CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用及试剂盒的制作方法

文档序号:11228848
CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用及试剂盒的制造方法与工艺

本发明涉及医学检测技术领域,特别是涉及CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用及试剂盒。



背景技术:

肿瘤的早期诊断和治疗能显著提高肿瘤患者的存活率。英国癌症研究中心一项最新研究发现,如果能在早期得到诊断,癌症患者的生存几率会增加三倍。新研究中,英国癌症研究中心研究人员对英国乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肠癌、子宫癌、皮肤癌、卵巢癌和睾丸癌患者生存率情况展开了调查。这些癌症占英国所有癌症病例的40%以上。结果发现,大约一半的患者在癌症1期(癌症仅限于一个器官)和2期(癌症扩散至少临近小部分组织)确诊。另一半患者确诊时为3期(癌症已经扩散至腋窝淋巴结或胃部)和4期(癌症已扩到骨头、肝脏、大脑、肺脏或其他器官)。最终分析结果显示,在这8种常见癌症中,如果能在癌症1期(早期)确诊,10年生存率能达到90%。相比之下,癌症晚期(癌细胞扩散到骨骼、大脑、肺脏或其他重要器官)才确诊的患者,10年生存几率仅为25%,即患者生存期仅为5年。另外,以上消化道癌为例,通过胃镜加病理活检分析以后,如果确诊为早期,五年存活率可以高达80%-90%;但是如果它被发现时已经是晚期,五年存活率勉强能达到10%-20%。因此,开发癌症早期诊断高灵敏度新型标记物能够显著改善患者的预后。

目前临床上常用的肿瘤诊断标志物包括甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和糖类抗原(CA199、CA125和CA153),仅能检测到大约15-50%的任何阶段的肿瘤,对于疾病早期的检测则降至大约2-11%。而事实上,患者可能患有严重的需要立即注意的癌症。因此,迫切需要开发出一种具有高灵敏度的癌症诊断方法。

外泌体(exosome,以下简写为EXO)是各种活细胞分泌的纳米级别的小囊泡,含有丰富的蛋白质、核酸和脂类成分,可广泛存在于人体的血液、唾液、母乳及尿液中(Soung YH,Ford S,Zhang V and Chung J.Exosomes in Cancer Diagnostics.Cancers.2017;9(1).)。有研究报道,外泌体中的EDIL3有希望成为早期乳腺癌的诊断标志物。细胞表面的蛋白聚糖Glypican-1存在于胰腺癌病人血清来源的外泌体,对早期胰腺癌的诊断具有绝对的特异性及灵敏度(Melo SA,Luecke LB,Kahlert C,Fernandez AF,Gammon ST,Kaye J,LeBleu VS,Mittendorf EA,Weitz J,Rahbari N,Reissfelder C,Pilarsky C,Fraga MF,Piwnica-Worms D and Kalluri R.Glypican-1identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.Nature.2015;523(7559):177-182.)。微小RNA let-7b和miR-18a在多发性骨髓瘤病人血清来源的外泌体中明显升高,可作为多发性骨髓瘤的诊断及预后的评价指标(Manier S,Liu CJ,Avet-Loiseau H,Park J,Shi J,Campigotto F,Salem KZ,Huynh D,Glavey SV,Rivotto B,Sacco A,Roccaro AM,Bouyssou J,Minvielle S,Moreau P,Facon T,et al.Prognostic role of circulating exosomal miRNAs in multiple myeloma.Blood.2017.)。可见,血清来源的外泌体在肿瘤的早期诊断中具有很好的前景。此外,血清来源的外泌体具有无创,易获取,检测方便,性价比高等特征,在未来肿瘤的早期诊断试剂的开发中,必将成为人们关注的热点。

血清中的外泌体可来源于机体的各种细胞,包括各器官的上皮细胞、基质细胞和淋巴细胞等。虽然在肿瘤病人血清中,肿瘤来源的外泌体的比重会明显上升,但其它细胞尤其是淋巴细胞来源的外泌体在肿瘤病人血清中是否会上升尚不清楚。



技术实现要素:

本发明首次发现了人血清中CD19阳性的外泌体含量在肿瘤病人中显著升高,且在肿瘤不同分期时含量没有显著变化,所以该指标能够作为肿瘤诊断的标志物,特别是对于诊断难度较大的早期肿瘤具有良好的诊断效果。

