专利名称：一种无需分离dna的rna检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种利用反转录聚合酶链式反应检测RNA的试剂。
背景技术：
反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)是以RNA为原始模板的一种聚合酶链反应。RNA在体内是由RNA聚合酶以DNA为模板经转录而合成，而反转录PCR反应是在体外先由反转录酶以RNA为模板反转录后合成cDNA。cDNA的顺序与其对应的DNA顺序完全一样，所以微量DNA的存在必会干扰反转录PCR。现有的各种DNA或RNA分离方法或各种商品试剂盒虽能将DNA与RNA分开，但常会有微量DNA存在于RNA之中，反之亦然。由于TaqDNA聚合酶仅以DNA为模板，所以RNA的存在不干扰以DNA为模板的PCR，但如上所述，DNA的存在将干扰以RNA为原始模板的反转录PCR。为了克服DNA对反转录PCR的干扰已发展了多种试剂但仍有较大局限和缺点。第一种RNA检测试剂采用在反转录之前以DNase分解微量的DNA，但所用的DNAase必须非常纯不能含有RNase，微量的RNase将破坏RNA模板使扩增失败DNAase作用后又必须彻底破坏，否则也会造成扩增失败。第二种RNA检测试剂是设计正反PCR引物跨越至少一个内含子，虽然其通常能区分以RNA为原始模板的反转录PCR扩增产物和以DNA为模板的PCR扩增产物，但不能阻止PCR扩增产物的形成。应用这种试剂检测RNA时，PCR后必须用电泳方法将长度不同的二个产物分开。由于以DNA为模板的PCR扩增产物的外显子部位的顺序和以RNA为原始模板的扩增产物顺序完全相同，所以难以用探针和ELISA方法来检测。第三种RNA检测试剂是设计“骑墙”引物，即引物的5’侧在外显子部位而3’侧在内涵子部位，尽管它能阻止以DNA为模板的扩增，但是，设计“骑墙”引物必须知道外显子与内含子衔接部位的顺序，同时，该部位的顺序又需要符合引物与模板顺序高严谨性配对的要求，往往在实际应用时难以同时满足这二个要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题本发明提供一种无需分离DNA的RNA检测试剂，以克服现有RNA检测试剂难以排除样品中存在的DNA对以RNA为原始模板的RT-PCR的干扰的缺陷，使RT-PCR能在DNA存在下完成扩增。
发明构思mRNA与基因的外显子顺序完全一致，用Oligo(dT)、随机引物或基因专一引物进行反转录所得到的cDNA的顺序与基因的顺序也完全一样，使基因组DNA对以RNA为原始模板的反转录PCR的干扰无法克服。本发明的思路是设计反转录引物使其与目标基因不完全匹配但仍能完成反转录。由此得到的cDNA的顺序与基因的顺序不完全一样，在进行PCR时就有可能使反引物与cDNA退火而不与基因组DNA退火。这一设想能得之实现的条件是反转录引物不会以基因组DNA为模板合成足够长的DNA链。以下已被普遍认同的事实说明这种条件是能达到的。第一，基因组DNA呈双链通常需在90℃以上才会解链，而RNA在70℃左右即变性，所以，通过控制变性温度使反转录引物与RNA结合而不与呈双链的DNA退火。