010/065448)。
[0281]适用于本发明的方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的阿拉伯呋喃糖苷酶:黑曲霉(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉DSM1800 (W02006/114094 和 WO 2009/073383)、以及巨多孔菌(M.giganteus) (W0 2006/114094)。
[0282]适用于本发明的方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的ct -葡糖醒酸糖苷酶:棒曲霉(Aspergillus clavatus) (UniProt登录号alccl2)、烟曲霉(SwissProt 登录号 Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot 登录号 Q96WX9)、土曲霉(Aspergillusterreus) (SwissProt 登录号 Q0CJP9)、特异腐质霉(W0 2010/014706)、橘灰青霉(W02009/068565)、埃默森踝节菌(UniProt登录号Q8X211)、以及里氏木霉(Uniprot登录号Q99024)。
[0283]用于本发明的方法的具有酶活性的多肽可以通过在含有适合碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上，使用本领域中已知的程序发酵上述微生物菌株来产生(参见，例如，班尼特.J.W.(Bennett, J.W.)和拉热.L.(LaSure, L.)(编辑)，真菌中的更多基因操纵(More Gene Manipulat1ns in Fungi),学术出版社,加利福尼亚州，1991)。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。适合用于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域中是已知的(参见，例如，贝利.J.E.(Bailey, J.E.)和奥利斯.D.F.(Ollis, D.F.)，生物化学工程基础(B1chemicalEngineering Fundamentals)，麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company),纽约，1986)。 [0284]发酵可以是导致酶 或蛋白质表达或分离的任何细胞培养方法。因此，发酵可以理解为包括在适合的培养基中并且在允许该酶表达或分离的条件下进行摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、进料分批发酵或固态发酵)。通过以上所描述的方法产生的所得酶可以从发酵培养基中回收并且通过常规程序纯化。
[0285]发酵。可以通过能够将糖直接或间接发酵成所希望的发酵产物的一种或多种(例如，数种)发酵微生物发酵从水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”是指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费性醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的发酵方法。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物体，并且可以由本领域的技术人员容易地确定。
[0286]在发酵步骤中，预处理和酶水解步骤所导致的从纤维素材料释放的糖由发酵生物体(如酵母)发酵成一种产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是分开的或同时的。
[0287]在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何适合的水解的纤维素材料。通常基于所希望的发酵产物(即，要从发酵获得的物质)和所采用的方法来选择材料，如本领域中所熟知的。
[0288]术语“发酵培养基”在此可理解为指在添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的培养基。
[0289]“发酵微生物”是指适合在所希望的发酵过程中使用以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌生物体和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体、或其组合。己糖和戊糖发酵生物体二者均是本领域中所熟知的。适合的发酵微生物能够将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所希望的发酵产物。产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例由琳(Lin)等人，2006，应用微生物学与生物技术69:627-642描述。
[0290]能够发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌生物体和真菌生物体，如酵母。优选酵母包括以下各项的菌株:假丝酵母属、克鲁维酵母属、以及酵母菌属，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、马克斯克鲁维酵母、以及酿酒酵母。
[0291]能够以其天然状态发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌生物体和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属菌株，优选休哈塔假丝酵母(C.sheatae)或萨纳瑞西斯假丝酵母；和毕赤酵母属菌株，优选树干毕赤酵母(P.Stipitis),如树干毕赤酵母CBS5773。优选的戍糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)菌株,优选嗜鞋管囊酵母(P.tannophilus)。不能发酵戍糖(如木糖和阿拉伯糖)的生物体可以通过本领域已知方法来进行遗传修饰而发酵戊糖。
[0292]能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括，例如，凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、phytofermentans 梭菌(Clostridium phytofermentans)、土芽抱杆菌属种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)(菲利皮迪斯，1996，见上文)。
[0293]其他发酵生物体包括以下各项的菌株:芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如萨纳瑞西斯假丝酵母、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(C.diddensiae)、近平滑假丝酵母(Candida par apsilosis)、C.naedodendra、布朗克假丝酵母(C.blankii)、嗜虫假丝酵母(C.entomophilia)、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、产朊假丝酵母(C.utilis)、以及休哈塔假丝酵母；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、以及C.phytofermentans ;大肠杆菌，特别是已被遗传修饰以改善乙醇产率的大肠杆菌菌株；土芽孢杆菌属种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala);克雷伯氏菌属(Klebsiella),如产酸克雷伯氏菌(K.0xytoca);克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、乳酸克鲁维酵母(K.1actis)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、以及脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe);热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter),如解糖热厌氧杆菌、以及发酵单胞菌属(Zymomonas),如运动发酵单胞菌。
[0294]在一个优选方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选方面,酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个优选方面,酵母是假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是布朗克假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是嗜虫假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选方面,酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一个更优选方面,酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选方面，酵母是耐热克鲁维酵母。在另一个优选方面，酵母是管囊酵母属。在另一个更优选方面，酵母是嗜鞋管囊酵母。在另一个优选方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个优选方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选方面，酵母是酵母属种。在另一个更优选方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选方面,酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
[0295]在一个优选方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个优选方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选方面，细菌是Clostridium phytofermentans?在另一个更优选方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选方面，细菌是土芽孢杆菌属种。在另一个更优选方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个优选方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选方面，细菌是运动发酵单胞菌。
[0296]适用于乙醇产生的可商购的酵母包括，例如，BI OFERMtmAFT和XR (NABC-北美生物产品基团(North American B1products Corporat1n),美国佐治亚州(GA, USA))、ETHANOL RED?酵母(弗曼迪斯/乐斯福(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALI?(菲氏酵母(Fleischmann，s Yeast)，美国)、FERM10L?(帝斯曼配料部(DSM Specialties))、GERTSTRAND? (Gert Strand AB,瑞士(Sweden))、以及 SUPERSTART?和 THERM0SACC?新鲜酵母(乙醇技术(Ethanol Technology),美国威斯康辛州(WI, USA)) ?