本发明搜集了健康人以及肿瘤病人血清(胃癌、肠癌、肺癌和乳腺癌),并通过ELISA法对其中CD19+-EXO含量进行检测。对比健康人与肿瘤病人血清中CD19+-EXO的含量,获得最佳的cut-off值,评价血清中CD19+-EXO的含量对肿瘤诊断的灵敏度与特异性;对比不同分期肿瘤病人血清中CD19+-EXO的含量是否具有差异性,评价该指标是否具有肿瘤早期诊断的价值;与目前临床上常用的肿瘤诊断标志物CEA进行对比,评价血清中CD19+-EXO的含量对肿瘤的诊断是否具有高的灵敏度与特异性。

发现了肿瘤病人血清中CD19+-EXO的含量要明显高于健康人。而且,不同分期肿瘤病人血清中CD19+-EXO的含量没有显著性差异,提示其在肿瘤早期诊断中的价值。与CEA相比,通过检测血清中CD19+-EXO的含量对肿瘤的诊断,在灵敏度与特异性方面均显著优于CEA。对已确诊为肿瘤患者的验证性实验中,通过检测血清中CD19+-EXO的含量对肿瘤的检出率要显著高于CEA。以上结果表明,检测人体血清中CD19+-EXO的含量在肿瘤早期诊断中的应用前景。此外,在消化道肿瘤胃癌及肠癌的诊断中,通过检测血清中CD19+-EXO的含量来诊断肿瘤的灵敏度与特异性均可达到80%左右。在我国常规体检项目中,往往不包括胃、肠镜的检查。因此,通过检查人体血清中CD19+-EXO的含量,如发现该指标有显著升高的个体,可建议进行胃、肠镜的检查,从而增加早期胃、肠癌的检出率。

本发明提供了CD19阳性外泌体作为分子标记在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。

优选的,所述肿瘤为胃癌、肠癌、肺癌或乳腺癌。

优选的,所述肿瘤为早期肿瘤。

本发明还提供了一种基于检测血清中CD19阳性外泌体含量的肿瘤诊断试剂盒,包括用于捕获外泌体的包被抗体、抗CD19抗体、PBST缓冲液、封闭液、Avidin-HRP、二甲基联苯胺以及反应终止液。使用ELISA法检测:先通过包被抗体包被96孔酶标版;然后使用PBST缓冲液(含吐温的PBS缓冲液)洗板;用封闭液进行封闭,封闭液常用含10%胎牛血清的PBS缓冲液;再次用PBST缓冲液洗板后,加入待检测的血清,孵育;用PBST缓冲液洗板后,加入抗CD19抗体孵育;用PBST缓冲液洗板后,加入Avidin-HRP(亲和素标记的辣根过氧化物酶)孵育;用PBST缓冲液洗板后,加入底物二甲基联苯胺进行显色反应;加入反应终止液终止显色反应,反应终止液可以选择常用的1N的H2SO4溶液;检测450nm处吸光度(OD)值。

优选的,用于捕获外泌体的包被抗体为抗Rab5b抗体。

优选的,所述肿瘤诊断试剂盒还包括浓度已知的CD19阳性外泌体标准品。

更优选的,所述外泌体标准品通过培养B淋巴细胞瘤细胞株Raji细胞获得。Raji细胞分泌的外泌体表面CD19表达水平较高,可以作为检测血清中CD19阳性外泌体数量时的阳性对照,并用于获得CD19阳性的外泌体含量与吸光度(OD)值相互关系的标准曲线。

优选的,所述肿瘤为胃癌、肠癌、肺癌或乳腺癌。

优选的,所述肿瘤为早期肿瘤。

本发明发现肿瘤病人血清中CD19+-EXO的含量要明显高于健康人,且不同分期肿瘤病人血清中CD19+-EXO的含量没有显著性差异,提示其在肿瘤早期诊断中的价值,血清中CD19阳性外泌体含量可用于开发肿瘤诊断的试剂盒。基于血清中CD19阳性外泌体含量检测的肿瘤诊断试剂盒,在肿瘤早期诊断中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为流式细胞仪检测Raji细胞分泌的外泌体表面CD19表达水平结果图。

图2为Raji-EXO的电镜检测图。

图3为Raji细胞及Raji-EXO的Western blot检测结果图。

图4为CD19+-EXO含量与OD值相互关系的标准曲线图。

图5为乳腺癌病人和健康人血清中CD19+-EXO的含量在不同肿瘤分期病人中的比较结果图,其中HC表示健康人血清(下同),BC表示乳腺癌病人血清(下同),***表示两者在p<0.001具有显著性差异(下同),NS表示两者没有显著性差异(下同)。

