用于癌症患者中诊断学用途的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于癌症患者中诊断学用途的方法和组合物的制作方法
用于癌症患者中诊断学用途的方法和组合物本发明涉及可用于预测临床后果及监测用抗血管生成疗法治疗的癌症患者的方法和组合物。癌症是人健康的最致命威胁之一。仅在美国，癌症每年影响着几乎130万新患者， 并且是在心血管疾病之后的第二位主要的死亡原因，占4例死亡中的约I例。实体瘤造成那些死亡中的大多数。虽然在某些癌症的医学治疗中已经有显著进展，但是在过去20年中所有癌症的总体5年存活率仅改善了约10%。癌症或恶性肿瘤转移并以不受控制的方式快速生长，使及时的检测和治疗变得极端困难。根据癌症类型，患者通常具有可用于他们的几种治疗选项，包括化学疗法、放射和基于抗体的药物。可用于预测来自不同治疗方案的临床后果的诊断方法会使这些患者的临床管理极大地受益。几项研究已经探索了基因表达与鉴定特定癌症类型的关联，例如通过突变特异性阵列、微阵列分析、qPCR、等等来进行。此类方法可用于鉴定并分类由患者呈现的癌症。然而，关于基因表达与临床后果的预测或预后价值知道很少。如此，需要用于预测治疗后果，并且由此为每名患者选择最佳治疗方案的客观的、 可再现的方法。可以在多种背景中利用本发明的方法，包括例如在药物开发过程期间帮助患者选择中，在为患者选择最佳的治疗过程中，在用特定的治疗方案治疗个别患者时预测成功概率，在评估疾病进展中，在监测治疗功效中，在测定个别患者的预后中及在评估个体受益于特定疗法，例如抗癌疗法和/或抗血管生成疗法的素因中。本发明部分基于如下的发现，即患有癌症的患者中的bFGF表达水平与来自抗血管生成疗法的临床益处升高相关联。因而，本发明的一方面提供了鉴定可以受益于抗血管生成疗法的癌症患者的方法，包括测定自所述患者获得的样品中的bFGF表达水平，其中与参照样品相比自所述患者获得的样品中更高的bFGF表达水平指示所述患者可以受益于抗血管生成疗法。本发明的另一方面提供了预测癌症患者对抗血管生成疗法的响应性的方法，包括测定自所述患者获得的样品中的bFGF表达水平，其中与参照样品相比所述样品中更高的 bFGF表达水平指示所述患者有可能响应抗血管生成疗法。在某些实施方案中，所述抗血管生成疗法包括施用VEGF拮抗剂或其片段。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。在某些实施方案中，抗VEGF抗体是单克隆抗体。 在某些实施方案中，抗VEGF抗体是贝伐单抗(bevacizumab)。在某些实施方案中，抗血管生成疗法包括施用5mg/kg、7. 5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg贝伐单抗。在某些实施方案中，抗血管生成疗法进一步包括对所述患者施用至少一种化疗剂。在某些实施方案中，至少一种化疗剂是顺钼或吉西他滨。在某些实施方案中，抗血管生成疗法进一步包括对所述患者施用至少两种化疗剂。在某些实施方案中，至少两种化疗剂是顺钼和吉西他滨。在一个实施方案中，与参照样品相比自所述患者获得的样品中更高的bFGF表达水平指示所述患者可以受益于包括施用7. 5mg/kg贝伐单抗的抗血管生成疗法。在另一个实施方案中，与参照样品相比所述样品中更高的bFGF表达水平指示所述患者有可能响应包括施用7. 5mg/kg贝伐单抗的抗血管生成疗法。在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括对患者施用有效量的抗VEGF抗体。 在某些实施方案中，抗VEGF抗体是贝伐单抗。在某些实施方案中，对患者施用的有效量的贝伐单抗是7. 5mg/kg贝伐单抗。在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括对患者施用有效量的至少一种化疗剂。在某些实施方案中，至少一种化疗剂是顺钼或吉西他滨。在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括对患者施用有效量的至少两种化疗剂。在某些实施方案中，至少两种化疗剂是顺钼和吉西他滨。另一方面，本发明提供了用抗VEGF抗体治疗患者的方法，包括(I)测定自所述患者获得的样品中的bFGF表达水平，并且(2)若与参照样品相比所述样品中存在着更高的 bFGF表达水平，则对所述患者施用有效量的抗VEGF抗体。在某些实施方案中，测量的bFGF表达水平是蛋白质表达水平。在某些实施方案中，使用免疫学测定法来测量蛋白质表达水平。在某些实施方案中，免疫学测定法是ELISA。 在某些实施方案中，测量的bFGF表达水平是mRNA表达水平。在某些实施方案中，所述样品中的bFGF蛋白质表达水平大于约2pg/ml。在某些实施方案中，所述样品中的bFGF蛋白质表达水平大于约4pg/ml。在某些实施方案中，所述样品中的bFGF蛋白质表达水平大于约6pg/ml。在某些实施方案中，所述样品中的bFGF蛋白质表达水平大于约6. 9pg/ml。在某些实施方案中，所述参照样品中的bFGF蛋白质表达水平等于或小于约2pg/ml。在某些实施方案中，所述参照样品中的bFGF蛋白质表达水平等于或小于约4pg/ml。在某些实施方案中，所述参照样品中的bFGF蛋白质表达水平等于或小于约 6pg/mlo在某些实施方案中，所述参照样品中的bFGF蛋白质表达水平等于或小于约6. 9pg/ ml o本发明进一步提供了治疗癌症患者的方法，包括测定自所述患者获得的样品中的 bFGF蛋白质表达水平，并且若bFGF蛋白质表达水平大于约2pg/ml，则对患者施用有效量的抗VEGF抗体。在某些实施方案中，样品中的bFGF蛋白质表达水平大于约4pg/ml。在某些实施方案中，样品中的bFGF蛋白质表达水平大于约6pg/ml。在某些实施方案中，样品中的 bFGF蛋白质表达水平大于约6. 