[0297]在一个优选方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。 [0298]将异源基因克隆到多种发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(陈(Chen)和霍(Ho)，1993，酿酒酵母中毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆和改善表达(Cloning and improving the express1n of Pichia stipitisxylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae),应用生物化学与生物技术(Appl.B1chem.B1technol.) 39-40:135-147 ;霍等人，1998，能够有效共发酵葡萄糖和木糖的遗传工程化的酵母菌属酵母(Genetically engineered Saccharomyces yeastcapable of effectively cofermenting glucose and xylose),应用与环境微生物学64:1852-1859 ;科特(Kotter)和西拉塞(Ciriacy)，1993，酿酒酵母发酵木糖(Xylosefermentat1n by Saccharomyces cerevisiae),应用微生物学与生物技术(Appl.Microb1l.B1technol.) 38:776-783 ;维尔福森(Walfridsson)等人，1995,过表达编码戊糖磷酸途径酶转酮醇酶和转醛醇酶的TKLl和TALl基因的木糖代谢酿酒酵母菌株(Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKLland TALlgenes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolaseand transaldolase),应用与环境微生物学 61:4184-4190 ；凯拍(Kuyper)等人，
2004,用于有效厌氧木糖发酵的酿酒酵母的最小代谢工程化:原理的证实(Minimalmetabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylosefermentat1n:a proof of principle),欧洲微生物学会联合会酵母研究(FEMS YeastResearch) 4:655-664 ;比尔(Beall)等人，1991,通过重组大肠杆菌从木糖和其他糖产生乙酉享的参数石开究(Parametric studies of ethanol product1n from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli),生物技术与生物工程(B1tech.B1eng.)38:296-303 ;英格拉姆(Ingram)等人，1998，用于乙醇产生的细菌的代谢工程化(Metabolic engineering of bacteria for ethanol product1n),生物技术与生物工程58:204-214;张(Zhang)等人，1995，产生乙醇的运动发酵单胞菌中戊糖代谢途径的代谢工程化(Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenicZymomonas mobilis),科学(Science) 267:240-243 ;狄安姐(Deanda)等人，1996,通过代谢途径工程化开发发酵阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株(Development of anarabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering),应用与环境微生物学62:4465-4470 ；W0 2003/062430，木糖异构酶)。
[0299]在一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选方面,遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
[0300]本领域中熟知的是，以上所描述的生物体还可以用于产生其他物质，如在此所描述。
[0301]典型地向降解的纤维素材料或水解物中添加发酵微生物，并且进行发酵持续约8至约96小时，例如约24至约60小时 。温度典型地在约26°C至约60°C之间，例如约32°C或50°C，并且pH为约pH3至约pH8，例如pH4至5、6、或7。
[0302]在一方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并且进行发酵持续约12至约96小时，如典型地24至60小时。在另一方面，温度优选在约20°C至约60°C之间，例如约25°C至约50°C、约32°C至约50°C、或约32°C至约50°C，并且pH通常是从约pH3至约PH7，例如约pH4至约pH7。然而，一些发酵生物体(例如细菌)具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以每ml发酵液大约15至1012，优选从大约17至101(1，特别是大约2 X 18个活细胞计数的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指南可以见于例如“醇教材” (“The Alcohol Textbook”)(K ?雅克(K.Jacques)、Τ.P.里昂(Τ.P.Lyons)以及D.R.凯尔索尔(D.R.Kelsall)编辑,诺丁汉大学出版社(Nottingham University Press)，联合王国(United Kingdom) 1999),其通过引用结合在此。
[0303]发酵刺激剂可以与在此所描述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵方法，特别是改进发酵微生物的性能，如，提高速度和乙醇产率。“发酵刺激剂”是指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺、卩P多醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E，例如参见阿尔弗雷多(Alfenore)等人，通过在进料分批方法过程中的一种维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母的存活力(Improving ethanolproduct1n and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feeding strategyduring fed-batch process),施普林格(2002),其特此通过引用结合。矿物质的实例包括可以提供含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn以及Cu的营养素的矿物质和矿物盐。[0304]发酵产物:发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是而不限于:醇(例如，阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1，3_丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨糖醇、以及木糖醇)；烧烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)；环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)；烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO));异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸)；以及聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
[0305]在一个优选方面，发酵产物是一种醇。应理解的是，术语“醇”涵盖包含一个或多个羟基部分的物质。在一个更优选方面，该醇是正丁醇。在另一个更优选方面，该醇是异丁醇。在另一个更优选方面，该醇是乙醇。在另一个更优选方面，该醇是甲醇。在另一个更优选方面，该醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选方面，该醇是丁二醇。在另一个更优选方面，该醇是乙二醇。在另一个更优选方面，该醇是丙三醇。在另一个更优选方面，该醇是甘油。在另一个更优选方面，该醇是1，3-丙二醇。在另一个更优选方面，该醇是山梨糖醇。在另一个更优选方面，该醇是木糖醇。参见，例如，贡.C.S.、卡奥.N.J.、杜.J.、以及曹.G.T.，1999，由可再生资源生产乙醇，生物化学工程/生物技术的进展，舍佩尔.Τ.编辑，施普林格，德国海德堡柏林，65:207-241 ;西尔韦拉.Μ.Μ.(Silveira, Μ.Μ.)和乔纳斯.R.(Jonas, R.),2002,山梨糖醇的生物技术生产(The b1technological product1n of sorbitol)，应用微生物学与生物技术59:400-408 ;尼加姆.P.(Nigam, P.)和辛格*D.，1995，用于木糖醇-一种糖替代品的发酵产生工艺(Processes for fermentative product1n of xylitol - asugar substitute),加工生物化学(Process B1chemistry) 30 (2): 117-124 ;伊泽吉.T.C.(Ezeji, T.C.)、库雷希.N.(Qureshi, N.)和布拉舍克.H.P.(Blaschek, Η.Ρ.)，2003，通过拜季林斯基羧菌BAlO l生产丙酮、丁醇和乙醇并且通过气提原位回收(Product1n ofacetone, butanol and ethanol by Clostridium bei jerinckii BAlOland in situ recoveryby gas stripping),微生物与生物技术世界杂志(World Journal of Microb1logy andB1technology)19(6):595-603。