图6为乳腺癌病人和健康人血清中CEA水平在不同肿瘤分期病人中的比较结果图,其中*表示两者在p<0.05具有显著性差异(下同)。

图7为肺癌病人和健康人血清中CD19+-EXO的含量在不同肿瘤分期病人中的比较结果图,其中LC表示肺癌病人血清(下同)。

图8为肺癌病人和健康人血清中CEA水平在不同肿瘤分期病人中的比较结果图。

图9为胃癌病人和健康人血清中CD19+-EXO的含量在不同肿瘤分期病人中的比较结果图,其中GC表示胃癌病人血清(下同)。

图10为胃癌病人和健康人血清中CEA水平在不同肿瘤分期病人中的比较结果图。

图11为肠癌病人和健康人血清中CD19+-EXO的含量在不同肿瘤分期病人中的比较结果图,其中IC表示肠癌病人血清(下同)。

图12为肠癌病人和健康人血清中CEA水平在不同肿瘤分期病人中的比较结果图,其中**表示两者在p<0.01具有显著性差异。

图13为乳腺癌病人血清中CD19+-EXO含量的受试者工作曲线。

图14为乳腺癌病人血清中CEA水平的受试者工作曲线。

图15为肺癌病人血清中CD19+-EXO含量的受试者工作曲线。

图16为肺癌病人血清中CEA水平的受试者工作曲线。

图17为胃癌病人血清中CD19+-EXO含量的受试者工作曲线。

图18为胃癌病人血清中CEA水平的受试者工作曲线。

图19为肠癌病人血清中CD19+-EXO含量的受试者工作曲线。

图20为肠癌病人血清中CEA水平的受试者工作曲线。

图21为胃炎病人血清中CD19+-EXO的含量检测结果图,其中GP表示胃炎病人血清。

图22为炎症性肠病病人血清中CD19+-EXO的含量检测结果图,其中EP表示肠炎病人血清。

图23为实施例9中胃癌病人血清中CD19+-EXO的含量检测结果图。

图24为实施例9中肠癌病人血清中CD19+-EXO的含量检测结果图。

图25为实施例9中CD19+-EXO与CEA分别在胃癌和肠癌中的诊断率结果比较图。

具体实施方案

正常人及肿瘤病人血清样品来源于浙江省肿瘤医院;胃炎及炎症性肠病病人血清样品来源于浙江大学医学院附属第二人民医院。

实施例1

流式细胞仪检测B淋巴细胞瘤细胞株Raji细胞分泌的外泌体表面CD19表达水平,其中阴性对照为抗CD19同型对照抗体染色组,结果如图1所示,Raji细胞分泌的外泌体表面CD19表达水平较高,可以作为检测血清中CD19阳性外泌体数量时的阳性对照,并用于获得CD19阳性的外泌体含量与吸光度(OD)值相互关系的标准曲线。

B淋巴细胞瘤细胞株Raji细胞来源外泌体(Raji-EXO)的提取和鉴定。提取方法如下:

Raji细胞培养上清,300g离心10分钟;收集上清,1200g离心20分钟;收集上清,10000g离心20分钟;收集上清,过0.22μm滤器,100000g离心60分钟;收集沉淀,沉淀用30mL PBS缓冲液重悬,100000g离心60分钟,沉淀即为外泌体。将外泌体重悬于200μL PBS缓冲液,经BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo Fisher,货号23252)确定Raji-EXO的浓度后,分装保存于-20度备用。

电镜对Raji-EXO的鉴定结果显示,制备的外泌体均为直径在100nm左右的小囊泡,具有典型的脂质双分子层结构(图2)。Western blot检测结果显示,Raji-EXO含有外泌体特征蛋白CD63、TSG101和Rab5b,而不含有内质网相关蛋白GRP94(图3),表明其内体来源。

实施例2

使用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测血清中CD19阳性的外泌体(CD19+-EXO)含量。具体步骤如下:

(1)以ELISA包被缓冲液为介质,抗Rab5b的抗体(Santa Cruz,货号sc-373725)作为包被抗体,抗体终浓度是4μg/ml,4℃包被96孔酶标板过夜;

(2)含0.05%吐温的PBS缓冲液(PBST)洗板4遍后,用含10%胎牛血清的PBS缓冲液,室温封闭1小时;

