快速有效分离循环癌细胞的方法和试剂的制作方法

专利名称：快速有效分离循环癌细胞的方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤学和诊断测定。本发明用于癌症筛选、分期、监测化疗治疗反应、癌症复发等。更具体地说，本发明提供有利于分析和计数从生物学样品分离的肿瘤细胞或其它罕见细胞的试剂、方法和检测试剂盒。本发明还提供评价肿瘤相关分子(例如核酸、蛋白质和糖类)的材料和方法，由此帮助临床医师设计治疗性治疗策略。
背景技术：
每年美国诊出约600,000例癌症新病例；美国国内每五个人中就有一个人死于癌症或与其治疗有关的并发症。人们不断地进行大量努力，改善对癌症的治疗和诊断。
大多数癌症患者并不是死于原发性肿瘤。他们死于转移恶性细胞从原始肿瘤分离并在身体内移动、通常移动到远程位点并建立的许多广泛分布的肿瘤集落。假如在早期检测到原发性肿瘤，可以通过手术、放射或化疗或这些治疗的联合应用而除去原发性肿瘤。不幸的是，转移的集落通常更难以检测和除去，而且成功地治疗所有转移集落常常是不可能的。因此，从临床的观点看，可以认为转移是癌症自然发展中的死亡前过程。此外，转移能力是唯一定义恶性肿瘤的特性。
癌症转移包括一系列复杂的连续事件。这些事件有1)从原发性位置扩散到周围组织；2)渗透进体腔和脉管；3)释放肿瘤细胞，通过循环系统转运到远程位点；4)在停止位点再次侵入组织；然后5)适应新环境，促进肿瘤细胞存活、形成血管和肿瘤生长。
根据癌症和癌症转移的复杂性以及多年来治疗癌症患者的困难，人们已经进行许多努力，发展指导治疗并监测所述治疗对于转移或复发的效应的诊断检测。所述检测可能也可用于癌症筛选，取代例如针对乳腺癌的乳房X线摄影术或针对前列腺癌的数字直肠检查等相对粗糙的检测。为达到该目标，在过去20年中已经发展出多种检测。最早的努力之一是设置针对癌胚抗原[CEA]的免疫测定。该抗原在胚胎细胞上出现，在某些癌症的肿瘤细胞表面重新出现。人们已经进行大量努力，评价针对CEA和许多其它肿瘤抗原的检测的实用性，所述肿瘤抗原例如PSA、CA15.3、CA125、PSMA和CA27.29。然而，所述抗原在血液中的出现通常不是预测性的，并且在患者几乎没有治疗希望时才能检测到所述抗原在血液中的出现。然而，在过去几年中，已经证明一种检测在癌症的早期检测中是有用的，这种检测就是针对前列腺癌的前列腺特异性抗原[PSA]。当PSA检测与随访身体检查和活组织检查联合应用时，该检测在早期检测前列腺癌中起重要作用，而此时是治疗的最佳时机。
虽然PSA检测是成功的，但该检测还有许多需要改进的地方。例如，高水平的PSA并非常常与癌症相关，它们看起来也不是肿瘤转移潜力的指标。部分原因可能是因为PSA正常前列腺组织的成分，以及其它未知因素。此外，研究逐渐表明很大比例的前列腺患者将继续患有不威胁生命的局限化疾病。为了在患有会转移的癌症的患者和患有不会转移的癌症的患者之间获得更好的一致性，人们尝试确定前列腺细胞是否存在于循环当中。循环肿瘤细胞的存在配合高PSA水平和活组织检查，可以指导应当如何有力地治疗患者。
确定循环前列腺肿瘤细胞的存在的一种方法是测定编码PSA的信使RNA在血液中的表达。这可以如下完成对血液样品进行繁重的密度分离程序，分离单核细胞，然后从这些细胞分离所有mRNA，进行针对PSA的反转录酶PCR。目前为止，(Gomella LG.J.of Urology.158326-337(1997))所述细胞在血液中的存在与预测哪些患者需要有力的治疗之间没有良好的相关关系。值得注意的是PCR即使在大多数情况下并非不可能，但也难以定量进行，即难以确定每单位体积血液样品中肿瘤细胞的数目。此外，使用该技术常常观察到假阳性。另一个缺点是根据所检查的样品大小，该技术的灵敏度存在有限和实用的限制。一般地说，排除红细胞的干扰，从纯化出的105到106个细胞上进行该测试。这对应于灵敏度应用下限为一个肿瘤细胞/0.1ml血液。因此，假如要检测到信号，每ml血液中必需存在约10个肿瘤细胞。就进一步的考虑而言，肿瘤细胞通常在遗传上是不稳定的。因此，PCR测定中可能错过具有遗传重排和序列变化的癌症细胞，因为可能丧失PCR引物和靶序列之间的序列互补性。
总体来说，有用的诊断检测应该非常灵敏，并且能够可靠地定量。假如可以发展出能够在1ml血液中检查出一个肿瘤细胞的存在的血液检测，这就对应于平均在循环中总共存在3000-4000个细胞。在动物体内建立肿瘤的研究显示注射3000-4000个细胞确实能够导致建立肿瘤。此外，假如3000-4000个循环的细胞代表肿瘤中总细胞的0.01％，那么该肿瘤将总共包含约4×107个细胞。而目前使用的任何技术都不能检测到包含这样数量细胞的肿瘤。因此，假如肿瘤细胞在癌症早期阶段流出，则具有上述灵敏度的检测将检测到癌症。假如肿瘤细胞流出与肿瘤大小有某种功能上的关系，那么定量检测将有利于评价肿瘤负荷。在此以前，还没有关于循环肿瘤细胞在非常早期的癌症中存在的信息。另外，在医学文献中对于所述细胞的存在以及所述信息的潜力有相当多的疑问。一般的观点是肿瘤开始时受到很好的限制，因此假如在疾病早期存在任何循环细胞，那也是非常少的。另外，人们还怀疑在早期检测癌症细胞的能力可以提供有用的信息。
如上面所述，明显的是非常需要在建立继发性肿瘤之前鉴定循环中具有转移潜力的细胞的方法，尤其是在癌症早期鉴定所述细胞。为理解所述检测优于常规免疫测定的好处，考虑具有10-7摩尔功能灵敏度下限的高度灵敏的免疫测定。假如能够从1ml血液中捕获一个肿瘤细胞并进行分析，假设每个细胞有100,000个受体，那么表面受体的摩尔数就是10-19摩尔。由于在一个细胞上可以检测到约300个分子，所述测定将具有约10-22摩尔的功能灵敏度，这是相当可观的。为在分离所述罕见细胞时达到该灵敏度水平，并以不损害或干扰它们的特征的方式分离它们，这是艰难的任务。
许多实验室和临床程序使用从生物学样品中分离罕见细胞的生物特异性亲和反应。所述反应在诊断检测中普遍应用，或用于分离广泛范围的靶物质，特别是生物学实体如细胞、蛋白质、细菌、病毒、核酸序列等等。
根据目标物质与上述靶物质所特异性结合的另一种物质之间形成的复杂结构，可以利用分析或分离上述靶物质的各种方法。从未结合的材料分离复合物可以如下完成通过重力，如通过沉降，或者用另一种方法，通过离心偶联所述靶物质的细微分离的颗粒或珠。如果需要，所述颗粒或珠可以具有磁性，以方便结合/游离分离步骤。磁性颗粒以及他们在免疫和其它生物特异性亲和反应中的应用是本领域内众所周知的。见例如美国专利第4,554,088号和Immunoassaysfor Clinical Chemistry，第147-162页，Hunter等编辑，ChurchillLivingston，Edinburgh(1983)。一般地说，为该目的可以使用便利磁性分离或重力分离的任何材料。然而，磁性分离方法明显是可选方法之一。
磁性颗粒可以根据大小分类大(1.5到约50微米)、小(0.7-1.5微米)或胶体(＜200nm)，胶体颗粒也称为纳米颗粒。第三种磁性颗粒也称为铁磁流体或铁磁流体样材料，具有传统铁磁流体的许多特点，在本文中有时称为胶体的超顺磁颗粒。
上述类型的小磁颗粒在涉及生物特异性亲和反应的分析中相当有用，因为可以用生物功能聚合物(如蛋白质)方便地包被它们，提供相当大的表面面积，给出合理的反应动力学。在专利文献中已经描述从0.7-1.5微米范围的磁性颗粒，所述专利文献包括，例如，美国专利第3,970,518号、第4,018,886号、第4,230,685号、第4,267,234号、第4,452,773号、第4,554,088号和第4,659,678号。根据公开，这些颗粒中的某一些可以用作免疫试剂的固体支持物。
使用磁分离可以达到的效率和磁标记细胞的回收率和纯度将取决于多个因素。这些因素包括●分离细胞的数量，●所述细胞的受体或表位密度，●每个细胞的磁载量，●所述磁材料的非特异性结合(NSB)，●遗留的捕获非靶细胞，●所使用的技术，●容器的性质，●容器表面的性质，●介质的粘度，和●所使用的磁分离设备。
假如系统非特异性结合的水平属于通常情况，即在实质上是恒定的，那么随着靶群体减少，纯度也降低。
例如，一个系统的NSB为0.8％，回收80％的一个群体，该群体在原始混合物中含量为0.25％，那么该系统将获得25％的纯度。然而，假如起始群体含量是0.01％(在106个旁观者细胞中有一个靶细胞)，NSB是0.001％，那么纯度将是8％。因此，标本混合物中靶材料的高纯度将导致对靶材料更特异性和更有效的收集。极度低的非特异性结合对于便利罕见细胞的检测和分析是必需或有利的，所述罕见细胞是例如在循环中存在的来自上皮的肿瘤细胞。
较不明显的是靶细胞的群体越小，对其进行磁标记和回收就越困难。此外，标记和回收将明显依赖于所使用的磁性颗粒的性质。例如，当细胞与大磁颗粒如Dynal珠温育时，通过混合系统产生的碰撞来标记细胞，因为所述珠太大，无法有效扩散。因此，假如细胞群体存在的频率是每ml血液中有1个细胞或更低，例如非常早期的癌症中肿瘤细胞的情况，那么标记靶细胞的概率将与加入系统的磁颗粒的数量以及混合时间的长度有关。由于使细胞与所述颗粒混合相当长的时间可能是有害的，因此有必要尽可能增加颗粒浓度。然而，对于加入磁性颗粒的数量有限制，因为在分离时可以用与其它血细胞混合的罕见细胞取代与大量磁性颗粒混合的罕见细胞。后一种情况并不显著改善计数目的细胞或检查它们的能力。
根据前面所述，使用高磁性、低非特异性结合、胶体磁颗粒的外场设备所进行的高梯度磁分离是从真核细胞的混合群体分离目的细胞亚组的精选方法，特别是假如所述目的亚组仅包括一小部分完整群体。由于所述材料的扩散特性，它们能够容易地找到并磁性标记罕见事件，例如血液中的肿瘤细胞。为成功地进行用于肿瘤细胞分析的磁分离，所述磁颗粒必须对于不存在于造血细胞上的表位具有特异性。
发明简述一旦鉴定出循环中的肿瘤细胞，就需要进一步在表型或生化上表征所分离的细胞。因此，可以分析具体的肿瘤性相关分子，例如与恶性表型相关的核酸分子、蛋白质或糖类。具体地说，提供测量鉴定的循环肿瘤细胞内或表面存在的预定肿瘤性相关分子表达水平的方法，以帮助临床医师诊断癌症类型和评价化疗干预策略的功效。
在本发明的优选实施方案中，提供评价患者体内是否存在恶性肿瘤的方法。该方法包括从患者获取生物标本，所述标本包括怀疑包含造血和非造血恶性细胞的混合细胞群体。然后制备样品，其中所述生物标本与可检测水平标记的配体混合，所述配体与所述恶性细胞特异性反应，基本排除其它样品成分。使所述样品与至少一种也特异性标记所述恶性细胞的试剂接触。然后分析所述样品，确定标记细胞的存在和数目，检测出所述细胞指示存在恶性肿瘤，标记细胞存在的数目越大，恶性肿瘤就越严重。所述方法还包括评价所述标记细胞至少一种肿瘤性相关分子的改变。因此，在一个实施方案中，该评价包括使所述分子与具有结合亲和力的试剂接触，所述试剂受到标记以使其可被检测。肿瘤性相关分子可以是蛋白质、核酸或糖类，并可以使用常规方法进行评价。
在该方法的一方面，通过选自以下的方法分析恶性细胞多参数流式细胞术、免疫萤光显微术、激光扫描细胞术、亮视野基础图像分析(bright field base image analysis)、毛细管容量分析、光谱成像分析手动细胞分析、Cell Spotter分析、Cell Track分析和自动化细胞分析。
本发明的方法可用于在药物治疗、放射或手术治疗根除肿瘤后评价循环中的残余癌细胞。也可在几年时间内定期进行所述方法，评价患者体内循环中肿瘤细胞的存在和数目以及患者体内肿瘤性相关分子的改变，以作为疾病发生、复发和/或发展的指标。
在本发明的再一方面，提供测定肿瘤性相关分子改变的方法，作为预测治疗功效的手段。示例性的方法包括从患者获取样品；从所述样品分离和计数循环中的恶性细胞，如果存在恶性细胞，然后测定所述样品中各个细胞表面存在的至少一种预定肿瘤性相关分子的数目，作为预测治疗功效的手段。所述方法也非常适合用于评价给定治疗疗法的合适剂量和/或用于监测治疗功效随时间的变化。因此，本发明的方法在简单血液检测的基础上提供“整体”活组织检查。
在本发明的又一方面，提供培养从循环中分离的肿瘤细胞的方法。然后使所述细胞与治疗药物接触，以评价它们的灵敏度。所述细胞也提供改变或未改变肿瘤性相关分子的来源。因此，本发明也包括从循环中分离的肿瘤细胞或其培养物。