9pg/mlo在某些实施方案中，对患者施用的抗VEGF抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，对患者施用的抗VEGF抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，抗VEGF抗体是贝伐单抗或其片段。在某些实施方案中，对患者施用5mg/kg、7. 5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg贝伐单抗。在某些实施方案中，对患者施用的有效量的贝伐单抗是7. 5mg/kg贝伐单抗。在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括对患者施用有效量的至少一种化疗剂。在某些实施方案中，化疗剂是顺钼(cisplatin)。在某些实施方案中，化疗剂是吉西他滨(gemcitabine)。在某些实施方案中，化疗剂是卡钼(carboplatin)。在某些实施方案中， 化疗剂是帕利他塞(paclitaxel)。在某些实施方案中,化疗剂是培美曲塞(pemetrexed)。 在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括对患者施用有效量的顺钼和吉西他滨。在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括对患者施用有效量的卡钼和帕利他塞。在某些实施方案中，所述癌症是肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌或成胶质细胞瘤。在某些实施方案中，所述癌症是肺癌。在某些实施方案中，所述癌症是先前未治疗的肺癌。在某些实施方案中，所述肺癌是非小细胞肺癌。在某些实施方案中，所述肺癌是先前未治疗的非小细胞肺癌。在某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在某些实施方案中，自所述患者获得的样品是选自下组的成员组织、血液、血液衍生的细胞、血浆、血清及其组合。在某些实施方案中，样品是血液样品。在某些实施方案中，样品是血浆样品。在某些实施方案中，在抗血管生成疗法前或开始时获得来自患者的样品。在某些实施方案中，测量的bFGF表达水平是血液中的bFGF蛋白水平。在某些实施方案中，bFGF蛋白是bFGF蛋白的成熟形式。另一方面，本发明提供了用于检测自癌症患者获得的样品中的bFGF表达水平的化合物组。该组包含一种或多种能够检测bFGF表达水平的化合物，其中与参照样品相比自癌症患者获得的样品中更高的bFGF表达水平(使用一种或多种化合物的组测定)指示患者可以受益于抗血管生成疗法。在某些实施方案中，化合物是蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质是抗体。在某些实施方案中，至少一种抗体能够结合bFGF。另一方面，本发明提供了用于测定患者是否可以受益于用抗血管生成疗法治疗的试剂盒。该试剂盒包含含有能够与bFGF特异性杂交的多核苷酸的阵列，其中该试剂盒进一步包含关于使用所述阵列来预测癌症患者对抗血管生成疗法的响应性的用法说明书，其中与参照样品相比更高的bFGF表达水平指示患者可以受益于抗血管生成疗法。本文中所描述的任何实施方案或其任何组合适用于本文中所描述的发明的任何和所有方法。提供了以下附图
图I显示了 AVAiL试验设计。图2是按治疗组显示具有高bFGF蛋白质表达水平的肺癌患者中无进展存活的可能性的Kaplan Meier曲线。图3是按治疗组显示具有低bFGF蛋白质表达水平的肺癌患者中无进展存活的可能性的Kaplan Meier曲线。图4是按治疗组显示具有高bFGF蛋白质表达水平的肺癌患者中总体存活的可能性的Kaplan Meier曲线。图5是按治疗组显示具有低bFGF蛋白质表达水平的肺癌患者中总体存活的可能性的Kaplan Meier曲线。本文中所描述或提及的技术和规程一般是本领域技术人员充分了解并使用常规方法通常采用的，诸如例如记载于下列文献的广泛使用的方法Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第 3 版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. CURRENT PROTO⑶LS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M. Ausubel 等编，(2003));丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY(Academic Press, Inc.):PCR 2:APRACTICAL APPROACH(M. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 编(1995)), Harlow 和 Lane 编(1988)ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL,及 ANIMAL CELL CULTURE(R. I. Freshney 编(1987));Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait 编,1984);Methods in Molecular Biology, Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J. E. Cellis 编，1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R. I. Freshney)编，1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather 和 P. E. Roberts, 1998)Plenum Press;Celland Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle, J. B. Griffiths 和 