(3)PBST洗板4次后,加入100μl待检血清,37℃孵育过夜;

(4)PBST洗板4次后,以含10%胎牛血清的PBS缓冲液为介质,抗CD19的抗体(eBioscience,货号13-0199-82)为检测抗体,终浓度为4μg/ml,37℃孵育1小时;

(5)PBST洗板4次后,加入100μl的Avidin-HRP(eBioscience,货号18-4100)室温孵育1小时;

(6)PBST洗板6次后,加入0.3mg/ml的二甲基联苯胺底物室温反应15分钟;

(7)加入50μl 1N的H2SO4终止反应,450nm测量吸光度(OD)值;

(8)根据标准曲线计算得到待检测人血清样品中相对的CD19+-EXO含量。

根据ELISA的检测原理,最终测得的OD值实际是由外泌体中CD19分子的绝对数量决定,而CD19分子绝对数量与外泌体的质量成正比。如果1μg Raji-EXO与nμg血清CD19+-EXO均含有X个CD19分子,那么它们将对应相同的OD值。根据按上述步骤(1)~(7)方法测得某一血清样品OD值后,通过Raji-EXO标准曲线计算出的外泌体质量,需要乘以系数n,才为实际血清中CD19+-EXO的质量。在n系数未知的情况下,所测得的血清中CD19+-EXO的质量均为相对质量。

标准曲线确定:将已知浓度的Raji-EXO按浓度梯度稀释,然后按上述步骤(1)~(7)方法检测各浓度下的OD值,计算获得CD19阳性的外泌体含量与吸光度(OD)值相互关系的标准曲线。每次实验均独立制作标准曲线。在此,列举了某次实验为制作标准曲线所选取Raji-EXO的浓度及对应的OD值。检测了0、3.75、7.5、15、30μg的Raji-EXO对应的OD值分别为0.065、0.258、0.465、0.968、1.831,Raji-EXO的质量与OD值之间的线性方程为y=16.748x-0.7651,R2=0.999,其中x为OD值,y为Raji-EXO的质量(μg)(图4)。

实施例3

使用实施例2所述方法检测乳腺癌病人中CD19+-EXO的含量,以健康人血清作为对照,并同时检测这些样品中的CEA含量。CEA含量由浙江省肿瘤医院检验科利用化学发光微粒子免疫检测法(癌胚抗原测定试剂盒,雅培,货号7K68-32)测定,下同。

检测结果如图5和图6所示,健康人血清样品(HC)共86例,乳腺癌病人血清样品(BC)共80例,其中处于1期的为24例,处于2期的为33例,处于3期的为23例,结果显示乳腺癌病人血清样品中CD19+-EXO的含量要显著高于健康人,乳腺癌病人血清样品中CEA的含量(其中有4例病人血清的CEA数据丢失)也显著高于健康人;对不同分期的乳腺癌病人血清中的CD19+-EXO含量与CEA水平进行对比,发现CD19+-EXO含量在不同分期的乳腺癌病人血清中没有明显差异,而CEA水平在晚期乳腺癌病人(2期和3期)血清中要显著高于早期乳腺癌病人。

实施例4

使用实施例2所述方法检测肺癌病人中CD19+-EXO的含量,以健康人血清作为对照,并同时检测这些样品中的CEA含量。

检测结果如图7和图8所示,健康人血清样品(HC)共86例,肺癌病人血清样品(LC)共45例,其中处于1期的为27例,处于2期的为9例,处于3期的为9例,结果显示肺癌病人血清样品中CD19+-EXO的含量要显著高于健康人,肺癌病人血清样品中CEA的含量也显著高于健康人;对不同分期的肺癌病人血清中的CD19+-EXO含量与CEA水平进行对比,发现CD19+-EXO含量和CEA水平在不同分期的肺癌病人血清中均没有显著性差异。

实施例5

使用实施例2所述方法检测胃癌病人中CD19+-EXO的含量,以健康人血清作为对照,并同时检测这些样品中的CEA含量。

检测结果如图9和图10所示,健康人血清样品(HC)共86例,胃癌病人血清样品(GC)共81例,其中处于1期的为20例,处于2期的为30例,处于3期的为31例,结果显示胃癌病人血清样品中CD19+-EXO的含量要显著高于健康人,胃癌病人血清样品中CEA的含量也显著高于健康人;对不同分期的胃癌病人血清中的CD19+-EXO含量与CEA水平进行对比,发现CD19+-EXO含量和CEA水平均在不同分期的胃癌病人血清中没有明显差异。