第二，DNA/RNA的互补结合比DNA/DNA更强，可设计反转录引物使其在指定的温度下与RNA结合而不与可能存在的呈单链的DNA结合。第三，反转录引物长度可以短至4-8个碱基，常用的随机引物组方法，每一个引物只有六个碱基，但随机引物PCR的长度通常为10个碱基。第四，反转录酶虽也能以DNA为模板合成另一链，但速度通常比以RNA为模板时的合成速度低，控制反转录时间和温度可使以DNA为模板的合成达不到需要的长度。本发明仍以PCR引物对中的反引物作为反转录引物，设计反引物也以目标基因顺序为模板，但是人为引入若干错配碱基，使反引物仍能在指定的反转录温度下与RNA模板结合并顺利完成反应得到目标cDNA。因为反引物与目标基因有若干错配，故正引物与cDNA退火生成的正链和正引物与基因组DNA退火生成的正链在3’端的顺序就不完全相同。反引物与以cDNA为模板得到的正链的顺序完全匹配，在指定的温度下能与模板退火完成扩增，但反引物与基因组DNA正链或与以基因组负链为模板得到的半扩增正链的顺序不完全匹配，在同样的PCR退火温度下就不能与模板退火使扩增流产。
技术方案本发明提供的一种无需分离DNA的RNA检测试剂，其组分包括四种dNTP、反转录酶、反转录引物、耐热DNA聚合酶、正反PCR引物，其特征在于反转录引物和PCR反引物为同一引物并且与目标基因顺序有2-15个碱基错配，优选有4-10个碱基错配。
上述的RNA检测试剂的一个优选方案为，与目标基因顺序有错配的碱基为3’端第一个碱基以外的任何碱基。
上述的RNA检测试剂的另一个优选方案为，设计反引物3’端的6-18个碱基顺序与目标基因顺序完全匹配；优选8-12个碱基，且与目标基因顺序完全匹配。
上述的RNA检测试剂的另一个优选方案为，设计反引物5’端的4-25个碱基顺序与目标基因顺序的匹配碱基百分比为＜40％；优选6-15个碱基，且与目标基因顺序的匹配碱基百分比＜40％。
为实现上述技术方案进行引物设计首先，以目标扩增基因的mRNA顺序为模板用人工方法、引物设计软件或人工与软件自动设计相结合的方法选择具有高严谨性的引物对，然后按设计常规改变反引物的碱基使之符合上述技术方案的要求，并再用引物设计软件验核改变后的反引物的严谨性。
上述RNA检测试剂使用时RT-PCR的操作可按现行的二步方法进行，即以基因专一引物进行反转录，然后接续PCR反应，也可按现行的单管法即将反转录和PCR在同一反应管中进行。PCR程序也与通常PCR步骤相同。
有益效果本发明提供的无需分离DNA的RNA检测试剂能排除样品中存在的DNA对以RNA为原始模板的RT-PCR的干扰，使RT-PCR能在DNA存在下完成扩增。这样一方面简化甚至省略了RNA与DNA的分离步骤，另一方面由于完全克服了DNA扩增产物的干扰，可使用简单的方法来检测RT-PCR扩增产物。
本发明的RNA检测试剂具备下列优势1.使反转录PCR对RNA的纯度要求降低，避免了用DNase分解DNA的步骤，也避免了因酶制剂不纯对扩增带来的负面影响。
2.为简化或省略RNA的提纯方法或过程创造了条件。
3.为省略电泳分离操作和在不开启反应管的情况下直接检测反转录PCR扩增产物创造了条件，使滞后污染得到克服。
4.引物设计时不需考虑跨越一个以上内含子的常规。
具体实施例方式
实施例1.