D. G. Newell 编，1993-8)J. Wiley 和 Sons;Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir 和 C. C. Blackwell 编);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller 和 M. P. Calos 编，1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等编，1994);Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan 等编，1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley 和 Sons, 1999);Immunobiology(C. A. Janeway 和 P.Travers, 1997);Antibodies(P. Finch, 1997);Antibodies:A Practical Approach(D. Catty.编，IRL Press,1988-1989);Monoclonal Antibodies:APractical Approach(P. Shepherd 和 C.Dean 编，Oxford University Press, 2000) ;Using Antibodies: A Laboratory Manual (E.Harlow 和 D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ;The Antibodies(M. Zanetti 和 J.D. Capra 编，Harwood Academic Publishers,1995); R Cancer!Principles and Practice of Oncology(V. T. DeVita 等编，J. B. Lippincott Company, 1993)。除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域中的普通技术人员的通常理解具有相同意义。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第 2 版，J. Wiley & Sons (New York, N. Y. 1994),及 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure第 4版，John ffiley&Sons(New York, N. Y. 1992)为本领域技术人员提供本申请中使用的许多术语的一般指导。通过提及而完整收录本文中所引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物。为了解读本说明书，以下定义会适用，并且只要合适，以单数使用的术语也会包括复数，且反之亦然。在下文所列出的任何定义与通过提及而收入本文中的任何文献矛盾的情况中，应当以下文所列出的定义为准。如本文中所使用的，术语“样品”或“测试样品”指自感兴趣的受试者获得或衍生的组合物，其含有要例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。在一个实施方案中，该定义涵盖生物起源的血液和其它液体样品和组织样品诸如活组织检查标本或组织培养物或自其衍生的细胞。组织样品的来源可以是固体组织，如来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或吸出物；血液或任何血液成分；体液；和来自受试者妊娠或发育中的任何时间的细胞或血浆。在另一个实施方案中，该定义包括在其获得后已经以任何方式操作，诸如通过用试剂处理、增溶、或富集某种组分，诸如蛋白质或多核苷酸，或者为了形成切片包埋于半固体或固体基质中的生物学样品。出于本文中的目的，组织样品的“切片”意指组织样品的单一部分或份，例如自组织样品切割的细胞或组织薄片。样品包括但不限于原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞溶胞物、血小板、血清、血浆、玻璃状液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳、全血、尿液、脑脊液、唾液、 痰、泪液、汗液、粘液、肿瘤溶胞物、和组织培养液及组织提取物诸如均质化组织、肿瘤组织、 和细胞提取物。在一个实施方案中，样品是临床样品。在另一个实施方案中，在诊断测定法中使用样品。在某些实施方案中，样品是血液样品。在某些实施方案中，样品是外周血样品。在某些实施方案中，样品是血清样品。
在某些实施方案中，自原发性或转移性肿瘤获得样品。经常使用组织活组织检查来获得肿瘤组织的代表性部分。或者，肿瘤细胞可以以已知或认为含有感兴趣的肿瘤细胞的组织或流体形式间接获得。例如，可以通过切除、支气管镜检查、细针抽吸、支气管刷检、 或自痰、胸膜液或血液获得肺癌损伤的样品。在一个实施方案中，在抗血管生成疗法前自受试者或患者获得测试样品。在另一个实施方案中，在VEGF拮抗剂疗法前自受试者或患者获得测试样品。在又一个实施方案中，在抗VEGF抗体疗法前自受试者或患者获得测试样品。在又一个实施方案中，在施用抗 VEGF抗体贝伐单抗前自受试者或患者获得测试样品。在某些实施方案中，在抗血管生成、 VEGF拮抗剂或抗VEGF抗体疗法期间或之后获得测试样品。在某些实施方案中，在癌症已经转移后获得测试样品。如本文中所使用的，“参照样品”指出于比较目的使用的任何样品、标准品、或水平。参照样品包括所有类型的生物学样品，如上文在术语“样品”下所定义的。在某些实施方案中，参照样品是血液样品。在某些实施方案中，参照样品是外周血样品。在某些实施方案中，参照样品是血清样品。在某些实施方案中，参照样品是血浆样品。参照样品可以是选定的样品或合并的样品。在一个实施方案中，自相同受试者或患者的身体的健康和/或未患病部分获得参照样品。