诱导普通小球藻zf藻株高效积累亚麻酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一种诱导普通小球藻ZF藻株高效积累亚麻酸的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]小球藻(Chlorella)是一种常见的水生单细胞藻类，是绿藻小球藻科中的一个重要属，生态分布广泛，在海水和淡水中均有分布，目前包括大约10个种。小球藻细胞内含有丰富的蛋白质(干重的50%)、必需氨基酸、多糖、脂类(脂肪酸积累的结果)、叶绿素、胡萝卜素、和维生素等等，在保健食品、水产养殖(饲料添加剂)、化妆品、医药等领域内应用广泛，国内外市场供不应求。与美国、日本、以色列等国家相比，我国的小球藻工业化大规模培养水平相对滞后。普通小球藻ZF藻株是一种球形单细胞淡水藻类，通常生长在富营养化的水体中，但在人工培养条件下能大量生长繁殖。营养盐(氮、磷等)、光照、pH值、温度、微量元素(铁、锰、砸等)、碳酸氢铵、等因素均能影响小球藻生长。
[0003]共轭亚麻酸(conjugaed linolenic acid简称CLN)指一类具有三个共轭双键的十八碳三烯酸，自然界中主要以植物种子油的形式存在于桐树、石榴籽、苦瓜籽等中。CLN由于双键位置的不同存在不同的位置异构体，如9，11，13 — CLN和8，10，12 — CLN等，每组异构体又因双键的几何构型存在不同的几何异构体，如c，c，c一CLN和c，c，t一CLN等。天然存在的主要是三种8，10，12 一 CLN异构体和四种9，11，13 — CLN异构体。CLN在发现初期并没有引起人们的重视，近年来随着其多种有益生理功能被证实，逐渐成为国内外学者研究的热点，被誉为“21世纪的新型营养因子”，CLN具有非常有益的生理活性，包括抗癌、降血脂、提高免疫力、减肥、降血糖、提高免疫力等。微藻是进行植物生长调节剂诱导的优良材料，其结构简单、生命周期短、光敏性强、代谢过程极易受环境影响，也容易被检测。
[0004]目前，国内外已经公开了一些提纯、制备亚麻酸的方法工艺的相关技术，大多数是针对一些提纯、制备等技术改良的。如东北林业大学公布了一种α-亚麻酸的生产方法(CN1344706A)，其特征在于以喜树脂肪酸乙酯为原料，经喜树脂肪酸乙酯一络合硝酸银一有机溶剂萃取一回收溶剂一洗涤得到α-亚麻酸。该发明属于植物种子油中α-亚麻酸的生产方法，特别是涉及一种采用硝酸银络合技术从喜树种子脂肪酸乙酯中纯化α-麻酸的方法。中国科学院山西煤炭化学研究所的侯相林等提供了一种超临界反应分离一体化生产α-亚麻酸的方法(CN1366064A)。该发明是采用富含亚麻酸的植物油在超临界二氧化碳相中以脂肪酶为催化剂催化水解，同时通过超临界萃取结合精馏柱分离的方法实现不同类脂肪酸的分离。该方法需使用高压反应器并涉及热力学的平衡等问题，操作不便，工艺条件要求较高。内蒙古金达威药业有限公司和厦门金达威集团股份有限公司提供了一种从猕猴桃中提取亚麻酸油的工艺方法(CN200910159368)，其特征在于:超临界CO2萃取工艺在萃取釜中进行，萃取温度为30°C -45°C、萃取压力为25?35Mpa ;该方法涉及萃取剂蒸馏工艺，条件要求较严格。南京大学公开了一种从藻类提取、制备、纯化γ-亚麻酸甲酯的工艺(CN1448383A)。其步骤:将藻粉加入夹带剂甲醇匀浆后，在20_50MPa，20_60°C下，使用CO2作为溶剂进行超临界萃取，浓缩后得到总脂类；将得到的总脂类溶解于12倍其体积的含氯乙酰5%的甲醇中，在氮气氛保护下80°C回流反应2小时后，冷却至室温，加入两倍体积的0.3%碳酸钠溶液，洗涤，离心取上层油层，浓缩得到总脂肪酸甲酯并回收甲醇，总甲酯在高真空度6-10Pa下，160°C分子蒸馏，收集馏出物；将所得的馏出物加入三倍体积的丙酮，依次在4°C，-10°C, _30°C下平衡结晶24小时，每次结晶后过滤去晶体，最后再次在-30°C下结晶24小时并过滤去析出物，浓缩回收丙酮后按脂肪酸甲酯(升):尿素(公斤):甲醇(公斤)=1:2-4: 8-10的比例加入尿素和甲醇，在氮气保护下80°C回流I小时，缓慢冷却至室温，放置24小时过滤去结晶，在零度环境下放置24小时后再次过滤去结晶，加入等体积水后，用两倍体积的石油醚萃取γ -亚麻酸甲酯，浓缩回收石油醚后重复尿素包合结晶过程，再加入等体积的水后，用两倍体积的石油醚萃取γ -亚麻酸甲酯，蒸馏回收石油醚，得γ-亚麻酸甲酯；将得到的γ-亚麻酸甲酯在高真空，100-150°C分级蒸馏，得到γ-亚麻酸甲酯纯品。该方法要求压力较高，涉及分子蒸馏等技术，技术型要求比较高，不便于操作。北京市北大科玛技术发展中心的胡德甫等提供了一种高纯度α —亚麻酸的制备方法(CN1317477A)，其特点是将亚麻油或紫苏子油溶于乙醇水溶液中皂化反应，得到混合脂肪酸，然后尿素包合，缓慢降温和蒸发浓缩，得到α —亚麻酸，再依次经酯化、柱层析分离得到纯度为95?99.9%的α —亚麻酸酯，最后经皂化反应，分子蒸馏即得到纯度为95?99.9%的无色α —亚麻酸。朱铁保等公开了一种提纯分离α —亚麻酸的方法(CN1235956A)，它包括在种籽中添加分离促进剂和抗氧化剂，在惰性气体气氛中，提取出脂肪，再经水解生成游离脂肪酸，在游离脂肪酸中添加表面活性剂、分离促进剂和抗氧化剂在氮气气氛中，进行三次分离，得到高浓度的α —亚麻酸；再在高浓度的α —亚麻酸中添加抗氧化剂并在氮气气氛中进行完全酯化，生成的酯进行纯化即得产品。如北京长城富邦生物工程有限公司提供一种以膜分离技术从植物油中提取α-亚麻酸的工艺方法(CN1414080A)，包括植物油原料前处理、分离、后处理及提纯。前处理的混合脂肪酸与分离促进剂、抗氧化活性剂、表面活性剂混匀获混合液，混合液在I冷下膜过滤器分离获I液，I液在II冷膜过滤器分离获II液，II液在III冷下膜过滤器分离获III液，III液在IV冷下膜过滤器分离获IV液，完成分离。IV液加热获脂肪酸，脂肪酸膜过滤器分离提纯、多极分子筛蒸馏提纯完成后处理及提纯。经前处理、分离、后处理及提纯，获十八碳不饱和脂肪酸广品。上述相关提纯、制备D亚麻酸的方法工艺的相关专利技术虽然先进，但均未涉及植物生长调节剂诱导普通小球藻积累亚麻酸的内容，且技术工艺相对复杂，且费用高，这无疑增加了生产成本和技术推广的难度。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种操作简单、速度快、造价低、无污染的通过诱导小球藻ZF藻株高效积累