[0306]在另一个优选方面，发酵产物是一种烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。在另一个更优选方面，该烷烃是戊烷。在另一个更优选方面，该烷烃是己烷。在另一个更优选方面，该烷烃是庚烷。在另一个更优选方面，该烷烃是辛烷。在另一个更优选方面，该烷烃是壬烷。在另一个更优选方面，该烷烃是癸烷。在另一个更优选方面，该烷烃是十一烷。在另一个更优选方面，该烷烃是十二烷。
[0307]在另一个优选方面，发酵产物是一种环烷烃。在另一个更优选方面，该环烷烃是环戊烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环己烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环庚烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环辛烷。
[0308]在另一个优选方面，发酵产物是一种烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。在另一个更优选方面，该烯烃是戊烯。在另一个更优选方面，该烯烃是己烯。在另一个更优选方面，该烯烃是庚烯。在另一个更优选方面，该烯烃是辛烯。[0309]在另一个优选方面，发酵产物是一种氨基酸。在另一个更优选方面，该有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是苏氨酸。参见，例如，理查德.Α.(Richard, A.)和马加里蒂斯.A.(Margaritis, A.), 2004,用于聚(谷氨酸)产生和其他微生物生物聚合物的分批发酵动力学的经验模型(Empirical modeling of batch fermentat1n kinetics forpoly (glutamic acid) product1n and other microbial b1polymers),生物技术与生物工程 87(4):501-515。
[0310]在另一个优选方面，发酵产物是一种气体。在另一个更优选方面，该气体是甲烷。在另一个更优选方面，该气体是h2。在另一个更优选方面，该气体是co2。在另一个更优选方面，该气体是CO。参见,例如,片冈.N.(Kataoka, N.)、A.米亚(A.Miya)、以及K.桐山(K.Kiriyama), 1997,关于通过产氢厌氧细菌连续培养系统产生氢气的研究(Studies onhydrogen product1n by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobicbacteria)，水科学与技术(Water Science and Technology) 36 (6-7):41-47 ;以及古那森兰.ν.N.(Gunaseelan V.N.),生物质与生物能源(B1mass and B1energy)，第 13 (1-2)卷，第83-114页，1997,用于甲烧生产的生物质的厌氧消化:综述(Anaerobic digest1n ofb1mass for methane product1n:A review)。
[0311]在另一个优选方面，发酵产物是异戊二烯。
[0312]在另一个优选方面，发酵产物是一种酮。应理解的是，术语“酮”涵盖包含一个或多个酮部分的物质。在另一个更优选方面，该酮是丙酮。参见，例如，库雷希和布拉舍克，2003，见上文。 [0313]在另一个优选方面，发酵产物是有机酸。在另一个更优选方面，该有机酸是乙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是醋酮酸。在另一个更优选方面，该有机酸是己二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选方面，该有机酸是柠檬酸。在另一个更优选方面，该有机酸是2，5- 二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选方面，该有机酸是甲酸。在另一个更优选方面，该有机酸是富马酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选方面，该有机酸是戊二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是3-二羟基丙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是衣康酸。在另一个更优选方面，该有机酸是乳酸。在另一个更优选方面，该有机酸是苹果酸。在另一个更优选方面，该有机酸是丙二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是草酸。在另一个更优选方面，该有机酸是丙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是琥珀酸。在另一个更优选方面，该有机酸是木糖酸。参见，例如，陈.R.(Chen, R.)和李.Y.Y.，1997，用于由纤维素生物质产生乳酸的膜介导的萃取发酵(Membrane-mediated extractive fermentat1n for lactic acid product1n fromcellulosic b1mass)，应用生物化学与生物技术63-65:435-448。
[0314]在另一个优选方面，发酵产物是聚酮化合物。
[0315]回收。可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基中回收发酵产物，这些方法包括但不限于:色谱法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏、或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料中分离和纯化醇。可以获得纯度高达约96体积％的乙醇，其可以用作(例如)燃料乙醇、饮用乙醇，即，饮用中性酒、或工业乙醇。
[0316]植物
[0317]本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分、或植物细胞，这些植物包含本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽。该杂合多肽可以从植物或植物部分回收。可替代地，含有该杂合多肽的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或进料的质量，例如，改善营养价值、可口性、以及流变性能，或用以破坏抗营养因子。
[0318]转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium);温带草,如翦股颖属(Agrostis);以及谷类,例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
[0319]双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆和大豆)、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物体拟南芥)。
[0320]植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、连同包含这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室，如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外,任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
[0321]同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
[0322]表达杂合多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞:将编码杂合多肽的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
[0323]表达构建体宜为包含编码杂合多肽的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调控序列可操作地连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用引入DNA的方法)。