在另一个实施方案中，自相同受试者或患者的身体的未处理组织和/或细胞获得参照样品。在某些实施方案中，自一名或多名不是受试者或患者的患有癌症的个体获得参照样品。在一个实施方案中，自不是受试者或患者的个体的身体的健康和/或未患病部分获得参照样品。在另一个实施方案中，自不是受试者或患者的个体的身体的未处理组织和/ 或细胞部分获得参照样品。在某些实施方案中，参照样品代表来自一名或多名不是受试者或患者的健康个体的组合的多份样品。在某些实施方案中，参照样品代表来自一名或多名不是受试者或患者的患有癌症的个体的组合的多份样品。在某些实施方案中，参照样品是来自一名或多名不是受试者或患者的个体的合并的蛋白质和/或RNA样品。在某些实施方案中，参照样品是与获得测试样品时不同的一个或多个时间点时获得的来自相同受试者或患者的单一样品或组合的多份样品。例如，在比获得测试样品时更早的时间点时自相同受试者或患者获得参照样品。若在癌症的初始诊断期间获得参照样品，并且后来在癌症变为转移时获得测试样品，则此类参照样品可以是有用的。在某些实施方案中，在比获得测试样品时晚的时间点时自相同受试者或患者获得参照样品。“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于牲畜动物(诸如牛)、运动动物、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类、 小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物是人。“检测”包括任何检测手段，包括直接和间接检测。词语“标记物”在本文中使用时指与试剂诸如核酸探针或抗体直接或间接缀合或融合，而且便于与其缀合或融合的试剂检出的化合物或组合物。标记物自身可以是可检出的(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)或在酶标记物的情况中，可以催化可检出的底物化合物和组合物的化学变化。
如本文中所使用的，“靶序列”、“靶核酸”或“靶蛋白质”是期望其检出的感兴趣的多核苷酸或蛋白质。一般地，如本文中所使用的，“模板”是含有靶核苷酸序列的多核苷酸。 在一些情况中，术语“靶核酸”、“模板DNA”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”及其变型可互换使用。如本文中所使用的，术语“生物标志” 一般指其在哺乳动物组织或细胞之中或之上的表达可以通过标准方法(或本文中所公开的方法)来检测，并且是受试者对基于抑制血管发生的治疗方案，例如抗血管生成剂诸如VEGF特异性抑制剂的敏感性的预测、诊断和/ 或预后的分子，包括基因、蛋白质、碳水化合物结构、或脂质。在某些实施方案中，此类生物标志的表达测定为高于对参照样品观察到的。在某些实施方案中，生物标志是bFGF。可以例如使用高通量多重免疫测定法，诸如那些自Rules Based Medicine, Inc.或Meso Scale Discovery商业上可得的测定法来测定生物标志的表达。也可以使用例如PCR或FACS测定法、免疫组织化学测定法或基于基因芯片的测定法来测定生物标志的表达。别的用于测量生物标志表达的方法在本文中在本发明的方法下描述。“关联”意指以任何方式比较第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析或方案的性能和/或结果。例如，可以在实施第二方案中使用第一分析或方案的结果和/或可以使用第一分析或方案的结果来确定第二分析或方案是否应当实施。就基因表达分析或方案的实施方案而言，可以使用基因表达分析或方案的结果来确定特定的治疗方案是否应当实施。可以基于本领域中已知的任何合适的标准，包括但不限于mRNA、cDNA、蛋白质、蛋白质片段和/或基因拷贝来测定基因、基因产物例如生物标志的表达水平/量。可以定性和/或定量测定表达水平/量。在某些实施方案中，为了测定的RNA或蛋白质量的差异和所使用的RNA或蛋白质样品的质量可变性两者标准化样品。可以通过测量并合并某些标准化基因，包括公知的持家基因，诸如GAPDH的表达来实现此类标准化。或者，标准化可以基于所有测定基因或其大的亚组的均值或中值信号(全局标准化方法)。以挨个基因为基础， 比较测量的患者肿瘤mRNA或蛋白质的标准化量与参照组中找到的量。每名患者的每个测试肿瘤的每种mRNA或蛋白质的标准化表达水平可以表述为参照组中测量的表达水平的百分比。要分析的特定患者样品中测量的表达水平会以某个百分位数落入此范围内，其可以通过本领域中公知的方法来测定。如本文中所使用的，术语“阵列”或“微阵列”指可杂交阵列元件，优选地多核苷酸探针(例如，寡核苷酸)在基片上的有序排布。基片可以是固体基片，诸如玻璃载玻片，或半固体基片，诸如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA、或其任何排列。如本文中所使用的，“扩增”一般指生成多拷贝的期望序列的过程。“多拷贝”意指至少2个拷贝。“拷贝”不必然意指与模板序列的完全序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包含核苷酸类似物诸如脱氧肌苷、有意的序列变化(诸如经由包含与模板可杂交，但是不互补的序列的引物引入的序列变化)和/或扩增期间发生的序列错误。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA 和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。若存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记用组分偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、 毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、 含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸 (phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体支持物。