一种青霉生产(s)-羟甲氧苯丙酸甲酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到青霉菌细胞生物催化制备手性医药中 间体（S)-3-羟基-3- (4-甲氧基苯基）丙酸甲酯的技术。
【背景技术】
[0002] 手性（S)-3_羟基-3- (4-甲氧基苯基）丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、 农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择 性高等优点，作为绿色高效制备手性化合物的优先途径，被越来越多地应用于生产一些高 附加值的手性化合物。生物催化制备手性（S)-3_羟基-3- (4-甲氧基苯基)丙酸甲酯具有 很好的应用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点，是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物 催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中，水解酶能够催化动力学拆 分外消旋体得到手性产品，在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来，氧化还原 酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前，采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物 氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。
[0004] 生物还原法相对于动力学拆分法而言，最大的优势在于理论收率可达100%，原子 经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与，一定程度上限制了其应用。由于 辅酶依赖性的缘故，生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂，实现体内辅酶循环再生的 同时免去了酶的分离纯化步骤。
[0005] (S)-3_羟基-3-(4_甲氧基苯基)丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品 的重要手性砌块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高 等严重缺陷，难于进行工业化生产。本发明将采用生物细胞催化制备（S) -3-羟基_3_( 4-甲 氧基苯基）丙酸甲酯。
【发明内容】
[0006] 本发明采用青霉菌细胞催化制备（S)-3_羟基-3- (4-甲氧基苯基）丙酸甲酯，反 应式如下：
3- (4-甲氧基-苯基)-3_氧代丙酸甲酯（1)经青霉菌催化反应，得到产物（S)-3-羟 基-3- (4-甲氧基苯基）丙酸甲酯（2)。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛 选，最终确定采用青霉菌作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量 率（ee%)均很高。
[0007] 许多青霉菌都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本 发明选用青霉菌菌株为ATCC204027，其催化反应效果最佳。
[0008] 由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型，而细胞本身所含有的辅酶量 可能较少，因此，进行氧化还原反应时，为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中 还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同， 效果差别很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳 的辅助底物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为：葡萄糖20-23g/L、麦芽糖32-35g/L、 异丙醇8-10%V/V(体积浓度）。
[0009] 由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。
[0010] 培养介质： 1、种子培养基成份为：酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，麦芽浸 膏25-30g，硫酸铵0. 5-0. 7g/L;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
[0011] 2、培养液成份：玉米浆（以干物质计）含量为35-45g/L，酵母浸膏8-10g/L，葡 萄糖18-22g/L，麦芽浸膏25-30g，硫酸铵0. 5-0. 7g/L，硫酸镁0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧钾 1. 8-2. 3g/L，碳酸钙 0.7g/L，硫酸亚铁 0.18g/L，硫酸锰 0.025g/L;pH5.0。
[0012] 2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
[0013] 青霉菌细胞制备。青霉菌经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养 液，121°C高压灭菌30分钟，冷却至23-24°C，将青霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为 10-11%，通气比为0.9-1￥/(￥分钟），23-24°(：培养35-40小时，用过滤式离心机离心得到 湿青霉菌细胞，用作生物催化反应催化剂。
[0014] 生物催化转化。底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.1，加入底 物3- (4-甲氧基-苯基）-3_氧代丙酸甲酯，使底物浓度为80-90g/L。其他成份：玉米 浆（以干物质计）含量为12-15g/L，山梨坦单月桂酸酯19-20g/L，葡萄糖20-23g/L、麦芽 糖32-35g/L、异丙醇8-10%V/V(体积浓度），121°C高压灭菌30分钟；冷却至32-33°C时， 加入湿青霉菌细胞使其浓度为71-74g/L，通气比为0. 12-0. 13V/ (V分钟），进行生物催化 反应，反应时间为62-65小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙 酯，得到产物（S)-3-羟基-3-(4-甲氧基苯基)丙酸甲酯，反应转化率98-99%，产品收率 96-97 %，对映体过量率98. 5-99 %。
[0015] 本发明所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化(反应温度、通气量、pH)、反 应介质选择和浓度优化，包括底物浓度、辅助底物组合、表面活性剂种类及浓度等。
[0016] 实施例1 种子培养基成份为：玉米浆（以干物质计）含量为35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡 萄糖20g/L，硫酸铵0. 5-0. 7g/L，硫酸镁0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧钾1. 8-2. 3g/L;配制固体培 养基时添加15g/L的琼脂粉。
[0017]玉米衆（以干物质计）含量为35-45g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖18-22 g/ L，麦芽浸膏25-30 g，硫酸铵0. 5-0. 7g/L，硫酸镁0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧钾1. 8-2. 3g/L，碳 酸钙 0.7 g/L，硫酸亚铁 0? 18 g/L，硫酸锰 0.025 g/L;pH 5.0。
[0018] 培养液成份为：玉米浆（以干物质计）含量为35-45g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡 萄糖18-22 g/L，麦芽浸膏25-30 g，硫酸铵0. 5-0. 7g/L，硫酸镁0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧钾 1. 8-2. 3g/L，碳酸钙 0.7 g/L，硫酸亚铁 0.18 g/L，硫酸锰 0.025 g/L;pH 5.0。
[0019] 湿青霉菌细胞制备过程如下：青霉菌ATCC204027经斜面、摇瓶培养，得到种子 液。1L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却至23°C，将青 霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为接种比例为10-11%，通气比为0. 9-1V/ (V分钟)， 23°C培养35-40小时，用过滤式离心机离心得到湿青霉菌细胞，用作生物催化反应催化剂。
[0020] 生物催化转化：0. 5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6. 1，加入 底物3- (4-甲氧基-苯基)-3_氧代丙酸甲酯，使其浓度为80g/L，玉米浆（以干物质计） 含量为12g/L，山梨坦单月桂酸酯19g/L，葡萄糖23g/L、麦芽糖32g/L、异丙醇8%V/V(体积 浓度），121°C高压灭菌30分钟；冷却至33°C时，加入湿青霉菌细胞使其浓度为71g/L，通气 比为0. 13V/ (V分钟)，进行生物催化反应，反应时间为62小时；反应结束后，滤出细胞，用 乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物（S)-3-羟基-3- (4-甲氧基苯基）丙酸甲 酯，反应转化率99%，产品收率97%，对映体过量率98. 5%。
[0021] 实施例2 种子培养基成份为：玉米浆（以干物质计）含量为35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡 萄糖20g/L，硫酸铵0. 5-0. 7g/L，硫酸镁0.