在本发明的优选方面，公开从本发明的分离的循环肿瘤细胞获得的肿瘤疫苗。所述肿瘤疫苗可以包括循环中的肿瘤细胞、其碎片或纯化的肿瘤性相关分子。
在本发明的另一方面，提供鉴定循环肿瘤细胞相对于原位肿瘤体获取细胞的改变的方法。示例性的方法包括从患者肿瘤获取活组织检查标本，并从所述患者分离循环肿瘤细胞(如果存在)。然后使所述标本和所述分离的循环肿瘤细胞与检测多种肿瘤性相关分子的两组相同试剂接触，可选地所述试剂受到标记以使其可被检测。然后分析所述循环肿瘤细胞和所述肿瘤标本中存在的所有肿瘤性相关分子，确定在所述循环肿瘤细胞中所述肿瘤性相关分子是否相对于所述活组织检查标本中所述分子发生改变。
在本发明又一方面，提供筛选患者样品中非造血恶性细胞的存在的试剂盒。本发明示例性的试剂盒包括受到包被的磁性纳米颗粒，所述纳米颗粒包括i)磁性核心材料，蛋白质基质包被材料(protein basecoating material)以及特异性结合所述恶性细胞第一种特征性决定簇的抗体，所述抗体直接或间接与所述碱性包被材料偶联；ii)对于所述恶性细胞的第二种特征决定簇有结合特异性的至少一种抗体；iii)根据分析排除所述恶性细胞以外的样品成分的细胞特异性染料；iv)选自Cell Spotter柱或Cell Tracks柱的设备；以及至少一种对肿瘤性相关分子有结合亲和力的试剂，所述试剂受到标记以使其可被检测。所述试剂盒可以可选地包含对非靶细胞具有结合亲和力的抗体、生物学缓冲液、渗透缓冲液、实验方案，并且可选地包括信息资料。
附图简述

图1示意图，显示本发明样品制备方法的步骤。
图2A-D显示本发明CellSpotterChamber的各个方面。图2A包含两个叉形有角磁铁的室和支持物；图2B计算机模拟随机置于由两个叉形有角磁铁产生的磁场中的磁性纳米颗粒标记的细胞的轨迹(用虚线表示)。图2C在如图2B所示磁铁之间的CellSpotter室内，细胞轨迹的闭合。图2D所述室表面的俯视图。水平线是与铁磁流体场线平行的磁性纳米颗粒。
图3A-3D是一系列显微图，显示在CellSpotter室内一个框的萤光图，所述CellSpotter室从血液样品取出，所述血液样品从乳腺癌患者得到。图3A Dapi图显示从内部对照、白细胞和肿瘤细胞得到的核。图3B DiOC16图显示5个对照细胞的萤光。图3C CK-PE图显示5个对照细胞和两个候选肿瘤细胞的萤光，其中一个染色明亮，一个染色模糊。图3D CD45-APC显示白细胞的萤光，并显示对照细胞没有染色，显示模糊PE染色的盒显示APC染色，另一个盒显示没有APC染色，证实它包含一个CTC。
图4显示肿瘤细胞候选物的分类。六行小图代表从乳腺癌患者样品得到的肿瘤细胞候选物。经检查，行201、202和204指示有肿瘤细胞存在。在Composite下方的小图是DAPI复合物(紫色)和CK-PE染色。L-APC＝用CD45APC染色的白细胞，CNTL＝用DiOC16染色的对照细胞，EC-PE＝用细胞角蛋白-PE染色的上皮细胞，NADYE＝用DAPI染色的核酸。
图5显示模型实验的结果，在所述模型实验中将已知数量的肿瘤细胞掺入外周血，在免疫磁性选择后取回，然后用显微镜(图A)或流式细胞术(图B)进行分析。
图6显示对细胞悬浮液的流式细胞术分析，所述细胞悬浮液从患有乳腺癌的远程转移的患者的10ml血经过免疫磁性细胞选择后获得，其中在该患者进入研究48、175和300天后取血。所述细胞经过免疫磁性选择后，用偶联上皮细胞特异性藻红蛋白(PE)的单克隆抗体、偶联白细胞特异性CD45PerCP的单克隆抗体以及核酸染料进行染色。将核酸染料阈值以上的事件捕获转化为列表形式数据(listmode)，并分析85％的样品。肿瘤细胞加重显示，用黑色表示，它们的数字显示在右上角；背景事件包括残余的白细胞和残渣，用灰色表示。
图7A-H显示患有活动的乳腺癌的八名患者在不同时间点在10ml血液中的上皮细胞数目以及疾病的临床活性。疾病的临床活性按类1到类4分类，如表IV所示。在顶端的条代表化疗时间长度。图A，阿霉素(ADR)，分别是90mg/m2和110mg/m2，图B，ADR 30mg/m2/周，Vinorelbine(Vin)20mg/m2/周，ADR 160mg，ADR 20mg/m2/周，图C，长春花新碱(Vinc)0.7mg/m2/周，氨甲蝶呤(MTX)30mg/m2/周，图D，长春花碱(Vinb)7mg/m2/周，ADR 20mg/m2/周，Vinb 6mg/m2/周，5-氟尿嘧啶(5FU)700mg/m2/周。图E，Vin 20mg/m2/周；5FU 800mg/m2/周+Leukovorin 50mg/m2/周。图F，异环磷酰胺(IF)18mg/m2/周；5FU 850mg/m2/周+Leukovorin 35mg/m2/周，5FU 605mg/m2/周；Vin 20mg/m2/周+Leukovorin 30mg/m2/周。图G，Vin 20mg/m2/周，图H，Vin 20mg/m2/周。
图8A-8D是一系列显微图，显示从有乳腺癌病史的患者的外周血获得的免疫磁性选择细胞在下面分析中的结果。图A，从一名接受手术后三年的患者获得的细胞(T2N1M0)对细胞角蛋白染色显示阳性。图B，从一名接受手术后八年的患者获得的细胞(T2N1M1)完全不被Wright Giemsa染色。图C和D，从一名接受手术后2年的患者获得的细胞(T2N0M0)受到Wright Giemsa染色。用装有100X物镜的Pixera数码相机拍摄照片。
图9A-9C是一系列的图，显示三名患有前列腺癌的患者中，疾病严重性与循环的上皮细胞数目之间的相关关系。
图10A-10H显示在8名CAP患者的血液中以0、1、2、7、12、17和25周间隔测量到的CTC和PSA水平。该时间段内，在患者样品(A-D)中没有观察到疾病临床活动的显著改变。然而，在患者样品(E-H)中疾病活性增加。在图10E的患者样品中，CTC计数与PSA水平的相关系数R是0.42；在图10F的患者样品中，相关系数是0.87；在图10G的患者样品中，相关系数是0.65；在图10H的患者样品中，相关系数是0.98。各图顶上的条指示所接受的激素处理。在图10B的患者样品中，CTC计数决不会升到对照组的置信水平99％以上。
图11A和11B是一对图，显示在2名CAP患者的血液中以0、1、2、7、12、17和25周间隔测量到的CTC数目和PSA水平。顶上的条指出所接受的激素处理。两名患者都接受化疗；所给予的药物和给药时间用箭头在图底部指出。
图12是一个图，显示结肠癌患者体内的循环上皮细胞数目在手术移除肿瘤后显著降低。
图13是一个图，显示结肠癌转移疾病患者体内循环上皮细胞数目随着转移疾病的严重性和程度的增加而增加。
图14是一个示意图，显示从原发性肿瘤到转移生长的癌症进程。
图15A-15D是四个散点图，显示流式细胞术分析测定的血液中CTC和HER-2+-CTC的水平。用EpCAM铁磁流体的多参数流式细胞术分析从乳腺癌患者的5ml血中选择出的细胞。白细胞和珠用小黑点表示，它们的位置在图上标明。灰点代表碎片。CTC是大黑点，用于鉴定CTC的标准用每个图的区指出。在细胞角蛋白对HER-2的相关图中，细胞表达HER-2的上界用虚线标出。
图16A-D是柱状和散点图，显示3名乳腺癌患者的细胞系以及CTC表面HER-2密度的量化。图16A，白细胞的HER-2表达，从5ml血液免疫磁性选出并根据CD45和细胞角蛋白表达选择的PC3细胞和SKBR-3细胞。根据PC3和SKBR-3细胞表面HER-2表达的定量评价，将HER-2的表达水平分为四类(-，+，++，+++)。(-)没有表达到表达5000个受体以下(WBC)，(+)表达5,000到50,000个受体之间(PC-3)，(++)表达50,000到500,000个受体之间和(+++)表达超过500,000个受体(SKBR-3)。图16B、16C和16D显示三名乳腺癌患者(2、20和25来自表XII)CTC表面细胞角蛋白和HER-2的表达。在图中仅显示CTC。
图17A-17C是一系列图，显示在疾病进程中获得HER-2的过量表达。三名乳腺癌患者治疗期间的CTC，HER-2-CTC在基线，所述患者的疾病在随访期间发展。柱状物指出每个时间点CTC的总数目。在每个柱状物内，表达不同水平HER-2的CTC数目用下面符号表示 HER-2-， HER-2+， HER-2++ HER-2+++图顶端指出治疗天数和治疗类型。每日摄取在图17C中显示的醋酸甲地孕酮。处理前CTC表面不表达HER-2。随着CTC数目增加，在所有三名患者体内清楚地检测到CTC表型的改变，有代表性的是转化为HER-2阳性。患者数目参见表XII。
图18A-18C是一系列图，显示在疾病进程中表达HER-2+CTC的患者体内CTC表面HER-2密度的波动。三名乳腺癌患者治疗期间的CTC，HER-2+CTC在基线，所述患者的疾病在随访期间发展。其它指标如图17。每日摄取在图18B中显示的依西美坦。部分CTC在整个治疗过程中都表达HER-2。在患者23和25的治疗过程中，CTC在实质上增加。
图19A-19C是一系列图，显示患有稳定疾病的患者体内CTC表面HER-2密度的波动。三名乳腺癌患者治疗期间的CTC，HER-2+CTC在基线，所述患者的疾病在治疗期间保持在临床上稳定。其它指标如图17。每日摄取阿那曲唑(图19B)。顶图中患者体内CTC在治疗进程中增加，而两个底图中患者体内CTC减少。
图20是一个示例性的方法纲要，该方法用于实施本发明的方法。
发明详述根据优选实施方案，本发明提供从生物学样品快速有效分离罕见靶生物实体的组合物、方法和试剂盒。所述方法可有效用于分离和表征在血液样品中存在的肿瘤细胞，同时最小化选择非特异性结合或捕获的细胞。
癌症分期系统在解剖学上描述了癌症如何扩散，并试图将处于相似预后和治疗的患者归于同一分期组。分期的概念可应用于除大多数白血病形式外的几乎所有癌症。由于白血病涉及全部血液，它们在解剖学上不象其它癌症一样局部化，因此分期的概念通常不应用于这种类型的癌症。几种新形式的白血病确实有分期系统，该系统反应疾病进行的各种量度。对于大多数实体瘤，有两种相关的癌症分期系统，即总体分期分组(Overall Stage Grouping)和TNM系统。
在总体分期分组(罗马数字分期)系统中，将病例分类到用罗马数字I到IV命名的四个期，或者分类为“复发”。一般地说，I期或早期癌症是通常可治愈的小的局部癌症，而IV通常代表无法进行手术的癌症或癌症转移。II期和III期癌症发展通常限于局部和/或累积局部淋巴结。实际上，上述分期是精确定义的，但每种癌症的定义是不同的。此外，重要的是认识到给定期的预后也依赖于癌症类型，因此II期非小细胞肺癌与II期子宫颈癌有不同的预后。
如以前所提到的，在已经移除原发性肿瘤几个月或多年后癌症常常复发，因为在发现原发性肿瘤时癌症细胞已经脱离并进入远程位点，但当时未形成大得足以被检测出来的肿瘤。有时最初的手术后留下一小块原发性肿瘤，该小快肿瘤随后生长成肉眼可见的肿瘤。在根除所有可见肿瘤后复发的癌症称为复发疾病。在原发性肿瘤的区域复发的疾病是局部复发，而作为转移复发的疾病称为远程复发。远程复发一般与IV期疾病接受类似治疗(有时这两个术语可以互换使用)。根据肿瘤类型，局部复发的意义可能与远程复发大不相同。
对于实体瘤，实际上采用称为“TNM”系统的更详细的分期系统定义I-IV期。在该系统中，TMN代表肿瘤、淋巴结和转移。每个部分分别归类，用数字定义，给出总的分期。因此，T1N1M0癌症表示患者有T1肿瘤、N1淋巴结累积和没有转移。当然，T、N和M的定义对于每种癌症是特异性的，但有可能广义地定义它们的意义。
T肿瘤-分类原发性肿瘤的程度，一般用T0到T4表示。T0表示肿瘤甚至还未开始侵袭局部组织。这称为“原位”。另一方面，T4表示可以已经通过直接扩散侵袭其它器官的大的原发性肿瘤，通常无法进行手术。
N淋巴结-分类区域淋巴结累积的数量。重要的是知道在该分类中仅考虑引流原发性肿瘤区域的淋巴结。累及远程淋巴结被认为是转移性肿瘤，定义哪些淋巴结属于区域性淋巴结取决于肿瘤类型。N0表示没有淋巴结累积，N4表示广泛累及。一般地说，更广泛的淋巴结累及表示更多受累淋巴结的某种组合，受累淋巴结范围愈大，则会累积更远程的(但仍然是区域性的)淋巴结。