可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代5’ 和3’末端0H。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸也可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2’ -氧-甲基、2’ -氧-烯丙基、2’ -氟-或 2’ -叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S (“硫代酸酯” (thioate))、P(S)S (“二硫代酸酯”(dithioate))、
(O)NR2 (“酰胺酯” (amidate))、P(0)R、P(0)0R，、C0 或 CH2 (“ 甲缩醛”(formacetal))替代， 其中R或R’各自独立为H或者取代或未取代的烃基(1-20个C)，任选含有醚(-0-)连接、 芳基、烯基、环烃基、环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。如本文中所使用的，“寡核苷酸”一般指短的、一般为单链的、一般为合成的多核苷酸，其一般地，但是不必在长度上小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述同样且完全可适用于寡核苷酸。“引物” 一般指通过与靶序列杂交结合感兴趣的样品中潜在存在的靶物，此后促进与靶物互补的多核苷酸聚合的短的单链多核苷酸，一般具有游离的3’ -OH基团。“天然序列”多肽包含与自自然界衍生的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。如此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。此类天然序列多肽可以自自然界分离或者可以通过重组或合成手段来生成。术语“天然序列”多肽明确涵盖多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，胞外域序列)、多肽的天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。“分离的”多肽或“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的。其天然环境的污染性成分指将会干扰该多肽的诊断或治疗用途的材料，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将多肽纯化至(I)根据Lowry法的测定，以多肽重量计超过95%，或以重量计超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，使用考马斯蓝或银染色，达到同质。既然多肽天然环境的至少一种成分将不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“多肽链”指如下的多肽，其中与非共价相互作用或二硫键相反，通过肽键连接其每个域与其它域。多肽“变体”意指与相应的天然序列多肽具有至少约80%氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如如下的多肽，其中在该多肽的N和/或C端添加或删除一个或多个氨基酸(天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸)残基。通常，变体与天然序列多肽会具有至少约80%氨基酸序列同一性，或至少约90%氨基酸序列同一性，或至少约95%或更多的氨基酸序列同一性。变体还包括天然序列的多肽片段(例如，亚序列、截短等)，通常具有生物学活性。如本文中所使用的，术语“蛋白质变体”指如上文所描述的变体和/或在天然蛋白质序列中包含一处或多处氨基酸突变的蛋白质。任选地，一处或多处氨基酸突变包括氨基酸替代。可以通过本领域中公知的多种方法来制备本发明中使用的蛋白质及其变体。可以通过蛋白质DNA中的突变来制备蛋白质的氨基酸序列变体。此类变体包括例如蛋白质氨基酸序列内的残基删除、插入或替代。可以进行任何删除、插入和替代组合以获得具有期望活性的最终构建物。会对编码变体的DNA进行的突变不得将序列在阅读框外放置，并且优选地，不会创建可以生成二级mRNA结构的互补区。见例如EP 75，444A。术语“抗体”以最广义使用，并且明确覆盖单克隆抗体(包括全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、自至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段(见下文)，只要它们展现出期望的生物学活性。除非另有指示，表述“多价抗体”遍及本说明书用于意指包含三个或更多个抗原结合位点的抗体。多价抗体通常工程化改造成具有三个或更多个抗原结合位点，并且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，一般地其包含完整抗体的抗原结合位点， 并且如此保留结合抗原的能力。