实施例1以beta-2肾上腺素受体基因(基因库编号M15169)为目标，设计RNA检测试剂及其引物序列，比较短链引物与RNA模板结合和与DNA模板结合能力的区别。试验中用到的引物顺序示于表1。
表1.实施例1的引物序列
本试验分二个部分，第一部分先以Oligo(dT)为反转录引物得到cDNA作为模板，然后用引物“B1”得到扩增产物，扩增产物长度为274碱基。再以此扩增产物作为模板比较引物对“B2”，“B3”和“B4”在不同温度下的扩增能力。“B2正”，“B3正”和“B4正”和“B2反”，“B3反”和“B4反”仅在5’端有1-2个不同，其余碱基顺序完全相同(用下划线表示)。
反转录步骤检测试剂的组成成分和含量为4种dNTP各1mM，MMLV反转录酶200unit/20μL反应液，重组RNase抑制剂20unit/20μL，反转录引物(即“B1反”)0.4uM。反转录条件为45℃30分钟。
PCR步骤检测试剂的组成成分和含量为4种dNTP各0.2mM，TaqDNA聚合酶2unit/20μL，1×PCR缓冲液，正反引物各0.4μM。反应液体积为每管5微升，每50微升反应液加5微升cDNA。PCR程序为初次变性94℃1分钟，循环变性94℃10秒钟，退火和延伸合并为75℃1分钟，共32循环，反应结束后用电泳染色检测无非专一扩增产物。然后将扩增产物稀释1000倍，作为引物“B2”，“B3”和“B4”的扩增模板，反应液体积为每管5微升，每50微升反应液加经稀释的扩增产物5微升，PCR程序为首次变性92℃1分钟，前三个循环变性92℃10秒钟，退火温度31-55℃30秒钟，延伸68℃30秒钟，后32循环与前3个循环相同，但变性为88℃10秒钟。试验结果示于表2表2.用短引物“B2”，“B3”和“B4”扩增的结果
表2说明当引物长度为8碱基时在所试退火温度范围内均得不到扩增产物。当引物长为10碱基时在较低退火温度下能扩增目标产物，而引物长为12碱基时在所试退火温度范围内均能得到目标扩增产物。
试验的第二部分先以RNA为模板用“B2反”，“B3反”和“B4”反作为反转录引物在不同的温度下合成cDNA，再以此cDNA为模板用引物“B5”进行扩增。反转录试剂与上相同，反转录引物浓度为1uM，反应时间为30分钟但反应体积为1微升，反应结束后加PCR反应液，其组成成份与上相同，每管反应体积5微升。PCR程序首次变性95℃1分钟，循环变性95℃15秒钟，退火65℃30秒钟，延伸72℃1分钟，共32循环。反应结束后电泳染色，结果示于表3。
表3.用短引物“ B2反”，“B3反”和“B4反”进行反转录再用B5扩增的结果
表3说明8个碱基长引物在所试温度范围内均能完成反转录，对比表2和表3的结果说明，控制引物的长度和反转录温度可以控制引物与RNA结合而不与DNA结合。
实施例2.
实施例2以人肌动球蛋白基因(基因库编号BC016045)为目标基因设计RNA检测试剂及其引物序列，进行mRNA检测。反应分cDNA制备和PCR二步进行。制备试剂与实施例1相同。PCR引物的顺序和主要特性示于表4和表5。其中引物“A反”与目标基因顺序完全匹配，引物“A反1”的3’端9个碱基与目标基因顺序匹配，5’端11个碱基与目标基因顺序完全错配。引物“A反2”有7个碱基与目标基因顺序错配，错配碱基用下横线示之。引物“A反3”仅11个碱基长，其顺序与目标基因完全匹配。正反引物跨越一个内涵子，基因组DNA扩增产物长度为363碱基。
表4.实施例2引物顺序
表5.实施例2引物特性
表5所示引物的解链温度和结合强度均为引物与完全匹配的模板结合时的数据。引物“A反2”与模板有7个错配，结合强度为256，根据最邻近碱基法计算的Tm低于30℃。
实施例2比较了以人基因组DNA为模板和以人组织总RNA为原始模板时应用上述引物时的扩增结果。人基因组DNA和总RNA均为商品购自Clontech公司，反转录引物为表4所述四种反引物。RNA的用量为每20微升反应液1微克，反转录在45℃反应维持5分钟，每管反应体积为20微升。基因组DNA浓度为0.5微克/100微升，cDNA加量为10微升/100微升反应液。PCR的正引物均为“A正”反引物为相应的反转录引物。PCR程序为首次变性94℃1分钟，循环变性94℃10秒钟，退火和延伸70℃1分钟，共28个循环。反应结束后按常规电泳并染色用扫描仪检测扩增产物条带。试验结果示于表6。
表6.实施例2试验结果
试验表明用标准的反转录PCR方法，基因组DNA会干扰以RNA为原始模板的反转录PCR。用短引物则得不到任何扩增产物。用本发明设计的短的但带尾或有若干错配的反引物“A反1”或“A反2”则能有效排除基因组DNA的干扰。
实施例3.