M转移-M或者是M0，即没有转移，或者是M1，即有转移。至于总体分期系统，每种不同肿瘤类型对T和N的准确定义是不同的。
大多数肿瘤学家TMN系统比I到IV的系统更精确，因为该系统提供更精确的分类。然而，这两种系统实际上是相关的。I到IV的分组实际上是用TMN系统定义的。例如，II期非小细胞肺癌指T1或T2原发性肿瘤，N1淋巴结累积，没有转移(M0)。
许多临床医师相信癌症在其早期是局限于器官的疾病。根据本文提出的数据，看起来这种概念是不正确的。事实上，数据显示癌症在用目前可利用的方法第一次检测到时常常是系统性的疾病。因此，可以使用肿瘤细胞在循环中的存在来筛选癌症，以取代其它检测或与其它检测结合使用，所述检测例如乳房X射线摄影术或测量PSA。通过使用靶向靶细胞上或靶细胞内相关标记的合适单克隆抗体，或通过使用针对细胞蛋白质表达的其它测定，或通过分析细胞mRNA，可以容易地确定这些细胞的器官起源，例如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌或其它非造血癌症。因此，假如在实质上没有肿瘤的临床征象，但可以检测癌症细胞，那就有可能鉴定它们的存在以及起源器官。因为可以使用本文所述的本发明的相对简单的血液检测完成筛选，所述血液检测有高度灵敏度和特异性，所以可以认为所述检测是“整体活组织检查”。此外，根据本文陈述的数据，应当认为肿瘤是血液运载性疾病，其特征是存在可能非常有害的转移细胞，并因此可以相应进行治疗。假如完全没有检测到循环肿瘤细胞的证据(例如在手术后)，则有可能根据进一步的临床研究确定是否需要继续治疗，如放射治疗、激素治疗或化疗。预测患者对所述治疗是否需要或其功效、给出所述治疗的费用是重要并且有利的临床信息。
根据本发明的数据，清楚的是循环中的肿瘤细胞数目与疾病进展阶段(从疾病开始到疾病的最后阶段)相关。
本文所用的术语“靶生物实体”指多种有生物学意义或医疗意义的材料，并且可以与标本中存在的“非靶”材料区分开来。例子包括激素、蛋白质、肽、凝集素、寡核苷酸、药物、化学物质、核酸分子(如RNA和/或DNA)以及生物学来源的颗粒状分析物，所述颗粒状分析物包括生物学颗粒，例如细胞、病毒、细菌等。在本发明的优选实施方案中，可以使用本发明的组合物、方法和试剂盒，从非靶细胞和/或其它生物实体有效分离罕见细胞(例如母体循环中的胚胎细胞)或循环中的癌症细胞。
术语“生物标本”包括但不限于包含细胞的体液，包括但不限于外周血、组织匀浆、乳头吸出物、结肠灌洗液、痰、支气管灌洗液以及可以从人类个体获得的任何其它细胞来源。示例性的组织匀浆可以从乳腺癌患者的前哨淋巴结获得。术语“决定簇”在涉及任何上文所述的靶生物实体时，广义地指在通常引起免疫反应的大分子抗原上存在的化学嵌合体。决定簇也可以与“表位”互换使用。决定簇可以与生物特异性配体或生物特异性试剂特异性结合，并且指涉及、负责选择性结合特异性结合物质(例如配体或试剂)的靶生物实体的部分，其存在是发生选择性结合所需的。在基础术语中，决定簇在特异性结合配对反应中是靶生物实体上的分子接触区，该分子接触区受到对其有结合亲和性的试剂、配体和/或试剂的识别。
本文所用的术语“特异性结合配对”包括抗原-抗体相互作用、受体-激素相互作用、受体-配体相互作用、激动剂-拮抗剂相互作用、植物凝集素-糖类相互作用、核酸(RNA或DNA)杂交序列相互作用、Fc受体或鼠IgG-蛋白A相互作用、抗生物素蛋白-生物素相互作用、链霉抗生物素-生物素相互作用以及病毒-受体相互作用。“基因特异性探测”指这样的方法所述方法使用与肿瘤性相关分子互补的核酸分子检测所述肿瘤性相关分子的存在或缺失。可以标记所述核酸分子使其可被检测，或者不标记所述核酸分子。在实践本发明的方法的应用中，还设想有各种其它决定簇特异性结合物质的组合，所述组合对于本领域内技术人员将是显而易见的。词组“肿瘤素质/肿瘤性”在本文中指对恶性肿瘤固有的易感性或素因。对恶性肿瘤的易感性或素因可以是遗传的，或者由于导致调节异常的细胞增殖的体细胞突变产生。词组“肿瘤性相关分子”指细胞内或细胞外的分子，所述分子在细胞从正常表型发展到恶性表型时发生了生化改变或者异常表达。所述分子包括但不限于激素和激素调节蛋白、癌基因、肿瘤抑制蛋白、编程性细胞死亡相关分子、细胞周期及细胞增殖相关性分子、与恶性肿瘤相关的糖类分子、细胞骨架蛋白以及涉及维持细胞-细胞接触的蛋白。分析肿瘤性相关分子(包括蛋白质、核酸和糖类)的方法可见Current Protocols in Molecular Biology，F.MAusubel等编辑John Wiley & Sons，Inc.NY，NY(1999)。评价肿瘤性相关分子改变后的表达水平或改变后的分子结构为临床医师提供有价值的信息，帮助设计治疗和检测策略。
词组“恶性细胞”指这样的细胞所述细胞在生化上和/或化学上改变，以致丧失了对细胞增殖和/或定位的正常严谨控制。循环中通常不存在恶性细胞。
本文所用术语“抗体”包括免疫球蛋白、单克隆抗体或多克隆抗体、免疫反应性免疫球蛋白片段如F(ab)以及单链抗体(sfV)。本发明还设想应用肽、寡核苷酸或它们的组合，所述肽、寡核苷酸或它们的组合专一地识别决定簇，其特异性类似于用传统方法产生的抗体。如以前所提到的，互补核酸包括在“特异性结合配对”的意义范围内。术语“可检测标记”在本文中指任何这样的物质通过物理或化学方法，直接或间接检测或测量到所述物质表示在测试样品中存在靶生物实体。有用的可检测标记的有代表性的例子包括但不限于以下根据吸光度、萤光、反射率、光散射、磷光或发光特性可以直接或间接检测的分子或离子；根据放射性特性可以检测的分子或离子；根据核磁共振或顺磁特性可以检测的分子或离子。根据吸光度或萤光可以间接检测的分子包括转化合适底物的各种酶，例如所述酶将底物从非光吸收分子转化为光吸收分子，或者从非萤光分子转化为萤光分子。
词组“基本排除”指生物特异性配体或生物特异性试剂与其对应靶决定簇之间结合反应的特异性。生物特异性配体和试剂对它们的靶决定簇有特异性结合活性，但对其它样品成分也可以有低水平的非特异性结合。
词组“早期癌症”在本文中可以与“I期”或“II期”癌症互换使用，指那些已经在临床上被确认为局限于器官的癌症。该词组还包括太小而不能用常规方法检测出的肿瘤，所述常规方法例如针对乳腺癌患者的乳房X射线摄影术或针对肺癌患者的X射线。乳房X射线摄影术可以检测到约有2×108个细胞的肿瘤，而本发明的方法应当能够检测从大致该大小或比此更小的肿瘤释放出的循环癌细胞。
术语“富集”在本文中指明显增加处理过的分析样品中靶生物实体(如肿瘤细胞)与非靶材料的比例的方法，该比例相对于原始生物学样品中的比例增加。假如使用外周血作为起始材料，评价富集程度时不计数红细胞。使用本发明的方法，可以将循环中的上皮细胞富集到达到相对于白细胞至少2,500倍的程度，更优选5,000倍，最优选10,000倍。
词组“克隆扩增”在涉及分离循环肿瘤细胞时，指将分离的细胞在增殖细胞的条件下培养的方法。可以培养单细胞，使它们形成集落，然后扩增产生基本同质的癌症细胞的群体。可以使用所述细胞的部分或所述细胞本身产生肿瘤疫苗。词组“肿瘤疫苗”在本文中指含有肿瘤细胞特异性蛋白并且可以用于刺激免疫反应的试剂。疫苗可以包括病毒、小蛋白或全细胞。使用感染腺病毒相关载体的肿瘤细胞产生肿瘤疫苗的方法在美国专利6,171,597中公开。由循环的肿瘤细胞产生肿瘤疫苗的其它方法在美国专利5,993,829中公开。
在实施本发明的应用中，优选的磁性颗粒是胶体型颗粒。所述颗粒的特征在于亚微米颗粒大小(一般小于约200nm(0.20微米))以及它们从溶液中接受重力分离时稳定一段时间。除所述许多好处外，该大小范围使它们对于一般应用于细胞分析的分析技术是不可见的。在本发明中设想使用在90-150nm范围内并且具有70-90％磁物质的颗粒。合适的磁颗粒由超顺磁材料晶体核心以及外面围绕的分子组成，所述外围分子与所述磁核通过物理吸附或共价连接而结合，赋予稳定的胶体特性。所述包被材料应用的量最好应当有效预防所述样品内的生物大分子与所述磁核之间的非特异性相互作用。所述生物大分子可以包括糖类(如在非靶细胞表面的唾液酸残基)、植物凝集素、糖蛋白和其它膜组份。此外，所述材料在每纳米颗粒内应当包含尽可能多的磁物质。包含核心的所述磁晶体的大小足够小，以便它们不包含完整的磁畴。所述纳米颗粒的大小足够小，以便它们的布朗能量超过它们的磁矩。结果，由于这些胶体磁性颗粒的溶液稳定性，它们的北极线、南极线以及由此产生的相互吸引/排斥甚至在中等强度的磁场中似乎也不发生。最后，所述磁颗粒应当在高磁梯度外场分离器中可分离。该特征有利于样品处理，并且与更复杂的装有铁磁珠或钢丝的内梯度柱相比，提供经济上的好处。通过改变在美国专利第4,795,698号、第5,597,531号和第5,698,271号中描述的基础材料，可以制备具有上述特性的磁颗粒。用那些基础材料制备如下文所述。
恶性肿瘤的特征在于他们侵袭临近组织的能力。一般地说，直径1mm的肿瘤已经血管化，动物研究显示，所述肿瘤中多达4％的细胞可以在24小时的时间内流入循环(Butler，TP & Gullino PM，1975Cancer Research 35512-516)。肿瘤的流出容量最有可能依赖于所述肿瘤的侵略性。虽然肿瘤细胞连续地流入循环，但相信没有或仅有一小部分会产生远程转移(Butler & Gullino，同上)。使用下面推测，技术人员可以如下估计循环中肿瘤细胞的频率1.直径1mm的肿瘤包含107个细胞，4％或4×105个细胞将在24小时的时间内流入循环；2.肿瘤细胞仅存活一个循环周期；3.血液体积约5升；和4.心脏输出为5000ml/分钟。
在这种情况下，在携带直径1mm的肿瘤的患者的外周血中，肿瘤细胞的频率是约6个肿瘤细胞/100ml血液。肿瘤体积增加预期与循环肿瘤细胞的频率的增加成比例。如果情况如此，具有该灵敏度水平的方法将有利于评价远程转移的患者体内以及局部化疾病的患者体内的肿瘤负载量。检测患有局部化疾病的患者的外周血中的肿瘤细胞不仅能够在早期检测到肿瘤，而且提供关于所述肿瘤的潜在侵袭性的指征。
几个研究报道从接受自体外周血干细胞移植的乳腺癌患者收获的去除白细胞的产品中存在癌细胞(Brugger W等(1994)Blood 83636-640；Brockstein BE等(1996)J of Hematotherapy 5617；Ross AA等(1993)Blood 822605；Ross AA.(1998)J of Hematotherapy.79-18；Moss TJ等(1994)J.Hematotherapy.3163-163)。这些发现促进了对应用该方法进行自身移植的批评，因为移植品中的肿瘤细胞有建立转移的潜力。此外，已经发现从患有弥散性疾病的个体获得的去除白细胞的产品更有可能包含肿瘤细胞(Brugger等，1994，同上)。然而，这些研究并未报道定量数据，也没有报道在患有局部化疾病的患者的外周血中可以发现肿瘤细胞。考虑到这些观察，技术人员可以假设可以使用计数外周血内肿瘤细胞数量的高度灵敏和定量的检测来确定实际的肿瘤负载量。为评价所述检测的可行性，发展一种灵敏的细胞测定，所述细胞测定允许精确计算循环的癌细胞，所述精确计算仅受到测试的血体积的限制。
应当注意到可以使用多种不同的细胞分析平台鉴定和计算在富集样品中的细胞。所述分析平台的例子有Immunicon’s CellSpotter系统和CellTracks系统，Immunicon’s CellSpotter系统是一个磁性细胞固定化和分析系统，使用在实施例II中所述的手动观察细胞的显微镜检测，CellTracks系统是一个更先进的自动化光学扫描系统，在分别在美国专利第5,876,593号、第5,985,153号和第6,136,182号中描述。所有前述美国专利申请都通过引用加入本文中，因为它们公开用于手动或自动化定量和定性细胞分析的相应仪器和方法。可以在本发明的诊断和监测试剂盒中有利地使用所述设备。
其它分析平台包括激光扫描细胞计量术(Compucyte)、亮视野基础图像分析(Chromavision)和毛细管容量分析(Biometric Imaging)。