由本定义涵盖的抗体片段的例子包括(i)Fab片段，其具有\、Q、Vh和ChI域；(ii)Fab’片段，其是在ChI域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的 Fab片段；(iii)Fd片段，其具有Vh和ChI域；(iv)Fd’片段，其具有Vh和ChI域及在ChI域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；(V) Fv片段,其具有抗体单臂的\和Vh域；(vi) dAb片段(Ward 等,Nature 341, 544-546 (1989))，其由 VH 域组成；(vii)分离的 CDR 区；(viii) F(ab’)2片段，即一种包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab’片段的二价片段；(ix) 单链抗体分子(例如单链 Fv ;scFv) (Bird 等，Science 242:423-426(1988);及 Huston 等，PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)) ； (x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，其包含在同一多肽链中连接的重链可变域(Vh)和轻链可变域(Vl)(见例如EP 404, 097; WO 93/11161; 及 Hollinger 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ) ； (xi) “线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(Vh-ChI-Vh-ChI)，它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区 (Zapata 等，Protein Eng. 8 (10) : 10571062 (1995);及美国专利 No. 5，641，870)。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体， 即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变(例如天然存在的突变) 外。如此，修饰语“单克隆”指明抗体不是不同的抗体的混合物的特征。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。在某些实施方案中，单克隆抗体通常包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中所述靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多
11肽序列在内的过程获得的。例如，所述选择过程可以是从众多克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、或重组DNA克隆的集合)选择独特克隆。应当理解的是，可以进一步改变选定的靶物结合序列，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优点在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler和Milstein, Nature, 256:495-97(1975)
;Hongo 等,Hybridoma, 14(3):253-260(1995), Harlow 等,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版，1988;Hammerling 等, 于:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681, Elsevier, N. Y. , 1981)> 重组DNA法(参见例如美国专利No. 4，816，567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson 等，Nature 352:624-628(1991);Marks 等，J. Mol. Biol. 222:581-597(1991);Sidhu 等，J. Mol. Biol. 338(2) :299-310(2004) ;Lee 等,J. Mol. Biol. 340(5) :1073-1093(2004) ;Fellou se,Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34):12467-12472(2004);及 Lee 等,J. Tmmunol. Methods 284(1-2) :119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893; WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO 1991/10741;Jakobovits 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993);Jakobovits 等，Nature362:255-258(1993);Bruggemann 等，Year in Immuno. 7:33 (1993);美国专利 No. 5，545，807; 5，545，806; 5，569，825; 5，625，126; 5，633，4 25;及 5，661，016;Marks 等,Bio. /Technology 10:779-783(1992);Lonberg 等,Nature 3 68:856-859(1994);Morrison, Nature 368:812-813(1994);Fishwild 等,Nature Biotec hnol.14:845-851(1996);Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826(1996);及 Lonberg 和 Huszar, Intern. Rev. Tmmunol · 13:65-93(1995))。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No. 4，816，567及Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855 (1984))。