[0324]例如，根据希望在何时、何处、以及如何表达杂合多肽来选择调控序列，如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列。例如，编码多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，如种子或叶。调控序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(PlantPhys1logy)86:506 描述。
[0325]对于组成型表达，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白I启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell) 21:285-294 ;克里斯滕森等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.B1l.) 18:675-689 ;张(Zhang)等人，1991，植物细胞(PlantCell) 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如:来自忙藏库组织(storage sinktissue)(如种子、马铃薯块莖、以及果实)的启动子(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi)，1990，遗传学年评(Ann.Rev.Genet.) 24:275-303);或来自代谢库组织(如分生组织)的启动子(伊托(Ito)等人，1994，植物分子生物学24:863-878);种子特异性启动子，如来自稻的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白、或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，植物细胞生理学(Plant Cell Phys1l.) 39:885-889);来自豆球蛋白B4和蚕豆的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(康拉德(Conrad)等人，1998,植物生理学杂志(J.PlantPhys1l.) 152:708-711);来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，植物细胞生理学39:935-941);来自欧洲油菜(Brassica napus)的忙藏蛋白napA启动子；或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番爺的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993,植物生理学102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.) 248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯Pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，启动子可以通过非生物处理，如温度、干旱、或盐度变化来诱导，或通过外源施加的激活启动子的物质，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸、以及赤霉酸)、以及重金属来诱导。
[0326]还可以使用启动子增强子元件来在该植物中实现杂合多肽的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是放置在启动子与编码杂合多肽的多核苷酸之间的内含子。例如，许等人，1993，同上文，披露了使用稻肌动蛋白I基因的第一内含子来增强表达。 [0327]选择性标记基因和表达构建体的任何其他部分可以选自本领域种可用的那些。
[0328]核酸构建体是根据本领域已知的常规技术并入到植物基因组中，这些常规技术包括:农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化、以及电穿孔(盖瑟(Gasser)等人，1990,科学244:1293 ;波特里库斯(Potrykus), 1990,生物/技术(B1/Technology) 8:535 ;岛本(Shimamoto)等人，1989,自然(Nature) 338:274)。
[0329]目前根癌农杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281 ;岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.0pin.B1technol.) 5:158-162 ;瓦西尔(Vasil)等人，1992,生物 /技术10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学21:415-428所描述。另外的转化方法包括在美国专利号6，395，966和7，151，204中所描述的那些(这两个专利均通过引用以其全文结合在此)。
[0330]转化之后，根据本领域熟知的方法对已经并入表达构建体的转化体进行选择并且使其再生成为完整植物。通常转化程序被设计成通过使用例如用两种分开的T-DNA构建体共转化或通过特异性重组酶进行的选择基因的位点特异性切除，在再生期间或在后代中选择性清除选择基因。
[0331]除用本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可以通过使具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码杂合多肽的构建体引入具体植物品种中，而无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖这类植物的子代。如在此所使用，子代可以指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。这种子代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过起始系与供体植物系交叉授粉而将转基因引入植物系中。这类步骤的非限制性实例在美国专利号7，151，204中描述。
[0332]可以通过回交转化方法产生植物。例如，植物包括被称为回交转化的基因型、系、近交种、或杂交种的植物。
[0333]可以使用遗传标记来辅助本发明的一种或多种转基因从一种遗传背景渗入到另一种遗传背景中。相对于常规育种，标记辅助选择提供了很多优点，优点在于它可以用于避免由表型变异引起的错误。另外，遗传标记可以提供关于具体杂交的个别子代中优良种质的相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与一种优良亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，而且还具有相对较大比例的所希望的种质的子代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数最小化。
[0334]本发明还涉及产生本发明的杂合多肽的方法，这些方法包括:(a)在有益于产生该杂合多肽的条件下培养包含编码该杂合多肽的多核苷酸的一种转基因植物或植物细胞；并且任选地(b)回收该杂合多肽。
[0335]通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应被解释为限制本发明的范围。
[0336]实例
[0337]菌株
[0338]通过在45°C下在PDA板上稀释而从自中国云南省收集的堆肥样品中分离真菌菌株NN051602，并且接着通过将单个分生孢子转移到YG板上进行纯化。根据形态特征和ITSrDNA序列二者，将菌株NN051602鉴别为埃默森青霉菌。
[0339]通过在45 °C下稀释在PDA板上而从在中国收集的环境样品中分离真菌菌株NN051303,并且接着通过将单个分生孢子转移到YG琼脂板上进行纯化。根据形态特征和ITS rDNA序列二者，将菌株NN051303鉴别为烟曲霉。
[0340]培养基
[0341]PDA板由39克马铃薯右旋糖琼脂和加至I升的去离子水组成。
[0342]YG板由以下各项组成:5g的酵母萃取物、1g的葡萄糖、20g的琼脂、以及加至I升的去离子水。
[0343]基本培养基板由以下各项组成:342g的蔗糖、20ml的盐溶液(2.6% KC1、2.6%MgSO4.7Η20、7.6% KH2PO4>2ppm Na2B4O7.10H20>20ppm CuSO4.5H20>40ppm FeSO4.7H20>40ppmMnSO4.2H20、40ppm Na2MoO4.2H20、400ppm ZnSO4.7H20)、20g 的琼脂、以及加至 I 升的去离子水。
[0344]YPM培养基由以下各项组成:于去离子水中的1%酵母萃取物、2%蛋白胨、以及2%麦芽糖。
[0345]实例1:基因组DNA制备
[0346]将埃默森青霉菌NN051602在45°C下在PDA板上生长3天。将菌丝体直接从PDA板收集到无菌研钵中，并且在液氮下冷冻。将冷冻的菌丝体通过研钵和研杵磨成细粉，并且使用DNEASY?:Plant Mini试剂盒(凯杰有限公司(QIAGEN GmbH)，德国希尔登(Hi I den, Germany))来分离基因组 DNA。
[0347]将烟曲霉菌株NN051303在45°C下在PDA板上生长3天。将菌丝体直接从PDA板收集到无菌研钵中，并且在液氮下冷冻。将冷冻的菌丝体通过研钵和研杵磨成细粉，并且使用DNEASY? Plant Mini试剂盒来分离基因组DNA。