如下使用本发明优选实施方案的方法和组合物计数血液中的循环上皮细胞从血液中免疫磁性选择(富集)上皮细胞，然后通过多参数流式细胞术分析所述样品。免疫磁性样品制备对于减少样品体积和浓缩靶(上皮)细胞104倍是重要的。优化用于多参数流式细胞术分析的试剂，以便使上皮细胞定位于列表式获取的两个光散射和三个萤光参数的所产生的多维空间内唯一位置。这些试剂包括
1)用于鉴定白细胞(非肿瘤细胞)的抗泛白细胞抗原CD45的抗体；2)允许排除残余红细胞、血小板和其它无核物质的细胞类型特异性染料或核酸染料；和3)生物特异性试剂，或者针对细胞角蛋白的抗体，或者对EpCAM表位有特异性的抗体，所述抗体与用于免疫磁性选择所述细胞的抗体不同。
本领域内技术人员将认识到分析富集肿瘤细胞群体的方法将依赖于本发明的目的应用。例如，如下文所述，在筛选肿瘤或监测肿瘤复发时，循环上皮细胞的数目可以非常低。由于有一些“正常”水平的上皮细胞，(极有可能在静脉穿刺术期间引入)，因此需要鉴定上皮细胞是正常细胞或肿瘤细胞的分析方法。在这种情况下，基于显微镜检术的分析可能是最准确的。所述检查也可能包括形态学检查、鉴定已知的肿瘤性相关分子(如癌基因)。实施例11提供按照本发明的的方法可以进一步分析的合适的肿瘤性相关分子。
或者，在其中循环上皮细胞的数目远远超过在正常群体中观察到的数目的疾病状态下，计数所述细胞的分析方法应当是足够的。根据在正常群体中存在的循环罕见细胞的数目的统计平均值，依照本文所述方法确定患者的状态。也可以如本文所述，通过统计方法确定在早期癌症患者体内循环上皮细胞的水平以及在侵略性转移癌患者体内循环上皮细胞的水平。提供下面实施例以便利于实施本发明。这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1配制从全血有效分离罕见细胞的改良磁性纳米颗粒罕见细胞(例如患有上皮衍生肿瘤的患者体内的肿瘤细胞、母体血液内的胎儿细胞等)存在的频率可能低于每ml血一个罕见细胞。检测所述罕见细胞所需的血涂片的数目惊人地大。假设每10ml血内有10个罕见细胞，即对应于在5-10×107个白细胞内有10个罕见细胞，则可以通过细胞离心或沉降将细胞转移到显微镜载玻片上，用特异性针对目的罕见细胞的抗体染色，然后手动读数或自动读数。能够转移到一片载玻片上的细胞最大数量是约500,000个细胞，这意味着处理10ml血需要100-200片载玻片。该方法分析所需的时间使得该方法不实用，并且在经济上不可行。因此，使用富集方法或红细胞裂解程序分离罕见细胞，以便显著降低需要分析的载玻片数目，所述富集方法例如通过密度梯度离心减少样品体积并除去红细胞和血小板。如上文提到的，磁性富集是分离细胞的优选方法，在理想情况下，在分析前应当不必除去用于该目的的纳米颗粒。因此，所述纳米颗粒应当足够小，以便不干扰分析测量，即所述纳米颗粒小于约250nm。最优选所述纳米颗粒小于220nm，以便使它们能够通过滤膜进行无菌过滤。此外，所述纳米颗粒应当足够大并且有足够的磁反应性，允许在外部梯度磁分离器中从简单的实验室试管分离细胞，所述简单的实验室试管即试管、离心管、真空容器(vacutainer)等。另外，如以前提到的，内部梯度设备对于回收罕见细胞是麻烦、昂贵和缺乏效率的。同时，所述纳米颗粒和磁设备应当获得高并且可重复性的回收，非特异性结合少。美国专利5,597,531描述高度磁性颗粒的合成，所述高度磁性颗粒称为有许多上述特征的直接包被(DC)的颗粒。这些纳米颗粒由晶体磁石或磁性氧化铁的类球体附聚物组成，外面包被有聚合物或蛋白(基于包被的磁性颗粒)。因为它们的结构(磁性核心和聚合物外壳，其中核心直径远远大于外壳的厚度)，所以它们含约80-85％的磁物质。这些纳米颗粒的非特异性结合在5-8％的范围内，因此，它们对于分离罕见细胞并不非常实用。因此，假如技术人员以80％的捕获效率富集以每ml一个细胞存在的细胞，那么使用10ml全血(仅考虑白细胞)预期最好的结果是从总共四百万个细胞中回收8个细胞，即富集16-17倍。然而，在美国专利第5,597,531号中描述的磁性颗粒具有使用开放场分离器以及从简单实验室试管进行分离的合适磁性性质。此外，它们的平均大小低于上面建议的限度，因此它们并不干扰各种分析程序。基于使用这些材料进行的大量研究，人们发现与细胞的非特异性结合的主要原因是在所述纳米颗粒表面由于不完全包被而存在裸露的结晶氧化铁。所述不完全包被的晶体在生理pH下有足够高的正电荷，以致它们非常有可能强烈结合生物大分子，如细胞表面带负电荷的唾液酸。在美国专利第5,698,271中描述制造颗粒的改良方法。这些材料与＞531专利中公开的材料相比有改进，因为所述方法包括一个高温包被的步骤，该步骤明显增加包被的水平。例如，使用该方法用牛血清白蛋白(BSA)制造的纳米颗粒与美国专利5,579,531的DC-BSA材料相比，对细胞特征性的非特异性结合降低3-5倍。已经证明所述非特异性结合降低的直接原因是BSA包被材料的水平提高。当处理所述纳米颗粒以去除BSA包被后，非特异性结合恢复到高水平。因此，人们确定在氧化铁晶体表面包被的BSA的量与对细胞的非特异性结合之间有直接的关系。一般地说，这些颗粒与全血中细胞的非特异性结合是0.3％，这显著好于美国专利5,579,531获得的结果。因此，从10ml全血中与富集目的细胞一起分离的还有约200,000个非目的细胞。
除将在下面进一步解决的非特异性结合问题外，人们发现当使用如美国专利第5,579,531号和第5,698,271号所述生产的不同批磁性颗粒排除或富集罕见细胞时，各批的回收率不一致。在使用同一模型系统的情况下，有时回收率是85-95％，其它时候可能是40-50％。由于生产这些材料的方法导致大小分布在很宽的范围内(30nm到220nm)，曾经怀疑大小分布、尤其是小纳米颗粒的存在显著影响靶的回收率，而这种怀疑已经得到证实。由于小的纳米颗粒(30到70nm)能够更容易地扩散，因此它们与更大的对应物相比能优先地标记细胞。当使用非常高的梯度时，例如内部梯度柱的情况，这些材料不管大小，性能有很小的区别。另一方面，当使用外部梯度时，或者使用比微珠柱或钢丝柱上产生的梯度更低数量级的梯度时，小纳米颗粒在细胞上的占有率有显著作用。通过分级分离DC纳米颗粒并研究对回收率的效应，显示这确实是实际情况。根据这些研究以及其它优化实验，建立通过磁性或在柱上分级分离纳米颗粒的方法，其中可以制备没有非常小或非常大的纳米颗粒的碱性包被磁性颗粒。例如，可以生产平均直径100nm的碱性包被颗粒，所述颗粒最好包含痕量小于80nm或大于130nm的材料。相似地，可以制造约120nm的材料，其中没有明显量的材料小于90-95nm和大于160nm。所述材料在回收率方面表现最佳，通过加入60-70nm的纳米颗粒可以使所述材料亚优化。为实施本发明而应用的优选颗粒大小范围对于碱性包被磁性颗粒(如BSA包被的磁石)是90-150nm。可以使用Liberti等人在Fine Particles Science and Technology，777-90，E.Pelizzetti(编辑)(1996)中所述的方法获得在该优选范围内的颗粒。
为进一步解决非特异性结合的问题，尝试几种制造偶联直接纳米颗粒的抗体的途径。例如，可以通过标准异二功能化学，将特异性针对罕见细胞的单克隆抗体直接偶联到包被在DC磁性颗粒的BSA碱上(本文称为直接偶联方法)。用于这些目的的异二功能接头包括sulfosuccinimidil-4-[maleimidomethyl]环己烷-1-羧酸盐(SMCC)。在另一种方法中，可以将生物素酰化的单克隆抗体偶联到链霉抗生物素上，所述链霉抗生物素偶联用碱包被的颗粒。该缀合方法在本文中称为骑肩法(piggyback method)。在该方法中，通过与所述直接偶联方法相同的化学方法将链霉抗生物素偶联到所述用碱包被的磁性颗粒。在一种骑肩偶联方法中，使单生物素化抗体与链霉抗生物素磁性颗粒反应1小时，然后用游离生物素猝灭剩余的链霉抗生物素结合位点。重要的是在抗体偶联后猝灭剩余的链霉抗生物素位点，以防止在分离罕见细胞期间或细胞分析步骤中任何生物素化抗体结合磁性颗粒。此外，已经显示所述猝灭链霉抗生物素的方法有效对抗非特异性结合。在各种条件下温育所述材料和生物素化萤光大分子导致没有结合的萤光。与此相比，通过这两种方法将抗EpCAM抗体(从Wistar Institute，Philadelphia，Pa.获得的GA73.3)偶联到磁性颗粒上。比较这两种磁性颗粒的以下方面选择掺入全血的结肠肿瘤细胞系(Colo-205)细胞，白细胞的非特异性结合(NSB)或遗留量。在最终样品中存在的白细胞是非特异性结合到磁性颗粒的白细胞以及从洗涤步骤存留的细胞的组合。注意在磁性分离后，需要洗掉在分离开始时与管接触的任何细胞或在分离过程中借助非磁性因素转移的任何细胞。表I显示这两种磁性颗粒的比较。
表I
注意到的第一点是只有将抗体或链霉抗生物素偶联到BSA碱性颗粒上，才显著降低非特异性结合(数据未显示)。相信这是因为减少了“裸露的”晶体表面与用于结合的细胞的可接近性。上表证明两种类型磁性颗粒对于掺入细胞的回收率是相似的。然而，当使用偶联磁性颗粒的直接抗体时，白细胞的非特异性结合高达3倍。这种差异虽然相当小，但在处理和分析大量体积的血液时变得明显。根据这两种类型磁性颗粒之间差异的许多支持性观察，一种合理的解释是在使用骑肩偶联方法合成的磁性颗粒表面有更多层的蛋白。因此，所述磁性晶体的表面受到多层蛋白更大量的包被，看起来在空间上“受到保护”。这防止非靶细胞结合所述磁性颗粒。
在骑肩偶联方法中，所述磁性颗粒表面的链霉抗生物素结合位点的有限数目被生物素抗体占据，其余的位点用上文所述的猝灭方法用游离生物素饱和。在另一种偶联方法中，用单生物素-BSA(而不是使用游离生物素)猝灭和饱和多余的链霉抗生物素结合位点。该方法的基本原理是用单生物素BSA猝灭应当在空间上进一步地抑制细胞接触所述纳米颗粒未被包被的区域，即更好地覆盖所述纳米颗粒。碳分析显示该方法增加偶联到所述颗粒的蛋白的量。在实验中比较这两种磁性颗粒制备物，评价掺入的Colo 205从全血中的回收率以及白细胞的非特异性结合。结果显示于表II表II
可以通过缀合有限量的生物素到BSA，制备单生物素-BSA，以便30-40％获得的产物没有结合的生物素。
总之，具有均一大小分布和用生物素-BSA猝灭的链霉抗生物素结合位点的磁性颗粒在本发明的测定方法中表现非常好。与用生物素封闭的纳米颗粒相比，使用这些颗粒获得掺入的上皮肿瘤细胞的好的回收率，并且非特异性结合降低几乎一个数量级。因此，这些材料以及使用它们获得的结果定义了一种非常有用的能够进一步优化的产品。制造所述改良的铁磁流体产物，使其含有尽可能多的磁性，对其进行包被以排除所述磁性核心与血液中任何物质(包括细胞)所有可能的相互作用(可能用无孔的单层包被)，并限定在大小范围和分布内。在优选情况下，使用不与生物学材料相互作用的包被材料。当所述相互作用不可避免时，需要封闭它们的方法。为使材料含有尽可能多的磁性，那些如美国专利第5,579,531号和第5,698,271号生产的材料是优选的起始材料。优选它们，因为它们由大的磁性核心组成，外面有明显但不完全的单层磁性包被材料。对于用BSA包被的100nm纳米颗粒，所述核心将是约90nm的合适磁性氧化铁如磁石。由于所述核心与包被材料的相对尺寸，所述纳米颗粒明显有尽可能多的磁性。假如技术人员考虑到所述包被的功能是防止所述纳米颗粒之间发生不必要的相互作用并产生肉眼可见的聚集，那么这一点是明显的。所述包被也促进与溶剂分子的足够相互作用，以便维持胶体行为并为偶联提供方便的化学方法。美国专利第5,579,531号和第5,698,271号也优选作为起始材料，因为它们有足够的单层包被，其中可以用几种方法(即空间方法和物理方法)填充所述单层上的“孔”。明显的是，合适的任何包被将促进有效完全地覆盖所述磁性核心，以抑制所述核心材料与血液成分之间的相互作用或者任何其它系统中的任何其它非特异性效应。所述包被加入所述纳米颗粒的物质越少越好，以最大化磁性物质与纳米颗粒物质的比例。