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力、和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区 (FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体会包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节见 Jones 等，Nature 321:522-525 (1986);Riechmann 等，Nature 332:323-329(1988);及 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。还可见例如 Vaswani 和 Hamilton, Ann. Allergy,Asthma&Immunol. 1:105-115 (1998) ;Harris,Biochem.Soc. Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle 和 Gross, Curr. 0ρ· Biotech. 5:428-433 (1994);及美国专利 No. 6, 982, 321 和 7,087,409。还见 van Dijk 和 van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. , 5:368-74(2001)。可以通过对转基因动物施用抗原来制备人抗体,所述转基因动物已经修饰为响应抗原性考验而生成此类抗体，但是其内源基因座已经丧失能力，例如经免疫的异源小鼠(xenomice)(关于XEN0M0USE 技术，见例如美国专利No. 6，075, 181 和6，150，584)。关于经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体，还见例如Li等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562(2006)。“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用如本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体。在一个实施方案中，自噬菌体文库选择人抗体，其中所述噬菌体文库表达人抗体(Vaughan 等,Nature Biotechnologyl4:309-314(1996):Sheets 等,PNAS(USA)95:6 157-6162(1998));Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol. , 227:381 (1991);Marks 等,J. Mol. Biol. ,222:581 (1991))。也可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如已经将内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠中来生成人抗体。考验后，观察到人抗体生成，其在所有方面，包括基因重排、装配、和抗体全集与人中看到的极其相似。此方法记载于例如美国专利 No. 5，545，807; 5，545，806; 5，569，825; 5，625，126; 5, 6 33，425; 5, 661，016，及下列科学出版物Marks 等,Bio/TechnologylO: 779-783 (1992)
;Lonberg 等，Nature 368:856-859 (1994);Morrison, Nature368:812-13(1994) ;Fishw ild 等,Nature Biotechnology 14:845-51 (1996);Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996) ; Lonberg 和 Huszar, Intern. Rev. Tmmunol. 13:65-93 (1995)。或者，可以经由永生化生成针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞(此类B淋巴细胞可以自个体回收或者可以已经在体外免疫)来制备人抗体。见例如Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,第 77 页(1985) ; Boerner 等，J. Tmmunol. , 147 (I) : 86-95 (1991);及美国专利 No. 5，750，373。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。 它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-片层构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β_片层结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(见 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的毒性中抗体的参与。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残 基。例如，术语高变区抗体指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的 区域。通常，抗体包含六个HVR :三个在VH中(HI、H2、H3)，三个在VL中(LI、L2、L3)。在 天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多祥性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精 密特异性中发挥独特作用。