[0348]实例2:通过PCR克隆构建的PeCBH1-AfCBM杂交体
[0349]以下所示的寡核苷酸引物被设计来分别扩增来自埃默森青霉菌NN051602的基因组DNA的全长GH7纤维二糖水解酶I基因和来自烟曲霉NN051303的基因组DNA的CBM结构域。这些引物是由中国北京的英杰公司(Invitrogen)合成的。
[0350]正向引物1:
[0351 ] 5，-ACACAACTGGGGATCCACCatgcttcgacgggctcttc-3，(SEQ ID NO:7)
[0352]反向引物1:
[0353]5，_ttccgccaccggggttcgacgaagcggtgaaggtcgagttgatc_3，(SEQ ID NO:8)
[0354]正向引物2:
[0355]5，-gatcaactcgaccttcaccgcttcgtcgaaccccggtggcggaa-3，(SEQ ID NO:9)
[0356]反向引物2:
[0357]5， -GTCACCCTCTAGATCTctacaggcactgagagtaataatcattcagcttctg-3， (SEQ IDNO:10)
[0358]大写字母是与质粒pPFJ0355 (WO 2011005867)的插入位点同源的区域。小写字母表示埃默森青霉菌GH7纤维二糖水解酶I基因的编码区域，并且粗体字母表示烟曲霉GH7纤维二糖水解酶I CBM结构域的编码区域。
[0359]使用正向引物I和反向引物I来在如下PCR反应液中扩增埃默森青霉菌GH7纤维二糖水解酶I基因，该PCR反应液由以下各项组成:2μ I的埃默森青霉菌基因组DNA、10 μ I的 5Χ PHUS1NtmHF 缓冲液(Finnzymes Oy 公司，芬兰埃斯波(Espoo, Finland) )、1.5 μ I 的DMS0、各为2.5mM的dATP、dTTP、dGTP及dCTP、20皮摩尔的正向引物1、20皮摩尔的反向引物1、以及0.6单位的PHUS10N?高保真度DNA聚合酶(Finnzymes Oy公司，芬兰埃斯波)，最终体积为50 μ I。该扩增是使用佩尔特尔热循环仪(Peltier Thermal Cycler) (MJ研究有限公司(MJ Research Inc.),美国加利福尼亚州南旧金山(South San Francisco, CA, USA))进行的，该热循环仪被编程为在98°C下变性I分钟；5个循环的在98°C下变性15秒、在65°C下退火30秒(其中每个循环降低1°C )、以及在72°C下伸长I分钟；23个循环的各在98°C下15秒、63°C下30秒、以及72°C下I分钟；以及在72°C下最终延伸5分钟。然后将加热块转到4°C浸泡循环。
[0360]使用90mM Tris-硼酸盐和ImM EDTA (TBE)缓冲液，通过1.0 %琼脂糖凝胶电泳来分离反应产物，其中从凝胶切下大约1.5kb产物带，并且根据制造商的说明书，使用ILLUST’RA? GFX? PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(通用电气医疗集团(GEHealthcare),白金汉郡(Buckinghamshire),英国)进行纯化。该PCR产物带被指定为FlPCR产物。
[0361 ] 使用正向引物2和反向引物2来在在如下PCR反应液中扩增烟曲霉GH7纤维二糖水解酶I的CBM结构域，该PCR反应液由以下各项组成:2μ I的烟曲霉基因组DNA、10 μ I的 5X PHUS1NtmHF 缓冲液、1.5 μ I 的 DMS0、各为 2.5mM 的 dATP、dTTP、dGTP 及 dCTP、20 皮摩尔的正向引物2、20皮摩尔的反向引物2、以及0.6单位的PHUS10N?高保真度DNA聚合酶，最终体积为50μ I。该扩增是使用佩尔特尔热循环仪进行的，该热循环仪被编程为在98°C下变性I分钟；5个循环的在98°C下变性15秒、在65°C下退火30秒(其中每个循环降低1°C )、以及在72°C下伸长30秒；23个循环的各在98°C下15秒、63°C下30秒、以及72°C下30秒；以及在72°C下最终延伸5分钟。然后将加热块转到4°C浸泡循环。
[0362]使用TBE缓冲液，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳来分离反应产物，其中从凝胶切下200bp产物带，并且根据制造商的说明书，使用ILLUSTRA? GFX? PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒进行纯化。该PCR产物带被指定为F3 PCR产物。
[0363]根据霍顿(Horton)等人，1989，基因77:61-68将FlPCR产物和F3 PCR产物用于剪接重叠延伸PCR(SOE PCR)中。简单地说，PCR反应液由以下各项组成:10μ I的5XPHUS1NtmHF 缓冲液、1.5 μ I 的 DMSO, 1ng 的 FlPCR 产物、5ng 的 F3PCR 产物、各为 2.5mM的dATP、dTTP、dGTP及dCTP、以及0.6单位的PHUS10N?高保真度DNA聚合酶，最终体积为46μ1。在以下热循环中，FlPCR产物和F3PCR产物用作彼此的引物以进行伸长。该SOE PCR是在佩尔特尔热循环仪中进行的，该热循环仪被编程为在98°C下I个循环I分钟；5个循环的在98°C下变性15秒、在42°C下退火30秒(其中每个循环降低TC )、以及在72°C下伸长80秒；4个循环的各在98°C下15秒、37°C下30秒、以及72°C下80秒；以及在72°C下最终延伸5分钟。然后将加热块转到4°C浸泡循环。将引物对，2μ I的1yM正向引物I和2μ I的1yM反向引物2添加至PCR溶液中，接着进行以下PCR:在98°C下I分钟；5个循环的在98°C下变性15秒、在65°C下退火30秒(其中每个循环降低1°C )、以及在72°C下伸长80秒；23个循环的各在98°C下15秒、63°C下30秒、以及72°C下80秒；以及在72°C下最终延伸5分钟。然后将加热块转到4°C浸泡循环。 [0364]使用TBE缓冲液，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳来分离反应产物，其中从凝胶切下大约1.7kp产物带，并且根据制造商的说明书，使用ILLUSTRA? GFX? PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒进行纯化。该PCR产物被指定为F5PCR产物。
[0365]将质粒pPFJ0355用Bam I和Bgl 11消化，使用TBE缓冲液通过1.0%琼脂糖凝胶电泳来分离，并且根据制造商的说明书，使用ILLUSTRA? GFX? PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒进行纯化。
[0366]使用IN-FUS1N? CF干燥克隆试剂盒(克罗泰克实验室有限公司(ClontechLaboratories, Inc.),美国加利福尼亚州山景城(Mountain View, CA, USA))将 F5PCR 产物与消化的载体连接在一起，从而产生pF5(图1)，其中与烟曲霉GH7纤维二糖水解酶I CBM融合的埃默森青霉菌GH7纤维二糖水解酶I的杂交体的转录是受来自米曲霉α -淀粉酶基因的启动子的控制。简单地说，将用Bam I和Bgl II消化的30ng的pPFJ0355和60ng的F5PCR产物添加至一个反应小瓶，并且通过添加去离子水悬浮在10 μ I的最终体积中。将反应在37°C下孵育15分钟,并且然后在50°C下孵育15分钟。使用5 μ I的反应液来转化大肠杆菌Τ0Ρ10感受态细胞(天根生物科技(TIANGENB1tech)(北京)有限公司，中国北京)。通过菌落PCR来检测含有pF5的大肠杆菌转化体。菌落PCR是一种用于直接从大肠杆菌菌落快速筛选质粒插入片段的方法。简单地说，在于PCR管中的包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、以及从其产生PCR片段的引物对的预混合的PCR溶液等分部分中，通过用无菌尖端挑取并且在该反应溶液中转动该尖端来添加单个菌落。通常筛选7至10个菌落。在PCR程序之后，通过琼脂糖凝胶电泳分析反应液以鉴别具有预期大小的扩增产物的菌落。使用QIAPREP? Spin Miniprep试剂盒(凯杰有限公阿,德国希尔登)来制备质粒DNA。使用3730XL DNA分析器(应用生物系统公司(Applied B1systems, Inc.)，美国加州福斯特市(Foster City, CA, USA))通过DNA测序来确认pF5中插入的杂合基因。
[0367]杂合多肽编码序列的DNA序列和推导的氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 5和SEQ IDNO:6中示出。编码序列是1683bp (包括终止密码子)，它被60bp(核苷酸604至663)和60bp(核苷酸1229至1288)的2个内含子间断。编码蛋白是具有18个残基的信号肽的520个氨基酸。成熟蛋白包含502个氨基酸，具有53.32kDa的预测分子量和4.16的预测等电点。
[0368]实例3 =PeCBH1-AfCBM杂合基因在米曲霉中的表达
[0369]将根据克里斯滕森等人，1988，生物/技术6:1419-1422的方法制备的米曲霉HowB1I (W0 95/35385实例I)原生质体用3 μ g的质粒pF5转化。转化产生约50个转化体。将二十个转化体分离到单独的基本培养基板上。