实施例2半自动化样品制备和分析，以鉴定循环肿瘤细胞发展一种半自动化的系统，该系统处理和分析7.5ml血液中来自上皮的肿瘤细胞的存在。免疫磁性标记并分离血液中上皮细胞来源的细胞。差异化萤光标记通过磁性捕获的细胞，置于分析室内。使用四色萤光成像区分碎片、造血细胞和上皮来源的循环肿瘤细胞(CTC)。在捕获的图像上应用一种算法，计算内部对照并鉴定根据大小和免疫表型所有可能分类为肿瘤细胞的物体。在用户界面上呈现每种物体的小图，据此用户可以确定肿瘤细胞的存在。在处理正常供体的血液时，所述内部对照在不同系统和操作者之间显示一致和可重复的结果。在转移乳腺癌患者的血液样品中检测到CTC，然而，可以使用该系统分析其它疾病。
如以前提到的，肿瘤细胞在癌症患者血液中可能以非常低的频率存在(每ml小于10个细胞)。在检测CTC存在时涉及的繁重手工样品制备和复杂的分析常常导致错误结果。对于非常复杂的实验室程序，错误结果的根本原因常常追溯到系统性误差和/或随机分析前误差的累计效应，即误差在样品制备或预处理阶段发生，而不是出现在分析方法本身。分析前误差可能表现为技术敏感处理步骤产生的偏差，以及操作者之间的随机或系统偏差。因此，当无法一致地进行罕见细胞分析中的人工样品制备时，可能导致高变异性和不可靠的测定结果。因此，所述分析前步骤的自动化最小化了变异性，并提供更一致的分析结果。用于分析所制备样品经常使用的分析方法是流式细胞术或显微镜检术。虽然流式细胞术灵敏并且可重复，但研究者不能证实通过免疫表型鉴定的罕见事件确实显示与肿瘤细胞一致的形态学特征。显微镜检术增加确定恶性肿瘤过程中的可信度，但缺点是与处理样品有关的可观并且可变的细胞损失。在此我们介绍一种新型的细胞呈递设备和方法，所述设备和方法能够在半自动化的四色萤光显微镜系统中有效收集和分析CTC。
提供下面材料和方法以方便实施例2的实践。
用系统缓冲液(Immunicon Corp，Huntingdon Valley，PA)加入系统，在该方法的各步骤中也使用所述系统缓冲液。该缓冲液包含磷酸缓冲盐溶液、EDTA以及蛋白，以减少试剂与细胞和系统部件的非特异性结合。将磁性颗粒偶联到实施例1所述的特异性针对上皮细胞附着分子(EpCAM)的单克隆抗体(mabs)。所述EpCAM抗原在上披来源的细胞表面表达，但不在造血来源的细胞表面表达(Momburg等Cancer Research(1987)472883-2891；Gaffey等Am.J.Surg.Path.(1992)16593-599；Herlyn等J.Immun.Meth.(1984)73157-167；DeLeij等Int.J.Cancer Suppl.(1994)860-63)。除抗EpCAM抗体外，将脱硫生物素与所述磁性纳米偶联，形成CA-EpCAM，该试剂通过加入可溶链霉抗生物素交联CTC表面的多个磁性纳米颗粒，使聚集受到控制，由此增加磁性载量和所述细胞的捕获效率(Liberti等(2001)Journal of Magnetism and Magnetic Materials 225301-307)。在加入CA-EpCAM形成聚集物前，在标本中加入溶于AB缓冲液的链霉抗生物素(添加链霉抗生物素的系统缓冲液)，该步骤使具有不同EpCAM抗原密度的细胞之间的磁性捕获效率的差异最小化。除核酸特异性染料DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)外，还用缀合藻红蛋白的抗细胞角蛋白(CK-PE)以及缀合别藻蓝蛋白的抗CD45(CD45-APC)萤光标记所述通过磁性捕获的细胞。所述抗细胞角蛋白识别在上皮来源的细胞中存在的角蛋白4、6、8、10、13和18。在缓冲介质中加入mab，所述缓冲介质包含渗透所述细胞的细胞质膜的去污剂(Immuniperm)。在Cellfix中的最终悬浮缓冲液(Immunicon Corp，Huntingdon Valley，PA)是包含生物素以及细胞稳定剂的磷酸盐缓冲液。利用生物素与链霉抗生物素更高的亲和力，用其从链霉抗生物素置换出脱硫生物素，由此逆转在所述测定更早步骤中形成的聚集物内铁磁流体颗粒表面的脱硫生物素与链霉生物素之间形成的受控交联。
为监测所述方法的准确度，处理前在血液中加入已知数量的内部对照细胞。内部对照细胞是美国专利申请09/801,471的主题细胞，所述专利申请的完整公开内容通过引用结合到本文中。可以从癌症肿瘤细胞系成功地产生这些对照细胞。如本文所述，稳定来自乳腺癌细胞系SKBR-3的细胞，并用萤光膜染料DiOC16(得自MolecularProbes)唯一地标记，以允许区别内源肿瘤细胞。在每个标本中掺入约1000个对照细胞。所述对照细胞表达EpCAM，并与所述肿瘤细胞同时被捕获。对照细胞也表达细胞内细胞角蛋白，CK-PE对它们的染色证实该试剂的质量。加入的对照细胞的回收率为每种标本提供总体试剂和系统性能的指标，而不象外部对照仅能检测系统误差。
样品制备系统所述系统装备有两个磁性分离器，每个磁性分离器包括一组四个矩形的稀土磁铁，所述四个磁铁排成四极构型，中间是一个由环状钢偏转线圈围绕的17mm直径的室。在本系统中，每个分离器可以容纳一支15ml的圆锥管。在其它系统排列中，可以针对不同的分离器使用不同的管。在每个分离器附近是支持分析室(CellSpotter室)的磁轭，在所述分析室内转移进最终样品。可以从系统中取出该该室部件，置于显微镜的载物台上。所述管转送器由两个可移动的管臂以及一个旋转的转台组成，所述管臂用于提起和降低管进入和取出所述磁性分离器，所述转台用于将管放置在各个处理位置。另外，在所述转台上放置有一个探头洗涤碗，用于对所述吸引和转移探头进行内部和外部洗涤。液体传递转移和探头洗涤使用携带5mL注射器的Cavro XE1000数字注射器泵。使用装配PharMed管道的Cavro SPSmart蠕动泵吸出液体到废液池。使用两个弹簧阀和一个3通道阀(Bio-Chem)控制液体通路。使用由13AWG Inconel管道(无磁性)制造的各个吸引和转移探头将液体连接到15ml圆锥管和所述室。使用连续梁光电传感器(Omron)确定红细胞层的高度，以精确控制血浆吸出。使用8位微控制器运行固件控制该系统，进行动作控制、过程控制以及操作者界面指令。将该方法本身(温育时间、液体处理步骤等)编码进单独的记忆芯片。操作者界面包括一个有四乘五键的键盘、一块2行各20字符的LCD显示器以及一个声音报警器。
CellSpotter室使用一个模制室收集制备的样品，所述模制室的上表面平面观察区域为29.7×2.7mm，深度为4mm(约320μl体积)。该室的端口用塞子封闭，以便可以可重复并且有效地进行室的填充，将99％的样品置于所述室的观察区域内。也使用专门的校正室来校正室中心到显微镜载物台原始位置以及光源的偏差，所述校正室在中心有定位标记。
CellSpotter系统CellSpotter系统利用Nikon E-400显微镜，配备10X物镜(WD 4mm，NA 0.45)，高分辨率X，Y，Z载物台和由Ludl MAC2002控制器控制的滤镜盒转换控制器，所述Ludl MAC2002控制器又由PC通过RS-232控制。四个盒中每一个盒的激发滤镜、二色性滤镜和发射滤镜分用于DAPI 365nm/400nm/400nm、DiOC16 480nm/495nm/510nm、PE 546nm/560nm/580nm以及APC 620nm/660nm/700nm。用连接National Instruments PCI-1424数字帧接收机的Hamamatsu 12位1280×1024像素数字照相机获取图像。使用LabVIEW和IMAQ VisionToolkit发展数据获取软件。使用IBM的DB-2数据库通过HTML界面编写数据分析和显示程序。
半自动化样品制备系统图1描述制备用于分析的样品所涉及的步骤。在15ml圆锥管中，加入7.5ml血、6ml系统缓冲液和100μl(约1000个)对照细胞。所述样品在800g离心10分钟，然后置于系统中。该系统定位管内堆积的红细胞层的顶部，将一个探头引入管中吸取血浆，同时不干扰淡黄色包被层。从系统中取出所述管，加入并混合6ml AB缓冲液和100μl CAEpCAM铁磁流体，将管放入系统，在系统控制下从磁性分离器中插入并取出样品管，由此在分离和移除时间内提供精确控制。当在磁场中时，铁磁流体横向通过血液样品移动，由此增加潜在靶细胞的标记效率，并移动磁性标记的CTC和未结合的铁磁流体到管壁。温育并分离20分钟后，将探头缓慢伸入管内，吸取并丢弃血液样品到废液池。采用机械手段将该管从分离器中取出，在管内加入3ml系统缓冲液。混合该管，重悬浮收集的细胞和铁磁流体。该系统将管伸入磁铁内，10分钟后吸取未收集的材料。由系统将该管从磁铁中移出，加入200μl Immunoperm以及60μl染色试剂，然后混合。温育15分钟后，由系统吸出并弃去多余的染色试剂，然后将管移出磁铁。加入250μl Cellfix后十分钟，系统转移样品进入该室。该室的体积是约320μl，系统使用100μl系统缓冲液进行清洗，保证将管内的残余细胞转移进该室内。稍稍过量填注该室，以避免在用塞子封印加盖时产生气泡。在其中探头接触样品的每个步骤后，系统都完全洗涤探头，以除去任何遗留的细胞或试剂。
CellSpotter分析室图2A显示分析室以及将该室固定在两块磁铁之间的磁铁偏转线圈部件。为确定所述磁铁的最佳角度以及该室相对于所述两块有角磁铁的最佳位置，编写一个计算机程序，刺激磁性标记的细胞在该室内的移动。目标是移动所有磁性标记的细胞到该室的上表面，同时防止移动到磁极。从室表面到磁铁表面的距离也必需足够短，使得能够通过显微镜物镜进行观察。图2B显示这样一种模拟装置，该室在磁铁的北极(N)和南极(S)之间画出，虚线指出磁性标记的细胞的轨迹。图2C显示在该室内轨迹的放大。所有用磁性纳米颗粒标记的细胞在该室内都垂直移动。图2D显示从一个实验获得的CellSpotter室的俯视图，在该实验中将细胞和磁性纳米颗粒引入该室。在该室表面均匀分布的水平线代表沿磁场线排列的磁性纳米颗粒。
数据获取该室的表面有80.2mm2，必须完整地扫描该表面，寻找任何被DAPI、DiOC16、CK-PE和CD45-APC染色的物体。物镜和数码相机的组合获得像素大小为0.45(0.67×0.67)μm2，图像大小为858×686μm。为覆盖整个室的表面，CellSpotter系统对四块滤镜的每一块获取4行35个图像，即每个室共140个画面，560个图像。当样品测试开始时，CellSpotter获取程序自动确定需要获取图像的区域、获取图像的数目、每个图像的位置以及在每个位置使用的显微镜焦点。如下确定图像获取区域移动X和Y载物台到5个位置，这5个位置的图像中应该可以看到该室的一个边缘。该软件确定边缘位置、在图像显示上划线标出发现该线的地方、并允许操作者批准或撤消选定的边缘位置。在该室的其中一条长边上做两次测量，确定该室相对于载物台X轴的角偏移量。所有图像都需要处于整个拍照区域的焦点内。显微镜焦点的深度小于10μm。虽然该室的平面处于10μm内，但在显微镜载物台、磁轭和室之间的机械容许偏差可能导致X轴上的角歪斜。由于时间限制，让所述软件反复寻找样品室内140个照相位置中每一个位置的焦点是不可行的。发展一种算法，由此所述软件使用所述细胞的核酸染色放出的光，反复测量该室内5个位置的焦点。然后该软件应用经验焦点数据，获取第二组多项式的精确程度，使用该组精确程度确定所述样品室内每一个照相位点的焦点或Z-调整。该重复聚焦程序有独特的特点，仅针对用户定义的大小范围内的细胞应用聚焦程序，并忽略样品内的非细胞物体。在没有发现合适颗粒的情况下，系统将移动到样品内的另一个可选焦点。来自一个样品的所有图像都输入一个目录，该目录对于特异性样品鉴定是唯一的。
