专利名称：一种人原代肿瘤细胞分离与培养试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种人原代肿瘤细胞分离与培养试剂盒。
背景技术：
肿瘤细胞培养是研究癌变机理和肿瘤细胞生物学特征的重要手段，应用体外培养技术进行肿瘤研究具有许多优点(I)可免受机体内部因素的影响，从而便于探索物理、化学和生物等各种因素对肿瘤细胞生命活动的影响；(2)便于研究肿瘤细胞的结构和功能;可长期保存以便观察肿瘤细胞遗传行为的改变；(4)可用于快速筛选抗癌药物。肿瘤细胞培养技术分为原代肿瘤细胞培养和肿瘤细胞株培养。原代肿瘤细胞培养指直接从活体肿瘤标本中分离肿瘤细胞后培养在体外环境中；肿瘤细胞株培养指将活体肿瘤标本来源的肿瘤细胞体外培养，不断纯化，形成生物性状和遗传基本一致的细胞株，随着肿瘤不断传代，其细胞株的生物学特征和遗传性状与原代肿瘤细胞相比可能也会发生一定的变化，因此原代肿瘤细胞培养是许多肿瘤学研究(如个体肿瘤药敏试验、个体化的肿瘤抗原诱导的肿瘤生物治疗、肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞实验等)的关键技术之一。近年来研究证实，树突状细胞(DC)被各种形式的肿瘤抗原致敏后可以在体内外诱导出肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，目前利用DC进行肿瘤免疫治疗已进入临床试验阶段。GM-CSF与IL-4联合应用可诱导单核细胞成为具有未成熟表型的DC，再予一定的刺激信号作用，如TNF-α、LPS等细胞因子，可诱导出成熟DC，使其抗原呈递功能达到最佳状态。在体外细胞培养和裸鼠肿瘤动物模型的肿瘤杀伤试验中，肿瘤抗原负载的 DC-CIK(树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞)疗法在T细胞激活、诱导肿瘤细胞凋亡等方面较其它生物治疗方式如LAK (淋巴因子激活的杀伤细胞)治疗等表现出明显的优势， 但在临床应用研究中也发现，DC-CIK疗法并未获得如体外培养和动物模型中一般的治疗效果，究其原因，可能与DC低表达MHC I类分子有关，而MHC I类分子正是递呈肿瘤抗原的必要分子，也可能与目前原代肿瘤细胞分离与培养技术有关。实体肿瘤组织中除含有肿瘤细胞以外,还包括大量的红细胞、单核细胞、淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞等细胞成分,肿瘤组织经胶原酶等消化液消化分离后，上述细胞与肿瘤细胞一起被分离，混合培养后，即使经过肿瘤细胞的选择性培养基筛选，所获得的肿瘤细胞纯度也约在60% 70%，仍然可能影响肿瘤特异性激活CTL的能力。在原代肿瘤细胞分离与培养过程中，细菌污染也是一个影响培养成功率的严重问题，肿瘤标本多来自于手术切除的大体标本，在剪切肿瘤标本及转移至实验室的过程中都有可能受到细胞污染，尤其是胃肠道肿瘤，标本本身即可能带有大量胃肠道细胞，因此原代肿瘤细胞培养过程中需要极其细胞预防细胞污染的问题。当前的原代肿瘤细胞培养方法仍采用的是传统的原代细胞培养方法，主要过程包括(I)清洗标本并将肿瘤标本剪碎成约I mm3大小；(2)将剪碎的肿瘤标本用胰酶或胶原酶消化；(3)收集消化下来的细胞，用密度梯度离心法等各种方法加以纯化后在肿瘤细胞专用培养基中培养。在上述过程中需要用到多种的耗材和试剂，包括细胞培养皿或培养板、 消化酶、清洗液、分离液、选择隆培养液等等，很容易出现细胞污染的问题。因此有必要开发专门的各种肿瘤原代培养的试剂盒。
发明内容
