诱导普通小球藻zf藻株高效积累花生四烯酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一种诱导普通小球藻ZF藻株高效积累花生四烯酸的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]小球藻(Chlorella)是一种常见的水生单细胞藻类，是绿藻小球藻科中的一个重要属，生态分布广泛，在海水和淡水中均有分布，目前包括大约10个种。小球藻细胞内含有丰富的蛋白质(干重的50%)、必需氨基酸、多糖、脂类(脂肪酸积累的结果)、叶绿素、胡萝卜素、和维生素等等，在保健食品、水产养殖(饲料添加剂)、化妆品、医药等领域内应用广泛，国内外市场供不应求。与美国、日本、以色列等国家相比，我国的小球藻工业化大规模培养水平相对滞后。普通小球藻ZF藻株是一种球形单细胞淡水藻类，通常生长在富营养化的水体中，但在人工培养条件下能大量生长繁殖。营养盐(氮、磷等)、光照、pH值、温度、微量元素(铁、锰、砸等)、碳酸氢铵、等因素均能影响小球藻生长。
[0003]花生四烯酸(AA)，化学名称为5，8，11，14一二十碳四烯酸，其含有20个碳原子，4个不饱和键，属于n-6系列的长链多不饱和脂肪酸(PUF A)，简记为20:4 (n_6)。人们从研究爱斯基摩人心血管疾病发病率低的现象中了解到，二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等长链不饱和脂肪酸(PUFA)可以防止胆固醇在动脉血管壁上沉积，预防心血管疾病的发生，从此开始了对PUFA与疾病以及亚健康人群之间关系的研究，AA的生理活性也逐渐被人们所认识。AA广泛分布于动物的中性脂肪中，它是牛乳脂、猪脂肪、牛脂肪、血液、磷脂、肝磷脂和脑磷脂中的一种成分，但含量较少，同时也是肾上腺磷脂混合脂肪酸的一种主要成分。此外，油料种子中也含有AA，它是花生油的主要成分。有研究报道，Sohlek等人在几种苔藓和蕨类植物中检测到了 AA。在日本的沙丁鱼中，也分析得到了 AA。真菌中，AA主要分布在原始的几个纲中，例如卵菌纲(Oomycetes)、丝壶菌纲(Hyphochytrimycete)、壶菌纲(Hytrid1mycetes)和被孢霉属(Mortierella)。传统制备AA主要是从深海鱼油中提取，其含量一般只有0.2% (W/W)，因受到季节、产地等因素的影响，鱼油中AA的含量不稳定并且比较匮乏，故价格十分昂贵。在我国，有关AA产品的相关报道很少，有待于大力的研究开发。微藻是进行植物生长调节剂诱导的优良材料，其结构简单、生命周期短、光敏性强、代谢过程极易受环境影响，也容易被检测。
[0004]目前，国内外已经公开了一些制备花生四烯酸的方法工艺的相关技术，大多数是针对一些提纯、分离等技术改良的。如华中科技大学公布了一种花生四烯酸发酵制配方法(CN1323904A)，其特征在于改良了花生四烯酸大量合成的培养基及发酵条件，其培养基成本低廉，取材容易，操作过程简单易行，但发酵工艺操作流程复杂，生产周期长，并涉及发酵罐等仪器设备的使用。马泰克生物科学有限公司公开了一种花生四烯酸及其生产和使用方法(CN1175976A)，所述的油脂中AA含量与EPA含量之比至少约5: 1，更好10: 1，最好至少20: I。该文献方法中采用的微生物也是高山被孢霉菌，是通过控制过程中的pH值实现高AA含量的。但是，上述文献的不足之处在于，在提高AA在油脂中含量的同时，EPA的含量仍较高，其给出的实例中EPA与AA之比最少也超过5%。而高含量的二十碳五烯酸对婴幼儿的不利影响限制了 AA在婴幼儿食品中的广泛应用。而且，现有技术中生产花生四烯酸油脂的方法及获得的产品中仍然存在着油脂中花生四烯酸含量偏低，或者EPA含量偏高的缺陷，同时还存在发酵所采用的培养基成本高，以及非野生性菌种发酵存在的生产不稳定以及食用安全等诸多问题。华中科技大学和武汉市福星生物药业有限公司联合公布了一种花生四烯酸油脂及其微生物发酵生产方法(CN1539982A)，提供一种筛选的野生高产菌株和相应的花生四烯酸油脂的廉价发酵生产方法。但该方法涉及发酵工艺，成本相比而言，还是较高，而且发酵工艺条件等要求交严格。武汉烯王生物工程有限公司提供了一种用离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法(CN1362522A)，该发明提供了一种用高活性的离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法，从而可得到产量高、花生四烯酸含量高、价格便宜的产品，为人类的保健和预防疾病提供了条件。该方法采用采用离子生物工程诱变技术，操作难度系数增大，不宜于大规模生产。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种操作简单、速度快、造价低、无污染的诱导普通小球藻ZF藻株高效积累花生四烯酸的方法。其具体的技术方案为:
[0006]—种诱导普通小球藻ZF藻株高效积累花生四烯酸的方法，其特征在于采用如下步骤:
[0007]I)制备藻液:在230C ±2°C、光强1900± 10lx和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍BGll培养基培养普通小球藻ZF藻株细胞28天至对数生长期，获得用于植物生长调节剂诱导的藻液，培养期间每14天加一次I倍浓度的BGll营养盐；
[0008]2)积累花生四烯酸:取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入植物生长调节剂6-BA，植物生长调节剂6-BA在藻液中的浓度为0.1±0.005mg/L，于230C ±2°C进行诱导处理14± I天，处理阶段每天人工摇藻不少于3次，相邻摇藻时间间隔不小于2小时，实现花生四烯酸在藻液中的积累。