数据分析图3A-3D显示处理乳腺癌患者的7.5ml血液样品后，获取的140幅画面的其中之一的DAPI图像(图3A)、DiOC16(图3B)、CK-PE(图3C)和CD45-APC(图3D)。在DAPI图像中，可以观察到多个细胞核。在7个核周围画了一个矩形框。对应的DiOC16图像显示同样的7个矩形框。在这些框的5个中，存在圆形的萤光物体，这通常是由于样品处理在在血液中加入的对照细胞。对照细胞也被CK-PE染成亮色，如CK-PE图像中同样的5个框内细胞的明亮染色所示。在CK-PE图像内染色的7个框中，有两个框在DiOC16(对照)图像内不染色。其中一个框显示两个核，明亮的CK-PE染色对应于两个细胞。CD45-APC图像在所述框内没有染色，证实所述框包含两个上皮细胞来源的细胞。另一个框显示暗的CK-PE染色和明亮的CD45-APC染色，这排除该事件是上皮细胞。对从样品获得的所有图像应用一种算法，搜寻被DAPI、DiOC16和CK-PE染色的位置。假如染色区域与对照细胞的染色区域一致(DiOC16+，CK-，PE+)，该软件就指定该位置(框)为对照细胞。数据分析软件将在样品中发现的对照细胞数目列成表。假如染色区域与可能肿瘤细胞的染色区域一致(DAPI+，DiOC16-，CK-PE+)，该软件就将这些区域的位置贮藏在数据库内。该软件根据每个参数将每个框的小图排列成行。从左到右，这些小图代表核染色(DAPI)、细胞质细胞角蛋白染色(CK-PE)、对照细胞染色(DiOC16)和表面CD45染色(CD45-APC)。左方的组合图像显示核染色(DAPI)和细胞质染色(CK-PE)的假彩色覆盖图。所述组合图像旁边的复选框以及CD45-APC框允许使用者证实该行中代表的图像是与肿瘤细胞一致或针对白细胞标记CD45染色。该软件将每个样品的复选框排列成表，并将该信息贮藏在数据库中。图4显示六个染色区域的小图，这些小图显示与来自乳腺癌患者样品的CTC一致的染色特征。这六个染色区域中三个区域的图像清楚地显示CTC的特征，如存在清楚的核、细胞质细胞角蛋白染色以及缺乏DiOC16染色和CD45染色。注意到肿瘤细胞表现的差异在行201中的细胞相对小，在行202中存在一簇3个肿瘤细胞，在行204中存在一个非常大的细胞。在行203中，在框的顶端显示一个对照细胞。显示该区域是因为在所述对照细胞之下的CK-PE阳性事件。然而，所显示的核属于白细胞，并且不与CK-PE染色一致。行205显示在所有四块滤镜中表现阳性染色的碎片，在行206中，所述CK-PE阳性事件并不与DAPI染色一致。
系统性能为比较人工样品制备以及系统样品制备，在7.5ml等分的血液中掺入对照细胞，并用两种方法处理。在六个实验中，人工样品制备的平均肿瘤细胞回收率是68％，变异系数是10％，系统样品制备的平均肿瘤回收率是94％，变异系数是7％。如下测试系统的线性在从5名血液供体获得的7.5ml等分的血液中，掺入对照细胞(n＝1000)以及0个、50个、100个、150个以及200个肿瘤细胞系SKBR-3的细胞。在这25个实验中，对照细胞的平均回收率是81％，变异系数是7.8％，这证明所述样品得到适当处理。掺入的细胞数目与回收的细胞数目之间的相关性是r2＝0.99，斜率0.84，截矩3.2，这表明84％的肿瘤细胞回收率与掺入肿瘤细胞的水平无关。在来自10名供体的7.5ml等分血液中掺入0个和10个肿瘤细胞，测试系统的灵敏度。在所述20个实验中，平均对照细胞回收率是85％，变异系数是7.7％。实际掺入数量的确定性随掺入细胞的数目降低。在不同的两天进行所述实验在掺入10个细胞的情况下，第一天的变异系数是25％，第二天的变异系数是15％。在未掺入样品中，处理后没有发现肿瘤细胞。与此不同，在所有掺入的血液样品中都检测到肿瘤细胞，范围从6个到15个肿瘤细胞(平均10.5个细胞，CV 32％)。该数据清楚地证明该系统的灵敏度只受到所处理的血液体积的限制。
为表征不同位点和操作者之间样品制备和分析系统的性能，在不同位点安排六个系统。在这些位点，一式两份地处理从99名健康供体获得的血液样品。六个位点的对照细胞平均回收率是77.1％，变异系数9.7％。如所预期的，重复样品之间的重复性更好，变异系数是4.9％。被软件分类为可能肿瘤细胞候选物的事件数目在10个事件到304个事件之间变化，平均为55。对候选事件的回顾显示在192个血液样品的28个中(14.6％)，发现一个分类为CTC的细胞，在9个样品中(4.7％)发现2个细胞，在3个样品中(1.6％)发现3个细胞，在1个样品中(0.5％)发现13个CTC。表III显示每个位点这些实验的结果。在22名针对转移乳腺癌进行治疗的患者中，发现16到703个(平均116个)候选CTC。对候选事件的回顾显示在22个血液样品的13个中，发现少于3个被分类为CTC的细胞，在4个样品中，发现3-10个CTC，在5个样品中，发现超过10个CTC。
在癌症患者的血液中可以检测到循环肿瘤细胞，虽然频率非常低。为研究CTC在癌症患者管理中的潜在用途，需要一个能够准确可靠地计算和表征CTC的系统，以进行对照临床研究。CTC的数目可以代表肿瘤负担，CTC数目的改变可以提供评价给定治疗的有效性的方法。可以使用对CTC中存在或不存在治疗靶的分析来指导治疗。检测据称健康的个体体内的CTC代表癌症早期诊断中的一个进步。假如所述早期检测是可能的，那么就可以通过血液测试进行实体瘤的非侵袭性、“整体”活组织检查。
为此，发展一个半自动化的系统，该系统通过免疫磁性从7.5ml血液中分离上皮细胞，同时减少标本体积并免疫萤光标记细胞。所述系统产生320μl的液体样品，将该液体样品转移到分析室以及磁性装置，所述磁性装置将样品内所有磁性标记的细胞拖到该室的内部上表面，进行分析。用CellSpotter系统对样品进行四色萤光分析，所述CellSpotter系统计算内部对照细胞，并根据以下指标鉴定可能分类为肿瘤细胞的对象核染色阳性，细胞质细胞角蛋白染色阳性，细胞表面不对CD45染色。所有可能分类为肿瘤细胞的物体的小图都显示在用户界面上，用户从该界面能够作出最终判断。
与人工制备血液样品相比，通过系统进行样品制备提供以下好处所述肿瘤细胞的回收率更高，重复性更好。掺入实验的数据证明该系统极好的线性和灵敏度。为证明该系统的重复性，在六个不同位点处理得自99名正常供体的一式两份血液样品。根据内部对照细胞的回收率评价，所有位点的数据显示一个重复性水平。内部细胞的平均回收率是77.1％，变异系数在3.2％到11.8％之间变化(平均9.7％)。通过检测患者样品中CTC的能力确定该系统的灵敏度，通过鉴定正常供体血液中的CTC来确定该系统的特异性。分析软件鉴定在192个正常血液样品中10个到304个(平均55个)候选事件，对这些候选物的回顾显示平均有0.4个分类为CTC的事件。在22名针对转移乳腺癌进行治疗的患者中，发现16到703个(平均116个)候选CTC，有1-59个(平均7个)分类为CTC。在22名患者中，有15名患者的血液内的CTC数目超过正常个体平均CTC计数的99％置信区间上限(平均值+2.6*SE＝0.56)。在一个正常血液样品中，有13个事件被操作者分类为CTC，但对数据的回顾揭示这可能是由于被DiOC16微弱染色的内部对照细胞。为避免由于错误分类对照细胞的可能假阳性结果，在运行实际患者样品前仅加入内部对照细胞以证明系统和操作者的熟练程度。在样品制备和CTC分析中，系统和操作者之间一致和可重复的结果提供了进行对照临床研究的机会，以评价CTC水平在癌症患者管理中的作用。
表III分析来自99名健康对照的192个血液样品
n＝事件数目CC＝对照细胞实施例3计数转移乳腺癌治疗患者体内的循环上皮细胞提供下面方法以便利后面实施例的实行。
患者。获得参加者的同意后，从对照以及乳腺癌患者、前列腺癌患者以及结肠癌患者获取8-20ml血液样品。在一年时间内，在几个时间点从这些患者中的一些人抽取血液。将血液样品抽入Vacutainer管(Becton-Dickinson)内，管内包含EDTA作为抗凝血剂。所述样品在室温下保存，收集后24小时内处理。计算来自乳腺癌患者、前列腺癌患者和结肠癌患者的外周血样品中的循环上皮细胞，并计算没有恶性肿瘤的正常对照体内的循环上皮细胞。从患者的表格获取诊断数据、治疗性干预以及临床状况。合作机构的机构审查委员会批准该方案。
样品制备。特异性针对上皮细胞粘着分子(EpCAM)的单克隆抗体与上皮细胞来源的组织有广泛反应性(Stahel RA等Int J CancerSuppl.86-26(1994)；Momburg F等Cancer research.472883-2891(1987)；Gaffey MJ等Am J Surg Path.16593-599(1992))。将识别EpCAM上两个不同表位的GA73.3或MJ37EpCAM抗体(D Herlyn惠赠(Herlyn D等J Immunol Methods.73157-167(1984))WistarInstitute，Philadelphia，PA和MJ Mattes(De Leij L等Int J Cancer Suppl860-63(1993))Center for Molecular Medicine and Immunology，NJ)偶联到磁性纳米颗粒(铁磁流体)上(Liberti PA & Piccoli SP，美国专利第5,512,332号(1996)，Immunicon，Huntingdon Valley，PA)。血液与缀合抗EpCAM的铁磁流体在内径13mm的一次性管内温育15分钟。将所述管置于由四块相对的磁铁组成的分离器内10分钟(QMS13，Immunicon，Huntingdon Valley，PA)。分离后，吸出并弃去血液。从磁性分离器中取出管，用2ml FACS渗透溶液(BDIS，San Jose，CA)重悬浮从管壁上收集的组份，然后置于磁性分离器中5分钟。吸出并弃去溶液，将细胞重悬浮于150μl细胞缓冲液(PBS，1％BSA，50mMEDTA，0.1％叠氮化钠)，然后在其中加入饱和状态的缀合抗细胞角蛋白(CAM5.2单克隆抗体)的藻红蛋白(PE)以及用多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)标记的CD45。温育15分钟后，加入2ml细胞缓冲液，通过磁性分离所述细胞悬浮液5分钟。弃去未分离的悬浮液后，将收集的细胞重悬浮于0.5ml所述缓冲液中，并在其中按照厂家指导加入核酸染料，所述核酸染料由BDIS，San Jose，CA提供，用于Procount系统。在某些情况下，在所述铁磁流体表面使用EpCAM抗体MJ37，则使用GA73.3PE鉴定选定的上皮细胞。在这些情况下，不需要渗透所述细胞。用于流式细胞术的试剂由BDIS，San Jose，CA惠赠。
确定循环上皮细胞的组织来源的一种示例性的方法使用细胞化学以及免疫学鉴定技术。用5％BSA封闭非特异性结合位点30分钟后，在所述载玻片上加入识别细胞角蛋白5、6、8、18(CK，5D3，LP34，Novocastra)、识别MUC-1糖蛋白(MUC-1，Ma695 Novocastra)或识别前列腺特异性抗原(PSMA)、识别得自Dr.Neil Bander(CornellUniversity，Ithaca，NY)的克隆J591的第一单克隆抗体。所述样品在室温下温育20分钟，在PBS中洗涤两次，每次5分钟，然后暴露于第二兔抗小鼠Ig(Z0259，Dako Corp.，Carpenteria，CA)20分钟。冲洗两次后，将所述样品与碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)兔Ig复合物温育15分钟。最后，加入酶底物(New Fuchsin，Dako Corp.CA)，出现红色沉淀。用苏木精对核进行复染。使用连接到光学显微镜的Kodak数码相机记录数据。可以将数据贮藏在CD上，以备以后参考。
样品分析。在FACSCalibur流式细胞仪(BDIS，San Jose，CA)上分析85％的样品。使用所述核酸染料萤光的阈值，获取列表式数据。使用Paint-A-GatePro(BDIS，San Jose，CA)进行多参数数据分析。分析标准包括正向光散射确定的大小、正交光散射定义的粒度、PE标记的细胞角蛋白单克隆抗体的阳性染色以及不能用PerCP标记的CD45单克隆抗体染色。对于每种样品，将上皮细胞典型区域内存在的事件数目归一化到10ml血液。
图5A和5B显示当使用本发明的测定方法分离掺入全血的肿瘤细胞时获得的结果。图5A显示显微镜检术分析，图5B显示使用流式细胞术获得的分析结果。图6A-6C显示对10ml血液样品进行的流式细胞术分析的三个例子，所述血液样品在三个时间点从一名转移乳腺癌患者获得，图6A-6C还包括流式细胞术的抗白细胞抗体对抗上皮细胞抗体的相关性显示。在图6A中，检测到14个事件，这14个事件存在于上皮细胞典型的位置。在图6B中，检测到108个上皮细胞，在图6C中，检查到1036个上皮细胞。