见例如Xu等，Immunity 13:37-45 (2000) ; Johnson和Wu,于 Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo 编，Human Press, Totowa, NJ, 2003)。事 实上，仅由重链组成的天然存在骆驼(camelid)抗体在缺乏轻链的情况中是有功能的且 稳定的。见例如 Hamers-Casterman 等，Nature 363:446-448 (1993) ; Sheriff 等，Nature Struct. Biol. 3:733-736(1996)。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序 列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,果 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改为指结构环的位置(Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。AbM HVR 代表 Kabat HVR 与 Chothia 结构环之间的折衷，而且 得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物 晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每ー个的残基。
权利要求
1.一种鉴定可以受益于抗血管生成疗法的癌症患者的方法，包括测定自所述患者获得的样品中的bFGF表达水平，其中与参照样品相比自所述患者获得的样品中更高的bFGF表达水平指示所述患者可以受益于抗血管生成疗法。
2.一种预测癌症患者对抗血管生成疗法的响应性的方法，包括测定自所述患者获得的样品中的bFGF表达水平，其中与参照样品相比所述样品中更高的bFGF表达水平指示所述患者有可能响应抗血管生成疗法。
3.权利要求I或权利要求2的方法，其中所述抗血管生成疗法包括对所述患者施用 VEGF拮抗剂。
4.权利要求3的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
5.权利要求4的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
6.权利要求3至5中任一项的方法，其中所述抗血管生成疗法进一步包括对所述患者施用至少一种化疗剂。
7.权利要求6的方法，其中所述化疗剂是顺钼或吉西他滨。
8.权利要求3至5中任一项的方法，其中所述抗血管生成疗法进一步包括对所述患者施用至少两种化疗剂。
9.权利要求8的方法，其中至少两种化疗剂是顺钼和吉西他滨。
10.权利要求I至9中任一项的方法，其中所述抗血管生成疗法包括对所述患者施用7.5mg/kg贝伐单抗。
11.权利要求I的方法，其进一步包括对所述患者施用有效量的抗VEGF抗体。
12.权利要求11的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
13.权利要求12的方法,其中对所述患者施用7.5mg/kg贝伐单抗。
14.抗VEGF抗体用于改善患有癌症的患者的治疗效果的用途，包括下列步骤(I)测定自所述患者获得的样品中的bFGF表达水平，并且(2)若与参照样品相比所述样品中存在着更高的bFGF表达水平，则对所述患者施用有效量的抗VEGF抗体。
15.权利要求14的用途，其进一步包括对所述患者施用有效量的至少一种化疗剂。
16.权利要求15的用途，其中至少一种化疗剂是顺钼或吉西他滨。
17.权利要求14的用途，其进一步包括对所述患者施用有效量的至少两种化疗剂。
18.权利要求17的用途，其中至少两种化疗剂是顺钼和吉西他滨。
19.权利要求I至13中任一项的方法或权利要求14至18中任一项的用途，其中所述 bFGF表达水平是蛋白质表达水平。
20.权利要求I至13中任一项的方法或权利要求14至18中任一项的用途，其中所述样品中的bFGF蛋白质表达水平大于2pg/ml。
21.权利要求I至13中任一项的方法或权利要求14至18中任一项的用途，其中所述样品中的bFGF蛋白质表达水平大于6. 9pg/mlo
22.权利要求I至13中任一项的方法或权利要求14至18中任一项的用途，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌或成胶质细胞瘤。
23.权利要求22的方法，其中所述癌症是肺癌。
24.权利要求23的方法，其中癌症是先前未治疗的肺癌。
25.权利要求23的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
26.权利要求I至13中任一项的方法或权利要求14至18中任一项的用途，其中所述自患者获得的样品是选自下组的成员组织、血液、血液衍生的细胞、血浆、血清及其组合。
27.一种可用于实施权利要求I至13中任一项的方法的试剂盒，其包含一种或多种能够检测bFGF表达水平的化合物或寡核苷酸或多核苷酸阵列。
28.蛋白质或寡核苷酸或多核苷酸阵列在权利要求I至13中任一项的方法中测定 bFGF表达水平的用途。
29.权利要求28的试剂盒或权利要求29的用途，其中所述能够测定bFGF表达水平的化合物是适合于在免疫组织化学方法中使用的多肽和/或是对bFGF特异性的抗体。
30.如本文所描述的发明。
全文摘要
本文中公开了可用于鉴定有可能对癌症患者赋予最佳临床益处的疗法的方法和组合物。
文档编号C12Q1/68GK102612566SQ201080051653
公开日2012年7月25日 申请日期2010年9月16日 优先权日2009年9月17日
发明者P.德尔马, S.L.德哈斯, S.谢勒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司