[0370]将四个转化体分开接种到于24孔板中的3ml的YPM培养基中，并且在30°C下在150rpm振荡下孵育。在3天孵育之后,根据制造商的说明书,使用具有50mM2-(N_吗啉代)乙横酸(MES)的NUPAGE? "NOVEX?,.?^-12% Bis-Tris凝胶(英杰公司(InvitrogenCorporat1n)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad, CA, USA))通过SDS-PAGE对来自每一培养物的20 μ I上清液进行分析。将所得到的凝胶用INSTANTBLUE? (艾本德有限公司(Expedeon Ltd.),英国剑桥巴布拉汉(Babraham Cambridge, UK))进行染色。培养物的SDS-PAGE谱显示大多数转化体具有大约62kDa的主带。这些转化体中的一个被选择作为表达菌株并且被指定为米曲霉05KRR。
[0371]实例4:米曲霉05KRR的发酵
[0372]将斜面培养的米曲霉05KRR用1ml的YPM培养基洗涤并且接种到六个2升烧瓶(各自含有400ml的YPM培养基)中以产生用于表征具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的培养液。在第3天时收获该培养物，并且使用0.45 μ m DURAPORE?膜(密理博公司(Millipore)，美国马萨诸塞州贝德福德(Bedford，MA，USA))进行过滤。
[0373]实例5:来自米曲霉05KRR的重组PeCBH1-AfCBM杂交体的纯化
[0374]将2400ml体积的米曲霉05KRR(实例4)的过滤的培养液用硫酸铵(80%饱和)沉淀，再溶解于50ml的20mM乙酸钠(pH5.5)中，用同一缓冲液透析，并且通过0.45 μ m过滤器过滤。最终体积是80ml。将该溶液施加到在20mM乙酸钠(pH5.5)中平衡的40mlQSEPHAROSE? Fast Flow柱(通用电气医疗集团，白金汉郡，英国)中，并且用线性O至0.2M NaCl梯度来洗脱蛋白质。收集级分并且使用具有50mM MES的NUPAGE?NOVEX? 4% -12% Bis-Tris凝胶通过SDS-PAGE进行分析。汇集含有大约62kDa的条
带的级分。然后将汇集的溶液通过超滤进行浓缩。
[0375]实例6:预处理的玉米秸杆水解测定[0376]在美国能源部国家可再生能源实验室(NREL)中使用1.4wt%硫酸在165°C和107psi下对玉米秸杆进行预处理持续8分钟。预处理的玉米秸杆(PCS)中的水不溶性固形物含有56.5%纤维素、4.6%半纤维素、以及28.4%木质素。通过两阶段硫酸水解、以及随后使用NREL标准分析程序#002通过高效液相色谱法进行的糖分析来测定纤维素和半纤维素。在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分后，使用NREL标准分析程序#003通过重量分析法测定木质素。
[0377]通过在Cosmos ICMG40多效用湿研磨机(EssEmm公司，印度泰米尔纳德邦(TamilNadu, India))中碾磨全浆料PCS来制备碾磨的未洗涤的PCS(干重32.35% )。
[0378]使用2.2ml深孔平板(爱思进(Axygen),美国加州联合市(Un1n City, CA, USA))在1.0ml的总反应体积中进行碾磨的未洗涤的PCS的水解。用50mg的不溶性PCS固形物/ml的含有ImM硫酸锰和不同酶组合物的不同蛋白负载量(表示为mg蛋白质/克纤维素)的50mM乙酸钠(pH5.0)缓冲液进行水解。制备酶组合物并且然后以从50 μ I至200 μ I范围的体积同时添加到所有孔中，以使各反应中的最终体积为1ml。然后使用ALPS-300?板热密封件(Abgene，埃普索姆，英国)将板密封，充分混合，并且在特定温度下孵育72小时。所报道的所有实验一式三份地进行。
[0379]在水解后，使用0.45 μ m MULTISCREEN? 96孔过滤器板(密理博，美国麻萨诸塞州新贝德福德)过滤样品并且如以下所描述分析滤液的糖含量。在不立即使用时，将过滤的等分部分冷冻在_20°C下。通过以下方式测量稀释于0.005M H2SO 4中的样品的糖浓度:使用4.6X250mm AMINEX? HPX-87H柱(伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯)，通过用0.05% w/w苯甲酸-0.005M H2SO4在65°C、0.6ml/分钟的流速下洗脱，并且通过整合来自由纯糖样品标定的折射指数检测(CHEMSTAT1N?、AGILENT? 1100HPLC，安捷伦科技(Agilent Technologies),美国加州圣克拉拉(Santa Clara, CA, USA))的葡萄糖、纤维二糖、以及木糖信号进行定量。使用所得葡萄糖和纤维二糖等效量来计算各反应的纤维素转化的百分比。
[0380]单独测量葡萄糖、纤维二糖、以及木糖。针对适当稀释因子来调节所测量的糖浓度。就碾磨的未洗涤的PCS而言，通过针对零时间点时该碾磨的未洗涤的PCS中的相应背景糖浓度调节所测量的糖浓度来测定酶促产生的糖的净浓度。使用MICROSOFT EXCEL?软件(微软，美国华盛顿里奇兰(Richland, WA，USA))来进行所有HPLC数据处理。
[0381]使用以下等式来计算纤维素转化成葡萄糖的程度:转化％=(葡萄糖浓度/限制消化中的葡萄糖浓度)X100。为了计算转化％，基于纤维素酶对照(10mg里氏木霉纤维素酶/克纤维素)设定一个100%转化点，并且将所有值除以这个数并且然后乘以100。将三份数据点取平均值并且计算标准差。
[0382]实例7:酶组合物的制备
[0383]烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II的制备。如WO 2011/057140中所描述在米曲霉中重组制备烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II (SEQ ID NO: 11 [DNA序列]和SEQ ID NO: 12 [推导的氨基酸序列])。根据制造商的说明书使用400ml SEPHADEX?G-25柱(通用电气医疗集团，英国)将烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II的培养液过滤，并置换缓冲液为20mM Tris (pH8.0)。汇集级分并且调节至1.2M硫酸铵-20mM Tris (pH8.0)。将汇集的级分负载到在具有1.2M硫酸铵的 20mM Tris (ρΗ8.0)中平衡的 PHENYL SEPHAR0SE?6Fast Flow 柱(高低)(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)上，并且用没有硫酸铵的20mM Tris (pH8.0)洗脱结合的纤维二糖水解酶II。汇集级分。
[0384]具有纤维素分解增强活性的青霉菌属种(埃默森)GH61A多肽的制备。根据WO2011/041397重组制备青霉菌属种(埃默森)GH61A多肽(SEQ ID NO: 13[DNA序列]和SEQID NO: 14 [推导的氨基酸序列])。根据W02011/041397纯化青霉菌属种(埃默森)GH61A多肽。
[0385]里氏木霉GH5A内切葡聚糖酶II的制备。根据WO 2011/057140重组制备里氏木霉GH5A内切葡聚糖酶II (SEQ ID NO: 15 [DNA序列]和SEQ ID NO: 16 [推导的氨基酸序列])。根据制造商的说明书使用配备有1kDa聚醚砜膜的切向流浓缩器(颇尔Filtron(PaliFiltron)，美国麻萨诸塞州诺斯伯勒(Northborough，MA，USA))将里氏木霉GH5A内切葡聚糖酶II的培养液过滤、脱盐并置换缓冲液为20mM Tris (pH8.0)。
[0386]烟曲霉GH3Ai3-葡糖苷酶的制备。使用米曲霉作为宿主，根据W02005/047499重组制备(U569) (SEQ ID NO: 17 [DNA序列]和SEQ ID NO: 18 [推导的氨基酸序列])。将培养液过滤并且用20 %乙酸钠调节至pH8.0,这使得溶液浑浊。为了去除浑浊，将该溶液在20000x g下离心20分钟，并且通过0.2 μ m过滤单元(Nalgene,美国纽约罗切斯特(Rochester，NY，USA))过滤上清液。用去离子水稀释滤液，以达到与50mM Tris/HCl (pH8.0)相同的传导率。将调节的酶溶液施加到在50mM Tris-HCl (pH8.0)中平衡的Q SEPHAROSE? Fast Flow柱(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)中，并且用从O至500mM氯化钠的线性梯度进行洗脱。汇集各级分并且用1% (w/v)活性炭处理，以将颜色从β_葡糖苷酶池去除。经通过0.2 μ m过滤单元(Nalgene,美国纽约罗切斯特)过滤悬浮液而去除炭。将 滤液用20%乙酸调节至pH5.0并且用去离子水稀释10倍。将调节的滤液施加到在1mM琥拍酸(pH5.0)中平衡的SP SEPHAROSE? Fast Flow柱(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)中，并且用从O至500mM氯化钠的线性梯度洗脱葡糖苷酶。
[0387]烟曲霉GHlO木聚糖酶的制备。使用米曲霉BECh2 (W0 2000/39322)作为宿主，根据TO 2006/078256重组制备烟曲霉GHlO木聚糖酶(xyn3) (SEQ ID NO: 19 [DNA序列]和SEQID NO:20[推导的氨基酸序列])。根据制造商的说明书使用HIPREP? 26/10脱盐柱(通用电气医疗集团，美国新泽西州皮斯卡特维)将烟曲霉NN055679GH10木聚糖酶(xyn3)的培养液过滤、脱盐并置换缓冲液为50mM乙酸钠(pH5.0)。