在对10ml血液进行的分析中，超过核酸染料阈值的事件的数目在5,000个事件到50,000个事件之间。这些事件包括细胞碎片和白细胞。在分析32个对照的血液时，在上皮细胞典型区域内存在的事件数目范围从0到4个/10ml血液(平均值＝1.0，SD＝1.2)。
研究期间，八名乳腺癌患者有活动的转移疾病。在这些患者中，10ml血液内上皮细胞的数目在0到1036个的范围内变化。通过主观标准和客观标准评价疾病活性，所述主观标准即骨痛、呼吸困难等，所述客观标准即X射线、骨扫描、CT扫描、MRI和淋巴结大小。如表IV陈述，患者分类为类0到类4。
表IV手术治疗后，根据疾病的临床情况对患者进行分类类别 标准0手术治疗后在任何时间点都没有疾病表现1在一个时间点有疾病表现2疾病稳定3活动性进行性疾病4疾病威胁生命图7显示在患有转移疾病的8名患者的血液中，上皮细胞计数的动力学。曲线上的阴影区域指出在对照中检测到阳性事件的范围。所述曲线也指出何时给予化疗。图7A显示一名患有威胁生命的疾病的患者在她参加研究时有200个上皮细胞/10ml血液。高剂量的阿霉素降低该数目到正常范围内，但中止阿霉素后该数目再次上升。在阿霉素的第二个疗程后，上皮细胞的数目显著降低，但仍然在正常范围以上。图7B显示一名患者在43周内的进程。该患者在研究开始时无症状，但已知过去有骨转移。检测到上皮细胞在正常水平以上，在研究期间稳定增加。在给予一个疗程的高剂量阿霉素后，发现上皮细胞的数目短暂减少。该患者的疾病活动性在该期间明显增加。在图7C和图7D中，显示两名患者有较低的疾病活动。在这些患者中，上皮细胞数目随时间的变化也反应疾病活动性的变化。在图7E和图7F显示的患者中，外周血上皮细胞的数目在最后一个研究时间点增加，但患者仍然没有症状。
在图7G显示的病例，在第一个研究时间点没有检测到上皮细胞，该时间点是接受乳腺癌手术后三年(T2N1M0)。四周后，通过流式细胞术在10ml血液中检测到50个上皮细胞。患者在该时间没有疾病复发的临床征象。分析追加的一个血液样品，在形态学上确认通过流式细胞术检测的所述细胞具有与恶性细胞一致的特征。
图8A显示两个细胞，所述两个细胞的核与细胞质的比例大，对细胞角蛋白染色表现阳性，都具有与上皮细胞来源的肿瘤细胞一致的特征。该发现四周后，对该患者进行腋窝的淋巴结活组织检查。从活组织检查获得的细胞证明是恶性来源的细胞。虽然在该时间做的X射线并未显示肺部转移的征象，但两周后进行的CT扫描显示肺部转移的迹象。该患者没有肺部转移的症状。根据腋窝的淋巴结累积消失测量，该患者对Vinorelbine反应良好。外周血上皮细胞数目降低到刚好在正常范围以上的水平。开始治疗二十四周后，外周血上皮细胞数目增加，根据身体检查，腋窝的淋巴结大小增加。在这8名乳腺癌转移疾病患者体内的外周血上皮细胞数目清楚地反应在研究期间，疾病的活动性和对治疗的反应或缺乏反应。
使用胶体磁性纳米颗粒进行上述实验。在本实施例中，也评价更大的磁珠对于选择在血液中存在频率低的肿瘤细胞的效率，以确定是否也可以使用微米大小的珠来选择肿瘤细胞。然而，如上文所述，本应用中优选纳米大小的磁性颗粒。
如以前提到的，使用更大的珠有缺点。这些缺点是(i)所述珠太大，不能扩散，以致所述珠与存在频率低的靶细胞的碰撞需要混合，(ii)所述珠沉降非常快，这进一步加强了对持续混合的需要，以及(iii)大的珠在细胞周围聚集，使分析变得模糊。
因此，在显色或分析前需要从细胞表面去除大珠。依照本发明，已经发现可以如下改善用更大的珠选择细胞的效率增加珠的浓度、增加温育时间，同时持续搅拌以便利与罕见靶细胞的结合。在本实施例中，在一个模型研究中，使用对大珠最佳的条件，用2.8μm Dynal抗上皮细胞珠(Dynal，NY)测试从血液中选择肿瘤细胞的效率。这些珠缀合特异性针对上皮肿瘤细胞的单克隆抗体。在正常血液中掺入已知数目的肿瘤细胞(癌症细胞系)，在用珠选择后确定回收率。用萤光染料预标记所述肿瘤细胞，以便在检测期间将它们与血液细胞区分开来。根据厂家建议实施所述方法。
在15ml聚苯乙烯离心管内加入全血(5ml)，然后加入20±3个萤光标记的SKBR-3(乳腺癌细胞系)细胞。用核酸染色染料(Hoechst33342)预染SKBR-3细胞，以便选择珠后进行检测。用含5mM EDTA的5ml Dulbecco’s PBS稀释血液，在震动机上4℃下混合所述稀释血液15分钟。在所述血液样品中加入100μl含50×106个珠的Dynal抗上皮细胞珠，然后在震动机上4℃下温育30分钟。注意所使用的珠的数目与总白细胞的数目相似，即每个白细胞一个珠。将所述样品管放入Dynal MPC磁性分离器6分钟，分离磁性标记的细胞。
吸出上清后，将收集的细胞重悬浮于含0.1％BSA的3mlDulbecco’s PBS中。将所述样品管放回Dynal’s MPC 6分钟，除去任何残余的血细胞。吸出上清后，将所述磁性结合的细胞重悬浮于含0.1％BSA的200μl Dulbecco’s PBS中。
最终样品包含选定的肿瘤细胞、非特异性结合的血细胞以及多余的游离磁珠，将所述最终样品点样到免疫萤光载玻片上，检测肿瘤细胞。将200μl样品点样到10个不同的孔中，分散游离的磁珠。使用萤光显微镜计算每个孔中存在的萤光染色的肿瘤细胞。结果显示于表V
表V
所述结果显示使用Dynal磁珠平均从血液中回收67％掺入的肿瘤细胞。这提示可以在最佳条件下用更大的磁珠有效选择在血液中存在的肿瘤细胞。然而，在本实施例中，仅评价从血液中选择肿瘤细胞，而不进行任何分析。此外，可以确定回收的效率，因为已经用强萤光染料预染细胞。最终样品(200μl)除选定的肿瘤细胞(10-17)以及非特异性结合的白细胞外，包含50×106个珠。珠的大小(2.8μm)与某些血细胞的大小类似，占据载玻片上大部分表面积。因此，为获得回收率数据，必需将样品点样到几个孔内，有效分散游离的磁珠，以检测回收的肿瘤细胞。
在细胞表面还有许多珠，这些珠阻碍对选定肿瘤细胞的观察和染色以及进一步的分析。在本实施例中，肿瘤细胞用萤光核酸染料预染，而检测不需要进一步的染色。然而，常常需要鉴定所述磁珠所结合的细胞的组织来源。使用标记抗体进行所述鉴定，以检测和表征在临床样品中存在的肿瘤细胞。因此，选择靶细胞后，即分析前，必需从细胞表面除去珠并将所述珠从样品中分离出来。磁性纳米珠没有这种情况，因为它们的大小并不干扰细胞分析。
总之，本实施例显示在本文公开的方法中也可以利用大的磁珠，以有效分离循环的肿瘤细胞。
可以利用几种方法从细胞表面释放珠，同时不显著伤害分离的细胞。一种方法是加入过量与所涉及的抗原或抗体有更高亲和力的特异性竞争试剂，从细胞表面置换抗体。在使用肽(Baxter Isolex 300)的临床应用中，使用这种类型的机制从CD34选定的细胞释放珠。所述肽与CD34抗原竞争结合珠表面的抗体，从细胞释放所述抗体-珠复合物。另一种方法使用珠和抗体之间的可逆化学接头。
可以在缀合抗体到磁珠的过程中插入所述化学接头。可以在合适条件下切割所述化学接头，从抗体释放珠。目前应用的方法之一使用核酸接头连接抗体和到磁珠。所述核酸接头是聚核苷酸，可以使用DNAse酶特异性水解。在水解所述核酸接头内存在的核苷酸键后，珠从所述抗体上释放出来，而所述抗体保持与细胞结合。通过磁性分离，从细胞悬浮液中除去释放的珠。从珠释放的所述细胞可以用于显微镜检术或流式细胞术的进一步分析。
本实施例证明也可以使用更大的磁珠从血液中分离肿瘤细胞，只要使用它们以足够高的浓度标记细胞，然后在分析之前从细胞上释放它们。
实施例4计数患者体内的循环上皮细胞，所述患者已经接受治疗性乳腺癌手术，没有疾病表现手术后1-20年的37名患者接受外周血检查，通过流式细胞术检查上皮细胞存在情况。在一年时间内，从这些患者获取多达7个外周血样品。在表VI中，列出每个患者，并根据手术时的TNM(肿瘤，淋巴结，以及转移)阶段以及手术后多年的TNM阶段进行分类。表VI还显示所述患者是否在研究期间接受治疗(化疗或激素治疗)。在过去有远程转移的迹象、但在研究开始时完全缓解的6名患者中，有3名患者血液内上皮细胞的频率比对照组中上皮细胞的频率更高。在31名没有远程转移迹象的患者中，9名患者体内有循环上皮细胞。
在这9名患者体内通过流式细胞术在上皮细胞典型的区域内检测到的少量事件并不证明这些事件是肿瘤细胞。通过将免疫磁性分离的细胞置于载玻片上获得的细胞学极大地帮助评价它们的同一性，如图8所示。图8A显示对细胞角蛋白染色表现阳性的两个细胞，所述两个细胞从在取血时没有转移疾病的迹象的患者获得。图8B显示一个细胞，所述细胞得自一名过去有转移疾病、但已经完全缓解的患者。在图8C和8D中，显示在时间点6从患者25的血液中分离的两个细胞。在图8C中显示的细胞具有与恶性肿瘤一致的特征，而图8D内的细胞具有正常鳞状上皮细胞的外观。
表VI通过流式细胞术在10ml外周血中鉴定的上皮细胞的数目，所述外周血来自接受治疗性乳腺癌手术后没有疾病迹象的患者以及32名对照。
TNM＝肿瘤，淋巴结，转移Ys＝第一次手术后的年数Tx＝疗法，CT＝化疗，H＝激素疗法，-＝无治疗1，2，3，4，5，6＝随后的时间点，多年在所述时间点确定上皮细胞的数目实施例5计算患者体内的循环上皮细胞，所述患者在手术治疗前诊断患有乳腺癌。
表VII综述在下面相似的临床试验中获得的结果，在所述临床试验中使用本发明的测定评价13名对照以及30名乳腺癌患者。在对照个体中，20ml血液内上皮细胞的数目从0个到5个(平均1.5个，S.D.＝1.8)。与此不同，对于14名患有局限于器官的乳腺癌的患者(分类为TxN0M0)，20ml血液内平均有15.9个上皮细胞，S.D.＝17.4，对于有淋巴结累积的患者，则是47.4个，S.D.＝52.3，对于有远程转移的患者，则是122个，S.D.＝140。对照组与有或没有远程转移的乳腺癌患者之间的差异是非常显著的[根据多参数分析(Kruskal-Wallis)，P＝0.001]。在局限于器官的组以及远程转移组之间的差异是0.009(t检验)。在14名患有局限于器官的乳腺癌的患者中，有12名患者血液中的上皮细胞数目在截断点以上(对照组的平均值加3SD＝6.9)。此外，对照组中没有个体有超过5个分类为上皮细胞的事件，而14名患有局限于器官的乳腺癌的患者中仅有二人有少于7个所述事件。
表VII临床数据小结
使用流式细胞术分析来自对照个体以及患有乳腺癌的妇女的20ml血液中的阳性事件。根据t检验(P≤0.01)和Kruskall-Wallis无参数分析(P＜0.001)，对照血液中的上皮细胞数目与三组乳腺癌患者的每一组都有统计学差异。使用上表中的数据为阳性样品建立初步的截断值。如下确定该值求正常对照(n＝13)中循环上皮细胞数目的平均值，然后加上三倍SD。该平均值是1.5，SD是1.8。截断值1.5+5.4＝6.9。在雄性对照和雌性对照之间没有统计学差异。
实施例6监测转移CAP患者体内的CTC三名转移前列腺病患者在接受化学治疗后，评价他们血液中循环上皮细胞的存在。结果示于图9。数据揭示血液中循环上皮细胞的增加与疾病活动性相关。
选择十名患者，以0、1、2、7、12、17和25周的间隔顺序接受CTC和PSA的测试。八名患者患有激素无效疾病，一名拒绝接受激素治疗，一名患有激素敏感性疾病。图10显示所述患者在每个点的CTC和PSA水平。所述激素敏感性患者的PSA水平在研究期间低于0.1ng/mL，CTC数目除最后一个时间点外与对照相当，在最后一个时间点测量到14个肿瘤细胞(图10A)。1周后重复的CTC计数是15，这证实早前的观察。在该患者身上没有观察到提示疾病发展的体征或症状。三名患者有缓慢的疾病发展(图10B-D)。这些患者的平均CTC计数与对照组在统计学上有显著差异(3.0±3.0肿瘤细胞/7mL，P＝0.002，n＝25)。在25个样品中，有6个样品的CTC数目是5个或5个以上/7mL。通过正向光散射评价CTC大小，在有5个或以上CTC的样品中，77％±15％的这些细胞大于10μm。六名患者在研究期间有疾病发展。在这些患者中，有四名患者的CTC值和PSA值显示于图10E-H。平均CTC计数与对照有明显差异(范围从1到283，n＝22，平均45±65个CTC/7mL)，并且与有缓慢发展的疾病的患者在统计学上有显著差异(P＝0.008)。在22个样品中的19个样品，CTC计数是5或以上，并且51％±17％的CTC大于10μm。在该组患者中，CTC的增加与PSA水平的增加平行。
