专利名称：鲍鱼肠弧菌作为饲料添加剂在鲍鱼养殖中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鲍鱼肠弧菌(KiArio Aa7io(ico7i)的新用途,尤其是一种鲍鱼肠弧菌作为饲料添加剂在鲍鱼养殖中的应用。
背景技术：
皱纹盘鲍(Wiodi discus Aa/wai)是我国重要的海洋生物资源，自然分布于渤海、黄海和日本海水域，素有海洋软黄金之称，位居海产八珍之首，具有很高的营养及药用价值。但是鲍鱼生长慢是鲍鱼养殖业面临的主要问题之一，尽管通过人工饲喂配合饵料能够加快鲍鱼的生长速度，但仍需要:T4年才能达到80 mm的市场标准；高度集约化人工养殖在应用配合饵料的同时还会带来水质恶化快、饲料系数偏低及病害发生严重等问题。为了进一步提高鲍鱼的生长速度及保证成品鲍鱼的质量，人们对鲍鱼苗种品质的关注度越来越高，当育苗场在11月份出苗时，生长速度快的幼鲍，由于其规格大于市场标准(2cm)，更受顾客青睐。鲍鱼肠弧菌(Vibrio halioticoli )是皱纹盘鲍肠道优势菌，其16S rDNA序列在GenBank数据库中已有记载，相关弧菌登陆号如下表
菌株I登陆号
Vibrio breoganiiEF599161
Vibrio comitansDQ922915
Vibrio ezuraeAY426980
Vibrio halioticoliAB000390
Vibrio IiarveyiAY750575
Vibrio neonatusAY426979
但是，迄今为止，尚未有关于鲍鱼肠弧菌作为鲍鱼养殖饲料添加剂(混合在饲料中或播洒在水池中)的应用。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述问题，提供一种鲍鱼肠弧菌作为饲料添加剂在鲍鱼养殖中的应用。所述鲍鱼肠弧菌是WA51菌株，WA51菌株16S rDNA的基因片段序列长度是1456bp，序列信息如下
GCTTGGGCGCAGACTACCATGCAAGTCGAGCGGAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTC
GAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACC
GCATAACGTCTACGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCTTCAGGATATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTT
GGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACAC
GGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGT
ATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGCGTTAAAGTTAATAGCTTTATCGTTTGACG
TTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAAT
TACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACTGGCAGGCTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTTAGCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCCAACCAGCGATGGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTGGGTAGTTTAACCTTCGGGAGGACGCTCAAGAGCTGTACGCCGGCC本发明发现了鲍鱼肠弧菌(WA51菌株)具有很强的褐藻酸酶活力，能够将饲料中海藻主要成分褐藻酸降解为易于机体吸收的寡糖和短链脂肪酸，发明了鲍鱼肠弧菌作为饲料添加剂在鲍鱼养殖中的应用。作为幼鲍饲料添加剂利于幼鲍同病原菌竞争黏附位点，维持肠道正常微生态平衡并能够在鲍鱼肠道中长期定植，促进营养吸收、提高免疫力进而提高皱纹盘鲍生长速度和抗病能力，可替代化学药物进行疾病防治，不破坏生态环境；鲍鱼肠弧菌(WA51菌株)作为喷洒在水体中的幼鲍饲料添加剂，除具有上述功能外，因其在水体中能够存活并且对藻类无杀灭作用，鲍鱼肠弧菌(WA51菌株)的大量增殖，可同水体中病原菌竞争营养以及分解水体中的有机质，起到净化水质的作用。
图1是依据16SrDNA序列构建的鲍鱼肠弧菌WA51菌株的系统进化树图。
具体实施例方式一.鲍鱼肠弧菌WA51菌株的分离筛选 I.鲍鱼来源
采自大连海域。2.鲍鱼肠弧菌WA51菌株的分离
无菌条件下解剖健康皱纹盘鲍的肠道并匀浆，梯度稀释后涂布到2216E固体培养基上，25°C恒温培养72、6h ;挑取如表I形态的菌株分离纯化后接种到2216E斜面培养基保藏待用；所述的2216E培养基的组分及配比为蛋白胨0. 5g，酵母膏0. lg，磷酸高铁
0.OOlg，海水 IOOOmL, pH 7. 2 7. 4，121°C灭菌 20min。表I菌株的培养特征
谓—hi:—通―麗 it..........-—Stf——.his.........—天不——I......s.....I......
';;丨'鼇 \;\\鼇'
■+'.................一隱获:—一祖..........................m 麵...........................羅一-承麵一^gaa—丽.........................