[0388]埃默森踝节菌GH3 β -木糖苷酶的制备。如WO 2011/057140中所描述在米曲霉中重组制备埃默森踝节菌GH3 β -木糖苷酶(SEQ ID NO: 21 [DNA序列]和SEQ ID NO: 22 [推导的氨基酸序列])。使用配备有1kDa聚醚砜膜的切向流浓缩器将埃默森踝节菌GH3 β -木糖苷酶脱盐并置换缓冲液为50mM乙酸钠(pH5.0)。
[0389]使用微板BCA?蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技(Thermo FischerScientific),美国麻萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham, MA, USA))来测定上述每种单组分的蛋白质浓度，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。将如以上所描述制备的每种单组分组合以产生由以下各项组成的一种酶组合物:25%烟曲霉Ce 16A纤维二糖水解酶I1、15%具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、10%里氏木霉GH5内切葡聚糖酶I1、5%烟曲霉GHlO木聚糖酶(Xyn3)、5%烟曲霉β -葡糖苷酶突变体、以及3%埃默森踝节菌β-木糖苷酶。该酶组合物在此被指定为“无纤维二糖水解酶I的酶组合物”。
[0390]实例8:青霉菌属种(埃默森)GH7纤维二糖水解酶I催化结构域和烟曲霉GH7纤维二糖水解酶I CBM杂合蛋白质对50°C至65°C下一种酶组合物对碾磨的未洗涤的PCS的水解的作用
[0391]在50°C、55°C、60°C、以及65°C下使用无纤维二糖水解酶I的酶组合物(实例7)评估青霉菌属种(埃默森)GH7纤维二糖水解酶I催化结构域和烟曲霉GH7纤维二糖水解酶I CBM(P244YG)杂合多肽对碾磨的未洗涤的PCS的水解的作用。
[0392]无纤维二糖水解酶I的酶组合物和野生型青霉菌属种(埃默森)GH7纤维二糖水解酶I作为对照运行。将具有杂合纤维二糖水解酶I的酶组合物或野生型青霉菌属种(埃默森)GH7纤维二糖水解酶I以1.1mg总蛋白质/g纤维素添加至PCS水解反应中，同时将无纤维二糖水解酶I的酶组合物以1.9和3.0mg总蛋白质/g纤维素添加至PCS水解反应中。
[0393]如在实例6中所描述进行测定。将具有碾磨的未洗涤的PCS(5%不溶性固形物)的Iml反应在含有ImM硫酸锰的50mM乙酸钠(pH5.0)缓冲液中进行72小时。所有反应一式三份地进行并且涉及在水解开始时的单一混合。
[0394]如图2中所示，包含杂合多肽的酶组合物胜过含有天然青霉菌属种(埃默森)纤维二糖水解酶I (P82PH)的酶组合物。在50°C、55°C、60°C、以及65°C下，杂合多肽的纤维素转化成葡萄糖的程度高于含有天然青霉菌属种(埃默森)GH7纤维二糖水解酶I的酶组合物。
[0395]通过以下编号的段落进一步说明本发明:
[0396][I] 一种具有纤维二糖水解酶活性的分离的杂合多肽，该分离的杂合多肽包含:(a)包含在该杂合多肽的N-末端处的一个纤维二糖水解酶催化结构域的一个第一多肽片段，该第一多肽片段选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455具有至少96%序列一致性的一个多肽片段；(ii)由与SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或其cDNA序列具有至少96 %序列一致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iii)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455或其具有纤维二糖水解酶活性的一个片段，或由其组成的一个多肽片段；以及(b)包含在该第一多肽片段的C-末端处的一个碳水化合物结合结构域的一个第二多肽片段，该第二多肽片段选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 4的氨基酸485至529具有至少96%序列一致性的一个多肽片段；(ii)由与SEQ ID NO:3的核苷酸1453至1587具有至少96%序列一致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iii)包含SEQ ID NO: 4的氨基酸485至529或其具有碳水化合物结合活性的一个片段，或由其组成的一个多肽片段。
[0397][2]如段落I所述的杂合多肽，其中该第一多肽片段与SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[0398][3]如段落I所述的杂合多肽，其中该第一多肽片段由与SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或其cDNA序列具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸编码。
[0399][4]如段落I所述的杂合多肽，其中该第一多肽片段包含SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455或其具有纤维二糖水解酶活性的一个片段，或由其组成。
[0400][5]如段落I所述的杂合多肽，其中该第一多肽片段由SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或其cDNA序列、或其编码其具有纤维二糖水解酶活性的一个片段的一个子序列编码。
[0401][6]如段落I所述的杂合多肽，其中该第二多肽片段与SEQ ID NO:4的氨基酸485至529具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[0402][7]如段落I所述的杂合多肽，其中该第二多肽片段由与SEQ ID NO:3的核苷酸1453至1587具有至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸编码。
[0403][8]如段落I所述的杂合多肽，其中该第二多肽片段包含SEQ ID NO: 4的氨基酸485至529或其具有碳水化合物结合活性的一个片段，或由其组成。
[0404][9]如段落I所述的杂合多肽，其中该第二多肽片段由SEQ ID NO: 3的核苷酸1453至1587、或其编码具有碳水化合物结合活性的一个片段的一个子序列编码。
[0405][10]如段落I所述的杂合多肽，包含以下各项或由其组成:作为在该杂合多肽的N-末端处的该第一多肽片段的SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455，和作为在该第一多肽片段的C-末端处的该第二多肽片段的SEQ ID NO:4的氨基酸485至529。
[0406][11]如段落I所述的杂合多肽，包含SEQ ID NO:6的成熟多肽或其具有纤维二糖水解酶活性和碳水化合物结合活性的一个片段，或由其组成。 [0407][12]如段落I至11中任一项所述的杂合多肽，进一步包含在该第一多肽片段的N-末端处的一个信号肽。
[0408][13]如段落12所述的杂合多肽，其中该信号肽是SEQ ID NO:2的信号肽。
[0409][14]如段落13所述的杂合多肽，其中该信号肽是SEQ ID NO:2的氨基酸I至21。
[0410][15] 一种分离的多核苷酸,该多核苷酸编码如段落I至14中任一项所述的杂合多肽。
[0411][16] 一种核酸构建体，包含如段落15所述的多核苷酸。
[0412][17] 一种表达载体,包含如段落15所述的多核苷酸。
[0413][18] 一种宿主细胞，包含如段落15所述的多核苷酸。
[0414][19] 一种产生具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的方法，该方法包括:(a)在适合于该杂合多肽的表达的条件下培养如段落18所述的宿主细胞；并且任选地(b)回收该杂合多妝。
[0415][20] 一种用如段落15所述的编码一种杂合多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
[0416][21] 一种产生如段落I至14中任一项所述的杂合多肽的方法，该方法包括:(a)在有益于该杂合多肽的产生的条件下培养包含编码该杂合多肽的多核苷酸的一种转基因植物或一种植物细胞；并且任选地(b)回收该杂合多肽。
[0417][22] 一种用于降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括:在如段落I至14中任一项所述的杂合多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。
[0418][23]如段落22所述的方法，其中对该纤维素材料进行了预处理。
[0419][24]如段落22或23所述的方法，进一步包括回收该降解的纤维素材料。
[0420][25]如段落22至24中任一项所述的方法，其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成:纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