本发明提供一种人原代肿瘤细胞分离与培养试剂盒，由包装盒、6孔细胞培养板、 清洗液、胰酶消化液、胶原酶一透明质酸酶消化液、细胞分离液、肿瘤选择性培养液、使用说明书组成。其中清洗液是含青霉素400U/mL、链霉素400ug/mL的无菌RPMI 1640细胞培养液， 分装入2支5ml无菌密封瓶，贴上标签，4°C保存。胰酶消化液是用无菌超纯水配制含O. 1%胰蛋白酶(购自Sigma公司，IOOmg)、 10g/L聚乙烯吡咯烷酮的胰酶消化液，分装入5ml无菌密封瓶，贴上标签，4°C保存。胶原酶一透明质酸酶消化液是用RPMI 1640细胞培养液配制胶原酶一透明质酸酶消化液，其中胶原酶(购自Sigma公司，IOOmg)终浓度为2g/L,透明质酸酶(购自Sigma 公司，IOOmg)终浓度为2g/L，分装入5ml无菌密封瓶，贴上标签，4°C保存。细胞分离液是将纯percoll分离液(购自Pharmacia, IOOml)与10倍PBS缓冲液以体积比为9:1比例混合后再与I倍PBS液以体积比为7:3比例混匀后制备密度为I. 09 的细胞分离液，分装入5ml无菌棕色密封瓶，贴上标签，4°C避光保存。肿瘤选择性培养液是在RPMI 1640细胞培养液基础上添加10%新生胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100ug/mL、胰岛素5ug/mL、氢化可的松2ug/mL、人重组表皮生长因子 5ng/mL (购自Invitrogen公司，IOOug),分装入5ml无菌密封瓶,贴上标签,4°C保存。本发明的有益效果使用本发明可以更简便地实施体外原代肿瘤细胞的分离与培养，培养的肿瘤细胞纯度更高，受细胞污染的机会更少。本发明的主要技术原理是采用胰酶消化液和胶原酶、透明质酸酶消化液递次消化提高消化效果;70% percoll分离液去除红细胞；鼠尾胶原与鼠抗人THY-I抗体混合包被肿瘤选择培养孔；用肿瘤选择性培养基扩增培养肿瘤细胞，从而获得纯度极高的原代肿瘤细胞，分离与培养过程中受细菌污染的机会少， 仅需要少量离心管等其它常用耗材，因此具有简单方便和培养效果好的优点。为了克服当前原代肿瘤细胞培养过程复杂、所得肿瘤纯度不高、易受细胞污染的问题，简单方便。
图I是本发明的结构示意图。图2是本发明6孔细胞培养板编号不意图。图3是e孔中贴壁的淋巴细胞和单核细胞图。图4是f孔中贴壁的肿瘤细胞图。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例一
参见图I、图2，试剂盒由包装盒1、1块6孔细胞培养板2、5ml清洗液3、1瓶5ml胰酶消化液4、I瓶5ml胶原酶一透明质酸酶消化液5、I瓶5ml细胞分离液6、I瓶5ml肿瘤选择性培养液7、使用说明书8组成。
其中清洗液3是含青霉素400U/mL、含链霉素400ug/mL的无菌RPMI 1640细胞培养液，装入2个5ml无菌密封瓶，贴上标签，4°C保存。胰酶消化液4是用无菌超纯水配制含O. 1%胰蛋白酶(购自Sigma公司，IOOmg)、 10g/L聚乙烯吡咯烷酮的胰酶消化液，分装入5ml无菌密封瓶，贴上标签，4°C保存。胶原酶一透明质酸酶消化液5是用RPMI 1640细胞培养液配制胶原酶一透明质酸酶消化液，其中胶原酶(购自Sigma公司，IOOmg)终浓度为2g/L,透明质酸酶(购自Sigma 公司，IOOmg)终浓度为2g/L，分装入5ml无菌密封瓶，贴上标签，4°C保存。细胞分离液6是将纯percoll分离液(购自Pharmacia, 100ml)与10倍PBS缓冲液以体积比为9:1比例混合后再与I倍PBS液以体积比为7:3比例混匀后制备密度为I. 09 的细胞分离液，分装入5ml无菌棕色密封瓶，贴上标签，4°C避光保存。肿瘤选择性培养液7是在RPMI 1640细胞培养液基础上添加10%新生胎牛血清、 青霉素100U/mL、链霉素100ug/mL、胰岛素5ug/mL、氢化可的松2ug/mL、人重组表皮生长因子5ng/mL (购自Invitrogen公司，IOOug),分装入5ml无菌密封瓶,贴上标签,4 保存。6孔细胞培养板2可采购市场普通6孔细胞培养板加以消毒灭菌或进口已消毒独立包装的6孔细胞培养板(如美国CORNING，货号3516)。使用本试剂盒前先给6孔细胞培养板2每孔编号(a-f) 6孔细胞培养板2中第a、b、C、d、f孔的孔壁不加任何处理，第e 孔用鼠尾胶原蛋白混合鼠抗人THY-I单克隆抗体包被孔壁，包被方法用无菌0. 006mol/ L(0. 36g/L)乙酸配制鼠尾胶原和抗THY-I单抗混合液鼠尾胶原蛋白(购自杭州生友生物技术有限公司，IOmg)终浓度为12ug/ml和人抗鼠THY-I抗体(购自上海瑞齐生物科技有限公司，Img)终浓度为5ug/ml ;在第e孔加入I. 5ml尾胶原蛋白和抗THY-I单抗混合液,开盖在超净台上过夜晾干，用PBS洗3-4次后晾干，装入I次性医用包装袋(购自深圳安保包装有限公司)密封。实施例二