i*i鮮
3.鲍鱼肠弧菌WA51菌株的筛选
取实验室保藏的上述步骤2分离得到的皱纹盘鲍肠道细菌株，重新接种活化24h后点种于APY固体培养基上，置恒温培养箱25°C培养4天后，用1%的氯化钙溶液处理点种的菌株，筛选出水解圈直径同菌体直径比值最大的菌株，即鲍鱼肠弧菌WA51。所述APY培养基的组分及配比分别为蛋白胨0. 5%，海藻酸钠0. 5%、酵母膏0. 1%、琼脂I. 6% (固体)。二.鲍鱼肠弧菌WA51菌株的鉴定
I.鲍鱼肠弧菌WA51菌株生理生化特征 鲍鱼肠弧菌WA51在光学显微镜下观察有鞭毛，细胞革兰氏染色阴性，产生吲哚，发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、淀粉产酸不产气，不能利用半乳糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖、L-阿拉伯糖和几丁质，对弧菌抑制剂0/129敏感，接触酶阳性，氧化酶阳性，无盐条件下不生长，不具有运动型，还原硝酸盐。2. WA51菌株16S rDNA的基因片段序列测定
将WA51菌株纯培养物接种于普通肉汤，28°C摇床培养48h，离心收集菌体，采用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌总DNA。扩增WA51菌株16S rDNA的基因采用通用引物，正向引物为
5 ; - CAGGCCTAACACATGCAAGTC - 3 ;(对应于万.16S rDNA 5 ; 43_63f)，反向引物为3' - GGGCGGffGTGTACAAGGC - 5 ;(对应于万.16S rDNA 3 ; 1405-1387r),由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系(50 iiL) :10XPCR Buffer5 u L, 25mmol/LMgCl2 4 u L, 2mmol/L dNTPs 4 y L，5U/y L 的 Taq DNA 聚合酶 0. 5 y L，
0.6mmol/L的引物各I U L，模板DNA 2 u L, ddH20 32. 5 u L0 PCR反应条件在94°C预变性5min,进入循环扩增阶段94°C变性Imin — 56°C复性Imin — 72°C延伸2min,循环35次，最后72°C延伸5min。结束反应后，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶回收试剂盒回收，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。WA51菌株16S rDNA的基因片段序列长度是1456bp。WA51菌株16S rDNA序列信息 GCTTGGGCGCAGACTACCATGCAAGTCGAGCGGAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTC
GAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACC
GCATAACGTCTACGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCTTCAGGATATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTT
GGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACAC
GGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGT
ATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGCGTTAAAGTTAATAGCTTTATCGTTTGACG
TTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAAT
TACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTT
GAAACTGGCAGGCTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGA
ATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGA
TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCG
TTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA
GCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTTAGCAGAGATGGTTTG
GTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGC
AACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGA
GGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCCAACCAGCGATGGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTGGGTAGTTTAACCTTCGGGAGGACGCTCAAGAGCTGTACGCCGGCC3. WA51菌株序列分析和系统进化树的构建
将测定的WA51菌株16S rDNA序列，与GenBank数据库中的所有已测定的原核生物16S rDNA进行比对，其中WA51同鲍鱼肠弧菌{Vibrio halioticoli)的相似率达到99. 3%。利用Blast程序从GenBank数据库中调出相关弧菌模式菌株的16S rDNA序列(相关弧菌菌株的登陆号如背景技术图表所示)，通过Clustal X I. 83软件进行多序列比对，并采用Neighbour-joining法进行系统进化树的构建(如图I所示)，分析表明WA51菌株与鲍鱼肠弧菌(m_rio Aa7io(ico7i)之间 的进化距离相隔较近。再结合WA51菌株的形态特征、和生理生化特征，认为WA51菌株属于鲍鱼肠弧菌{Vibrio halioticoli)。该菌株WA51经形态学观察和16S rDNA序列同源性分析，鉴定为鲍鱼肠弧菌(Vibrio halioticoli、。三.鲍鱼肠弧菌WA51菌株对海藻的作用
I.培养基采用海带粉作为营养源。2.接种与培养从斜面挑取筛选的鲍鱼肠弧菌WA51菌株接种到150ml的
APY液体培养基中，25°C培养48h作为发酵液的种子液，按照10%的接种量吸取25ml种子液加入发酵培养基中，25°C培养24h，转速120rpm/min。培养结束后测定发酵液中总酸度、多糖和总蛋白含量，取样均在无菌条件下操作。测定结果见表2。表I鲍鱼肠弧菌WA51发酵海带粉营养物质含量变化
权利要求
1.一种鲍鱼肠弧菌作为饲料添加剂在鲍鱼养殖中的应用。
2.根据权利要求I所述鲍鱼肠弧菌作为饲料添加剂在鲍鱼养殖中的应用，其特征在于所述鲍鱼肠弧菌是WA51菌株，WA51菌株16S rDNA的基因片段序列长度是1456bp，序列信息如下GCTTGGGCGCAGACTACCATGCAAGTCGAGCGGAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTGGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACGTCTACGGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCTTCAGGATATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGCGTTAAAGTTAATAGCTTTATCGTTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAACCGCATTTGAAACTGGCAGGCTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTTAGCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCCAACCAGCGATGGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTGGGTAGTTTAACCTTCGGGAGGACGCTCAAGAGCTGTACGCCGGCC o
全文摘要
本发明涉及一种鲍鱼肠弧菌作为饲料添加剂在鲍鱼养殖中的应用，鲍鱼肠弧菌(WA51菌株)具有很强的褐藻酸酶活力，能够将饲料中海藻主要成分褐藻酸降解为易于机体吸收的寡糖和短链脂肪酸，发明了鲍鱼肠弧菌作为饲料添加剂在鲍鱼养殖中的应用。作为幼鲍饲料添加剂利于幼鲍同病原菌竞争黏附位点，维持肠道正常微生态平衡并能够在鲍鱼肠道中长期定植，促进营养吸收、提高免疫力进而提高皱纹盘鲍生长速度和抗病能力，可替代化学药物进行疾病防治，不破坏生态环境。
文档编号C12N1/20GK102613394SQ20111044661
公开日2012年8月1日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者冷晓飞, 刘小林, 刘明泰, 姜海峰, 常亚青, 张艳, 李旭光, 王高学, 许淑芬, 邹闯, 陈丹, 高洪涛 申请人:大连海宝渔业有限公司