[0421][26]如段落25所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成:内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶。
[0422][27]如段落25所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[0423][28]如段落22至27中任一项所述的方法，其中该降解的纤维素材料是糖。
[0424][29]如段落28所述的方法，其中该糖选自下组，该组由以下各项组成:葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、以及阿拉伯糖。
[0425][30] 一种用于产生发酵产物的方法，该方法包括:(a)在如段落I至14中任一项所述的杂合多肽的存在下，用一种酶组合物使一种纤维素材料糖化；(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(C)从该发酵中回收该发酵产物。
[0426][31]如段落30所述的方法，其中对该纤维素材料进行了预处理。
[0427][32]如段落30或31所述的方法，其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项 组成:纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
[0428][33]如段落32所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成:内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶。
[0429][34]如段落32所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[0430][35]如段落30至34中任一项所述的方法，其中步骤(a)和步骤(b)是在同时发生的糖化和发酵中同时进行。
[0431][36]如段落30至35中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。
[0432][37] 一种发酵纤维素材料的方法，该方法包括:用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在如段落I至14中任一项所述的杂合多肽的存在下，用一种酶组合物使该纤维素材料糖化。
[0433][38]如段落37所述的方法，其中在糖化之前对该纤维素材料进行了预处理。
[0434][39]如段落37或38所述的方法，其中该酶组合物包含选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成:纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、苹果菌素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
[0435][40]如段落39所述的方法，其中该纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成:内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶。
[0436][41]如段落39所述的方法，其中该半纤维素酶是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。[0437][42]如段落37至41中任一项所述的方法，其中该纤维素材料的该发酵产生一种发酵产物。
[0438][43]如段落42所述的方法，进一步包括从该发酵中回收该发酵产物。
[0439][44]如段落42或43中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。
[0440][45] 一种全液配制品或细胞培养组合物，包含如段落I至14中任一项所述的杂合多肽。
[0441]在此描述的并且要求的本发明在范围上不受在此披露的具体方面限制，因为这些方面旨在作为本发明数个方面的说明。任何等效方面都旨在处于本发明的范围之内。事实上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员来说从前述说明将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围之内。在有冲突的情况下，将以本披露(包括定义)为准。
【权利要求】
1.一种具有纤维二糖水解酶活性的分离的杂合多肽，该分离的杂合多肽包含:(a)包含在该杂合多肽的N-末端处的一个纤维二糖水解酶催化结构域的一个第一多肽片段，该第一多肽片段选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID N0:2的氨基酸19至455具有至少96%序列一致性的一个多肽片段；(ii)由与SEQ ID NO:1的核苷酸55至1485或其cDNA序列具有至少96%序列一致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iii)包含SEQID NO:2的氨基酸19至455或其具有纤维二糖水解酶活性的一个片段的、或由其组成的一个多肽片段；以及(b)包含在该第一多肽片段的C-末端处的一个碳水化合物结合结构域的一个第二多肽片段，该第二多肽片段选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 4的氨基酸485至529具有至少96%序列一致性的一个多肽片段；(ii)由与SEQ ID NO:3的核苷酸1453至1587具有至少96 %序列一致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iii)包含SEQ ID NO: 4的氨基酸485至529或其具有碳水化合物结合活性的一个片段的、或由其组成的一个多肽片段。
2.如权利要求1所述的杂合多肽，其中该第一多肽片段包含SEQID NO:2的氨基酸19至455或其具有纤维二糖水解酶活性的一个片段，或由其组成。
3.如权利要求1所述的杂合多肽，其中该第二多肽片段包含SEQID NO: 4的氨基酸485至529或其具有碳水化合物结合活性的一个片段，或由其组成。
4.如权利要求1所述的杂合多肽，包含以下各项或由其组成:作为在该杂合多肽的N-末端处的该第一多肽片段的SEQ ID NO: 2的氨基酸19至455，和作为在该第一多肽片段的C-末端处的该第二多肽片段的SEQ ID NO:4的氨基酸485至529。
5.如权利要求1所述的杂合多肽，包含SEQID NO:6的成熟多肽或其具有纤维二糖水解酶活性和碳水化合物结合 活性的一个片段，或由其组成。
6.如权利要求1至5中任一项所述的杂合多肽，进一步包含在该第一多肽片段的N-末端处的一个信号肽。
7.如权利要求6所述的杂合多肽，其中该信号肽是SEQID NO: 2的信号肽。
8.如权利要求7所述的杂合多肽，其中该信号肽是SEQID NO:2的氨基酸I至21。
9.一种分离的多核苷酸,该多核苷酸编码如权利要求1至8中任一项所述的杂合多肽。
10.一种宿主细胞,包含如权利要求9所述的多核苷酸。
11.一种产生具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽的方法，该方法包括:(a)在适合于该杂合多肽的表达的条件下培养如权利要求10所述的宿主细胞；并且任选地(b)回收该杂合多肽。
12.—种用如权利要求9所述的编码一种杂合多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
13.—种产生如权利要求1至8中任一项所述的杂合多肽的方法，该方法包括:(a)在有益于该杂合多肽的产生的条件下培养包含编码该杂合多肽的多核苷酸的一种转基因植物或一种植物细胞；并且任选地(b)回收该杂合多肽。
14.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括:在如权利要求1至8中任一项所述的杂合多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。
15.如权利要求14的方法，进一步包括回收该降解的纤维素材料。
16.—种用于产生发酵产物的方法,该方法包括:(a)在如权利要求1至8中任一项所述的杂合多肽的存在下，用一种酶组合物使一种纤维素材料糖化；(b)用一种或多种发酵微生物发酵该糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且(C)从该发酵中回收该发酵产物。
17.—种发酵纤维素材料的方法,该方法包括:用一种或多种发酵微生物发酵该纤维素材料，其中在如权利要求1至8中任一项所述的杂合多肽的存在下，用一种酶组合物使该纤维素材料糖化。
18.如权利要求17所述的方法,其中该纤维素材料的该发酵产生一种发酵产物。
19.如权利要求18所述的方法，进一步包括从该发酵中回收该发酵产物。
20.一种全液配制品或细胞培养组合物，包含如权利要求1至8中任一项所述的杂合多肽。
【文档编号】C12N5/14GK104039834SQ201280063944
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2011年12月22日
【发明者】刘晔, T.沙加西 申请人:诺维信股份有限公司