参见图2，使用本试剂盒先给6孔细胞培养板2每孔编号(a-f)。(I)切取肿瘤标本后，放入6孔细胞培养板2的其中a孔，倒入清洗液3覆盖标本；
(2)在第I孔中清洗肿瘤标本,将标本移入b孔，倒入清洗液3，并将肿瘤标本剪碎或切成Imm3大小；
(3)将清洗剪碎的肿瘤标本块移入c孔，倒入胰酶消化液4，在37°C细胞培养箱中预消化15分钟；
(4)移出细胞培养箱后将经过预消化的肿瘤标本移入d孔，倒入胶原酶一透明质酸酶消化液5，在4°C冰箱中消化过夜；
(5)过夜消化后，收集消化下来的细胞悬液，经200目细胞滤网过滤至50ml离心管，在 15ml离心管中先加入细胞分离液6，在细胞分离液6的上层缓慢加入滤过的细胞悬液，上离心机分离(2000转/分，15分钟)，沉入离心管底部的为红细胞，位于细胞分离液与消化液之间可见一浑浊细胞层，为包括肿瘤细胞在内的混合细胞层，吸取混合细胞层的细胞悬液， 清洗2次去除消化液和分离液，加入肿瘤选择性培养液7，细胞计数板计数，调整细胞密度至 I X 106/L ；
(6)将混合细胞悬液移入e孔，放入37°C、5%CO2的细胞培养箱中2小时；
(7)2小时后单核细胞、淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞将贴在孔壁上，肿瘤细胞悬浮生长，吸取悬浮的肿瘤细胞后移入f孔，放入37°C、5% CO2的细胞培养箱中继续培养，最终获得高纯度的生长良好的肿瘤细胞。结果参见图3，图中A为单核细胞(大)，B为淋巴细胞 (小)。 实施例三
取肝癌组织标本，操作步骤同实施例2，最终获得高纯度呈悬浮状生长的肝癌细胞。结果参见图4，是第f孔中培养的原代肝癌细胞，图中C为悬浮的肝癌细胞。
权利要求
1.一种人原代肿瘤细胞分离与培养试剂盒，由包装盒(I)、6孔细胞培养板(2)、清洗液(3)、胰酶消化液(4)、胶原酶一透明质酸酶消化液(5)、细胞分离液(6)、肿瘤选择性培养液(7)、使用说明书(8)组成；其中所述清洗液(3)是含青霉素400U/mL、链霉素400ug/mL的无菌RPMI 1640细胞培养液；胰酶消化液(4)是用无菌超纯水配制含O. 1%胰蛋白酶、10g/L 聚乙烯吡咯烷酮的胰酶消化液；胶原酶一透明质酸酶消化液(5)是用RPMI 1640细胞培养液配制，胶原酶终浓度为2g/L，透明质酸酶终浓度为2g/L ;细胞分离液(6)是将纯percoll 分离液与10倍PBS缓冲液以体积比为9:1比例混合后再与I倍PBS液以体积比为7:3比例混匀后制备密度为I. 09的细胞分离液；肿瘤选择性培养液(7)是在RPMI 1640细胞培养液中添加10%新生胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100ug/mL、胰岛素5ug/mL、氢化可的松 2ug/mL、人重组表皮生长因子5ng/mL。
2.根据权利要求I所述的一种人原代肿瘤细胞分离与培养试剂盒，其特征在于，所述含青霉素清洗液(3)、含链霉素清洗液(4)、胰酶消化液(5)、胶原酶一透明质酸酶消化液 (6)、细胞分离液(7)、肿瘤选择性培养液(8)，均分装入5ml无菌密封瓶，贴上标签，4°C保存。
全文摘要
本发明提供一种人原代肿瘤细胞分离与培养试剂盒，由包装盒、6孔细胞培养板、清洗液、胰酶消化液、胶原酶－透明质酸酶消化液、细胞分离液、肿瘤选择性培养液、使用说明书组成。其中清洗液是含青霉素400U/mL、链霉素400ug/mL的无菌RPMI1640细胞培养液。本发明克服当前原代肿瘤细胞培养过程复杂、所得肿瘤纯度不高、易受细胞污染的问题。本发明设计合理，在进行体外原代肿瘤细胞的分离与培养过程中受细菌污染的机会少，仅需要少量离心管等其它常用耗材，因此使用简单方便，培养的肿瘤细胞纯度更高、效果好。
文档编号C12N5/09GK102604895SQ201110447429
公开日2012年7月25日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者丁国平, 曹利平 申请人:浙江大学