实施例3以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(基因库编号XM006959)为目标基因，设计RNA检测试剂及其引物序列。cDNA制备和PCR在一个反应管完成。检测试剂的组成成分和含量为1×RT-PCR缓冲液，MMLV反转录酶50unit/20μL反应液，TaqDNA聚合酶2unit/20μL，4种dNTP各0.2mM，重组RNase抑制剂10unit/20μL反应液，正反引物各0.4μM。PCR引物的顺序和主要特性示于表7和表8。其中引物“G反”与目标基因顺序完全匹配，引物“G反1”的3’端12个碱基与目标基因顺序匹配，5’端9个碱基与目标基因顺序完全错配。引物“G反2”有6个碱基与目标基因顺序错配，错配碱基均用下横线示之。引物“G反3”仅12个碱基长，其顺序与目标基因完全匹配。正反引物跨越三个内涵子，基因组DNA扩增产物长度为704碱基。
表7.实施例3引物顺序
表8.实施例3引物特性
表8所示引物的解链温度和结合强度均为引物与完全匹配的模板结合时的数据。引物“G反2”与模板有6个错配，结合强度为275，根据最邻近碱基法计算的Tm44.3℃。实施例3比较了以人基因组DNA为模板和以人组织总RNA为原始模板时应用上述引物时的扩增结果。人基因组DNA和总RNA来源与实施例2相同。反转录PCR每管反应体积为20微升，每100微升反转录PCR液加1微克总RNA或1微克基因组DNA。反转录在50℃反应维持5分钟。引物浓度，PCR程序和检测方法等均与实施例1相同，退火和延伸为72℃1分半钟。试验结果示于表9。
表9.实施例3试验结果
试验表明用标准的反转录PCR方法，基因组DNA会干扰以RNA为原始模板的反转录PCR。用短引物则得不到任何扩增产物。用本发明设计的短的但带尾或有若干错配的反引物“G反1”或“G反2”则能有效排除基因组DNA的干扰。
权利要求
1.一种无需分离DNA的RNA检测试剂，其组分包括四种dNTP、反转录酶、反转录引物、耐热DNA聚合酶、正反PCR引物，其特征在于反转录引物和PCR反引物为同一引物并且与目标基因顺序有2-15个碱基错配。
2.根据权利要求1所述的RNA检测试剂，其特征在于反转录引物和PCR反引物为同一引物并且与目标基因顺序有4-10个碱基错配。
3.根据权利要求1所述的RNA检测试剂，其特征在于错配碱基为3’端第一个碱基以外的任何碱基。
4.根据权利要求1、2或3所述的RNA检测试剂，其特征在于反引物3’端的6-18个碱基顺序与目标基因顺序完全匹配。
5.根据权利要求1、2或3所述的RNA检测试剂，其特征在于反引物3’端的8-12个碱基顺序与目标基因顺序完全匹配。
6.根据权利要求1所述的RNA检测试剂，其特征在于反引物5’端的4-25个碱基顺序与目标基因顺序的匹配碱基百分比＜40％。
7.根据权利要求1所述的RNA检测试剂，其特征在于反引物5’端的6-15个碱基顺序与目标基因顺序的匹配碱基百分比＜40％。
全文摘要
本发明提供一种无需分离DNA的RNA检测试剂，其组分包括四种dNTP、反转录酶、反转录引物、耐热DNA聚合酶、正反PCR引物，其中反转录引物和PCR反引物为同一引物并且与目标基因顺序有2－15个碱基错配，错配碱基为3’端第一个碱基以外的任何碱基，本方法能排除样品中存在的DNA对以RNA为原始模板的RT－PCR的干扰，使RT－PCR能在DNA存在下完成扩增。一方面简化甚至省略了RNA与DNA的分离步骤，另一方面由于完全克服了DNA扩增产物的干扰，可使用闭管法来检测RT－PCR扩增产物。这种扩增产物专一的单管法和检测方便的闭管法RT－PCR，能在分子生物学研究和临床高通量快速诊断中普遍应用。
文档编号C12Q1/68GK1580280SQ03141988
公开日2005年2月16日 申请日期2003年7月31日 优先权日2003年7月31日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