实施例6

使用实施例2所述方法检测肠癌病人中CD19+-EXO的含量,以健康人血清作为对照,并同时检测这些样品中的CEA含量。

检测结果如图11和图12所示,健康人血清样品(HC)共86例,肠癌病人血清样品(BC)共99例,其中处于1期的为32例,处于2期的为31例,处于3期的为36例,结果显示肠癌病人血清样品中CD19+-EXO的含量要显著高于健康人,肠癌病人血清样品中CEA的含量也显著高于健康人;对不同分期的肠癌病人血清中的CD19+-EXO含量与CEA水平进行对比,发现CD19+-EXO含量在不同分期的肠癌病人血清中没有明显差异,而CEA水平在晚期(2期和3期)肠癌病人血清中要显著高于1期肠癌病人。

实施例7

敏感度(sensitivity),是指筛检方法能将实际有病的人正确地判定为患者的比例。

特异性(Specificity),是指筛检方法能将实际无病的人正确地判定为非患者的比例。

约登指数(Youden index):也称正确指数,是评价筛查试验真实性的方法,假设其假阴性(漏诊率)和假阳性(误诊率)的危害性同等意义时,即可应用约登指数。约登指数是敏感度与特异性之和减去1。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好,真实性越大。

受试者工作曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC),用于二分类判别效果的分析与评价。基本原理是:通过判断点(cutoff point/cutoff value)的移动,获得多对敏感度(sensitivity)和误判率(1-Specificity(特异性)),以敏感度为纵轴,以误判率为横轴,连接各点绘制曲线,然后计算曲线下面积(Area Under Curve,AUC),面积越大,判断价值越高。

乳腺癌(实施例3)、肺癌(实施例4)、胃癌(实施例5)、肠癌(实施例6)的受试者工作曲线分别如图13(乳腺癌、CD19+-EXO含量)、图14(乳腺癌、CEA水平)、图15(肺癌、CD19+-EXO含量)、图16(肺癌、CEA水平)、图17(胃癌、CD19+-EXO含量)、图18(胃癌、CEA水平)、图19(肠癌、CD19+-EXO含量)、图20(肠癌、CEA水平)所示。

人血清中CD19+-EXO的含量和CEA水平在乳腺癌诊断中灵敏度及特异性的比较结果如表1所示,其中的CI是Confidence Interval的缩写,指置信区间。取约登指数最大的点作为最佳cut-off值。乳腺癌、肺癌、肠癌和肺癌最佳cut-off值分别为64.21、64.44、64.41和64.02ng/μL;CEA的cut-off值的选取最接近于临床诊断上所采用的临界点5ng/ml时候的cut-off值(根据约登指数算出来的最佳cut-off值在3-4之间,而CEA临床的域值是5,所以这里采用了5为cut-off值,提高cut-off值有可能使检测的特异性达到100%,但检测的灵敏度则会大大下降)。

可见,血清中CD19+-EXO的含量对肿瘤诊断的敏感度要显著高于血清中CEA的水平对肿瘤的诊断。

表1

实施例8

血液中CEA水平对肿瘤诊断的特异性较差。因为除癌症病人外,吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎人群血清CEA水平也会升高。为评价血清中CD19+-EXO对肿瘤诊断的特异性,收集并检测了胃炎(51例)和炎症性肠病(61例)病人血清中CD19+-EXO的含量,并分别与健康人血清中CD19+-EXO的含量进行了对比,结果发现无论是胃炎(图21)还是炎症性肠病(图22)病人血清中CD19+-EXO的含量与健康人均无明显差异。

实施例9

为进一步明确血清中CD19+-EXO对肿瘤诊断的价值,分别收集了150例已经确诊为胃癌和肠癌的病人血清并检测了其中CD19+-EXO的含量,以健康人血清作为对照(图23、图24)。

在cut-off值定义在64.00ng/μL的时候,血清中CD19+-EXO对胃癌和肠癌的诊断率分别为78.67%和83.33%;同时,通过CEA对这些样品进行肿瘤的诊断,发现CEA的cut-off值定义在5ng/mL的时候对胃癌和肠癌的诊断率分别仅17.3%和37.3%(图25)。该结果表明,血清中CD19+-EXO对胃癌和肠癌的诊断率比临床上常用的的肿瘤标志物CEA具有明显的优势。

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