[0009]本发明与现有技术相比，其优点是:
[0010]1、简单易行，原材料普通小球藻ZF藻株细胞易于培养，周期短，成本低。
[0011]2、能显著提高普通小球藻ZF藻株细胞内花生四烯酸含量，结果表明，诱导处理后藻细胞花生四烯酸含量为藻细胞干重的1.98-2.03%，分别是对照组藻细胞的3.44-3.53 倍。
【具体实施方式】
[0012]实施例1，采用以下步骤:
[0013]I)制备藻液:在23°C、光强19001x和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍BGll培养基培养普通小球藻ZF藻株细胞28天至对数生长期，获得用于植物生长调节剂诱导的藻液，培养期间每14天加一次I倍浓度的BGll营养盐；
[0014]2)积累花生四烯酸:取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入北京索莱宝科技有限公司生产的植物生长调节剂6-BA，使植物生长调节剂6-BA在藻液中的浓度为0.lmg/L，于23°C进行诱导处理14天，处理阶段每天人工摇藻不少于3次，相邻摇藻时间间隔不小于2小时，实现花生四烯酸在藻液中的积累。
[0015]实施例2，采用以下步骤:
[0016]I)制备藻液:在24°C、光强20001x和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍BGll培养基培养普通小球藻ZF藻株细胞28天至对数生长期，获得用于植物生长调节剂诱导的藻液，培养期间每14天加一次I倍浓度的BGll营养盐；
[0017]2)积累花生四烯酸:取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入北京索莱宝科技有限公司生产的植物生长调节剂6-BA，使植物生长调节剂6-BA在藻液中的浓度为0.095mg/L，于24°C进行诱导处理15天，处理阶段每天人工摇藻不少于3次，相邻摇藻时间间隔不小于2小时，实现花生四烯酸在藻液中的积累。
[0018]实验检测:
[0019]I)富集藻细胞:8000-9000rpm，4°C离心5-8分钟，得到澡泥，再将藻泥在_40°C冷冻干燥成藻粉。
[0020]2)提取油脂:利用索氏提取法对冷冻干燥后的藻粉进行提取，即得油脂。
[0021]3)对油脂甲酯化:首先向提取到的总油脂中加入3ml 0.4mol/L KOH/甲醇，60°C水浴Ih ;甲冷却后加入14% BF3 -CH3OH溶液3ml，60°C水浴Ih ;再冷却后加入20 μ L 1mg/mL十九酸酯，Iml正己烷(色谱纯)和Iml饱和NaCl，加入无水硫酸钠后静置分层，Iml注射器抽取上层有机相，过滤后保存于1.5mL EP中。
[0022]4)花生四烯酸含量分析:采用气象色谱分析，色谱柱为HP-FFAP抗氧化交联石英毛细管柱，规格为30mX0.25mmX0.3m;进样口温度为260°C，分流比为50: I ;载气为高纯N2,柱流量为lmL/min，总流量55mL/min，压力114Kpa，线速度29.6cm/s，柱温由160°C以2 0C /min的速度升至230 °C，保持3min至出峰完毕；FID检测器，温度为230 °C，进样量luL，得到气象色谱图。计算结果为:实施例1所得花生四烯酸含量为藻细胞干重的1.98%，是对照组藻细胞的3.44倍，实施例2所得花生四烯酸含量为藻细胞干重的的2.03%，是对照组藻细胞的3.53倍。
【主权项】
1.一种普通小球藻ZF藻株高效积累花生四烯酸的方法，其特征在于采用如下步骤: 1)制备藻液:在23°C±2°C、光强1900±1001x和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍BGll培养基培养普通小球藻ZF藻株细胞28天至对数生长期，获得用于植物生长调节剂诱导的藻液，培养期间每14天加一次I倍浓度的BGll营养盐； 2)积累花生四烯酸:取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入植物生长调节剂6-BA，植物生长调节剂6-BA在藻液中的浓度为0.1±0.005mg/L，于230C ±2°C进行诱导处理14± I天，处理阶段每天人工摇藻不少于3次，相邻摇藻时间间隔不小于2小时，实现花生四烯酸在藻液中的积累。
【专利摘要】本发明提供一种诱导普通小球藻ZF藻株高效积累花生四烯酸的方法，其特征在于采用如下步骤：1)制备藻液：在23℃±2℃、光强1900±100lx和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍BG11培养基培养普通小球藻ZF藻株细胞28天至对数生长期，获得用于植物生长调节剂诱导的藻液，培养期间每14天加一次1倍浓度的BG11营养盐；2)积累花生四烯酸：取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入植物生长调节剂6-BA，植物生长调节剂6-BA在藻液中的浓度为0.1±0.005mg/L，于23℃±2℃进行诱导处理14±1天，处理阶段每天人工摇藻不少于3次，相邻摇藻时间间隔不小于2小时，实现花生四烯酸在藻液中的积累。本发明简单易行、成本低廉，能在短期内显著积累花生四烯酸含量。
【IPC分类】C12R1/89, C12P7/64
【公开号】CN105132483
【申请号】CN201510609476
【发明人】高政权, 李国强, 孟春晓, 吴冠勋, 郭艳芸, 付圣贵, 邓素贞, 沈义成, 胡硕, 孙海风, 张瑞豪, 陈国强
【申请人】山东理工大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月23日