两名接受基于雌莫司汀和紫杉烷化学治疗的患者体内的CTC计数与对照组以及有缓慢疾病发展的患者有明显差异(范围从14到218，平均104±68个CTC/7mL)。这些患者中仅有32％±13％的CTC大于10μm。通过t检验对三个患者组中CTC大小的比较显示组1和组2之间有显著差异(P＝0.004)，组1和组3之间有显著差异(P＝0.0001)，组2和组3之间有显著差异(P＝0.0008)。在图11中显示这两名患者的CTC值和PSA值以及给予化学治疗。CTC的波动与给予化学治疗同时发生。CTC的相对变化比PSA的相对变化更明显，并且在两个图中，CTC计数与PSA水平平行。然而，实际相关性低(图11A，R＝0.17，图11B，R＝0.46)。
本发明的方法可以定量CTC，并且可以使用本发明的方法评价HRPC发展期间CTC的变化。体外PC3细胞掺入实验显示强线性相关性(R2＝0.99)和极好的回收率(74％±9％)。通过分析22名正常男性供体的血液，确定检测限为在7.5mL血液中有0.8±1.2个细胞。
一克肿瘤流出约106个细胞进入血液。我们观察到在局部化CAP中可以发现CTC，这与前面评价局部化乳腺癌的实施例一致。选择十名患者，在6个月内顺序测定CTC载量和血清PSA水平。患者每周接受一次测试，共三个疗程，然后约每5周接受一次测试，共6个月。评价四名患有早期激素抗性前列腺癌(HRPC)(n＝3)或激素敏感性疾病(n＝1)的男子。他们的CTC计数低(3.0±3)，但与对照组显著不同(P＜0.002)。总而言之，CTC计数趋势并不显著上升，并且该趋势与PSA模式同时发生，但激素敏感性疾病患者除外(图10A)。该患者CTC计数在第17周突然上升到14个细胞/7mL血液，并在1周后证实该情况，这提示这是一个真实的生物学事件。仍然需要确定CTC水平的快速增加是否在生物化学PSA降低之前发生。
其他四名男子患有快速发展的转移疾病或HRPC。他们的CTC计数显著高于(图10E-H)早期HRPC组。血清PSA值和CTC值看起来是相关的。然而，它们计算得到的相关性不同(图10A，R＝0.42；图10B，R＝0.67；图10C，R＝0.65和图10D，R＝0.98)。在图10E显示的患者出现更不相称的相关性(R＝0.42)，该患者死于转移CAP引起的尿毒症昏迷，所述转移CAP由于严重腹膜后疾病引起阻塞性尿路病。我们假定代谢紊乱可以在第1周已经引起CTC计数的突然短暂下跌。图10H中显示的患者出现最强的相关性(R＝0.98)。该患者有升高的PSA水平，密切地反映出CTC计数的明显提高。他继续发展出系统性的进展，但拒绝接受化学治疗。
在10名接受化学治疗的两名患者中，化学治疗对血清PSA水平以及CTC计数有类似形式的影响(图11)。这些患者维持CTC数目，该数目的范围从14到218个肿瘤细胞/7mL。在两个病例中，我们观察到在给予第一次泰索帝剂量1周后CTC计数有实质性的降低，该降低与PSA水平的下降平行。虽然泰索帝的剂量持续，但两名患者都表现CTC以及PSA水平的显著提高。图11B所示患者随后转用泰素，图11A所示患者继续使用泰索帝。他们的CTC计数在第7周到第12周都降低，所述降低不合理地伴随着升高的PSA水平或未改变的PSA水平。完成化学治疗后八周，观察到CTC以及PSA水平的升高。这些观察指出与PSA水平相比，CTC计数能够提供独立的预后信息。
在患有更晚期疾病的男子体内，平均CTC大小更小。化学治疗改变CTC的数目，但不改变CTC的大小，因为我们在给予化学治疗之前、期间或之后没有发现提示细胞降解的CTC大小改变。
我们得出结论在HRPC患者体内能够可重复地测量CTC计数。CTC水平的改变反映疾病进展。CTC和PSA升高的模式和速度不同，这提示CTC提供不受PSA影响的预后信息。更重要的是，表征CTC基因型和表型能够指导未来的治疗，并阐明化学敏感性和抗性的机制。
实施例7在结肠癌患者体内，疾病活动性与循环上皮细胞的数目相关可以有利地使用本发明的测定方法评价患有多种不同癌症类型的患者。为阐明这一点，还使用所述方法评价结肠癌患者体内的循环上皮细胞水平。美国每年诊出超过130,000例新出现的结肠直肠癌。这些患者中有30-50％会出现疾病复发并死于该疾病。由于很少能在治疗前和治疗后进行肿瘤活组织检查以记录药物效果，因此新治疗方法的合理发展受到阻碍。
在手术前和手术后评价没有转移迹象的结肠癌患者体内循环上皮细胞的存在。结果显示于图12，在表IX中综述。数据揭示结肠癌患者体内的循环上皮细胞数目在外科手术前更高。
表VIII在没有转移迹象的结肠癌患者体内的循环上皮细胞
表X和图13描述评价有转移迹象的结肠癌患者体内循环上皮细胞的存在和数目时获得的数据。结果揭示与手术后患有局部化疾病的患者相比，患有转移疾病的患者体内外周血中上皮细胞的数目更大。所述结果进一步显示转移疾病的程度可能与循环上皮细胞的数目相关。
表IXA在有转移迹象的结肠癌患者体内的循环上皮细胞
由于很少能重复肿瘤活组织检查以进行体内药效评价，因此抗癌药物的合理临床发展受到阻碍。本发明的方法通过评价药物对循环肿瘤细胞的效果，克服该局限性。进行另外一项小规模试验，评估本发明的免疫磁性分离和自动化萤光显微镜系统对于从转移结肠直肠癌患者(pts.)的外周血分离、计算和表征循环上皮细胞的能力。招募二十名患有可测量的转移疾病的患者。在治疗开始时和疾病再评估时间点(6-10周间隔)获取50ml外周血。此外，从四名患者获取新鲜肿瘤，通过流式细胞术和基因阵列比较循环的以及原位的癌症细胞。患者特征是7M/13F，年龄中值为64(范围从41到80)。转移疾病时间中值为2.7m(范围从0.6到25m)。十一名患者之前接受过针对转移疾病的化学治疗。转移疾病的位点包括肝(13名患者)、肺(8名患者)、腹膜(5名患者)、小肠以及前腹壁(各1名患者)。最大转移病灶直径的中值是5cm(范围从1.5到12cm)。在用缀合铁磁流体的抗上皮细胞粘着分子(EpCAM)标记循环上皮细胞后，从全血中分离标记的细胞。根据用抗细胞角蛋白标记的流式细胞术测定，回收上皮细胞数量的中值是7个/7.5ml外周血(范围从3到150个)。该研究的结果显示于表IXB。
表IXB表征转移结肠癌患者的循环上皮细胞患者特征(N＝20)
也可以按照本发明的方法，另外通过流式细胞术针对表皮生长因子受体和胸苷酸合酶表达确定表型，评价该技术对于体内药效评价的适用性。本研究已经证明从转移结肠直肠癌患者的血液中分离循环肿瘤细胞的可行性。此外，本发明包括评价方法，用于评价循环肿瘤细胞相对于在肿瘤内原位存在的肿瘤细胞的改变。所述改变可以包括，例如，肿瘤性相关分子的获得或失去。也可以检查基因型或表型的改变。
上面的实施例证明健康个体以及乳腺癌、前列腺癌和结肠癌患者之间在循环上皮细胞数目上有非常显著的差异。此外，在没有可检测的扩散、扩散到局部淋巴结以及远程转移的患者之间，循环上皮细胞的数目存在显著差异(Racila等，(1998)，同上)。此外，在一年时间内，监测在手术移除原发性乳腺癌后患者血液内的上皮细胞数目。在这些患者的其中一些人体内检测到残余的疾病。在患有转移疾病的患者体内，外周血肿瘤细胞计数与肿瘤荷载量以及对治疗的反应相关。这些研究的结果揭示本发明的基于细胞的测定有潜力作为客观的非侵袭性工具，检测恶性肿瘤的存在并测量疾病的活动性。细胞形态学和免疫表型揭示所述分离细胞的恶性性质。
实施例8鉴定分离的上皮细胞的组织来源所有前面在患者体内进行的研究揭示与正常个体或没有癌性疾病(包括良性肿瘤)的患者相比，癌症患者体内有过量的循环上皮细胞。然而，必要的是证明这些过量的循环上皮细胞事实上是癌症细胞。这可以通过如下实验完成将从患有癌症或没有癌症的患者免疫磁性纯化的上皮细胞离心到玻璃载玻片上，然后用抗粘蛋白处理。此外，也离心从正常个体的包皮和血液获取正常的上皮细胞，都用作对照。重要的是对载玻片进行标记并“盲法”检查，并且观察者接受过病理学的训练，并且包括正常上皮细胞。如在图8中可以看到的，在分离的癌症细胞和正常上皮细胞之间有显著差异。正常上皮细胞的核与细胞质的比例低，即有丰富的细胞质和相对小的核。所述核显示染色质的均匀分布。所述细胞不对抗粘蛋白染色。与此不同，来自两名乳腺癌患者的细胞有非常大的核以及一小圈细胞质。此外，如核内的暗色斑点所示，染色质瓦解，并且所述细胞被抗粘蛋白强染色。在来自两名前列腺癌患者的细胞中观察到同样情况。向一名接受过病理学训练的医师展示从患或不患癌症的患者获得的有编码的载玻片(总共21块载玻片)。这名接受过病理学训练的医师正确鉴定出没有肿瘤细胞的来自所有对照的血液，并且在第二次观察载玻片时没有出现观察错误。在两名前列腺癌患者的情况下，在研究中没有观察到肿瘤细胞。重新检查一片载玻片，观察到肿瘤细胞。这种不一致的原因看起来是扫描所述细胞涂片所花费的时间。总而言之，细胞形态学和免疫表型指出在癌症患者血液中存在的过量上皮细胞确实是癌症细胞。
上面描述的实验指出本文公开的方法能够检测在早期肿瘤患者血液中的癌症细胞。实际上，在27名临床确诊有局限于器官的疾病(早期癌症)的患者中，我们在25名患者的血液内检测到癌症细胞的存在。这意味着所述测定应当更早地检测到那些通过常规方法通常更晚才检测到的实体瘤(109-1010个肿瘤细胞)。此外，所述测试应当允许更早地检测乳腺癌、前列腺癌和结肠癌，可能在通过常规方法检测到原发性肿瘤之前就检测到上述癌症。可以如下确定血液中来源于前列腺的肿瘤细胞用抗前列腺特异性膜抗原(PMSA)、抗PSA(前列腺特异性抗原)或其它特异性针对男性患者中前列腺的抗体进行染色。对于女性患者体内的乳腺癌，用抗乳房球蛋白、抗黄体酮受体、抗雌激素受体以及抗乳脂球蛋白抗原I和II染色将指示出肿瘤的乳腺来源。
我们的测试应当从其它器官来源检测到癌症细胞，所述其它器官来源例如胰腺、食道、结肠、胃、肺、卵巢、肾等。下表显示例子，在所述例子中，在几名患有并非乳腺癌和前列腺癌的癌症患者体内观察到过量上皮细胞。
表X每20mL血液 癌症诊断内的细胞数目8 子宫腺癌(1B期)11头颈部腺癌15肺小未分化(Lung small undifferentiated)14颈部鳞状细胞癌上表中所述的每一种癌症都表达组织特异性抗原，可以使用所述抗原对应的抗体确定循环肿瘤细胞的器官来源。
图14是一个过程简图，显示原发性肿瘤细胞到转移癌症的进展。也可以使用本发明的血液测试来检测以前已经成功治疗癌症、目前长期没有症状的患者体内的癌症细胞。实际上，在五年或更早以前已经治疗癌症并且在临床上没有肿瘤的患者体内已经检查到循环上皮细胞(即休眠的肿瘤细胞)。这解释了为什么患者体内的复发可以出现在明显成功治疗的多年以后，甚至几十年以后。事实上，不断累积的证据提示乳腺癌的复发以缓慢稳定的速率出现，约在乳房切除术后10-12年。
实施例9检测在高PSA水平以及活组织检查显示阴性的患者的血液中的肿瘤细胞如前面实施例所指出的，可以有利地利用本发明来诊断目前无症状的患者体内的癌症。为说明这一点，一名有两年高PSA水平(＞12μg/ml)病史的患者在下文陈述的分析前接受前列腺的针刺活组织检查。该活组织检查并未揭示恶性肿瘤的存在。还需要注意的是在18个月以前进行的前一次活组织检查也是阴性的。
在取20ml血液样品以前，对所述患者进行数字直肠检查，并柔和地按摩他变大的前列腺，以增加肿瘤细胞在血液中的出现。使用本发明的方法富集所述样品。使用Wrights-Giemsa染色，通过显微镜检术检查所富集的组份。对所述分离细胞的形态学检查揭示它们的恶性特征。这名患者无疑患有癌症。假定观察到的高PSA水平，可能诊断出前列腺癌。可以使用本文所述的合适试剂确定所述细胞的来源。本实施例的结果揭示可以使用本发明的方法检测在其它情况下可能未检测到的癌症。
作为增强所述血液测试的灵敏性的方法，使用局部按摩促进肿瘤细胞流入血液的想法是有相当优点的构思。通过该方法释放入循环中的细胞在分离后可用于多种不同目的。在使用铁磁流体分离细胞的情况下，可以容易地培养和/或克隆分离的细胞。可以使用得到的细胞系评价多种恶性细胞特征，例如化学治疗敏感性以及生长因子依赖性。
实施例10监测在分离的循环肿瘤细胞中的生物化学变化在癌症发展期间，肿瘤细胞的遗传不稳定性产生有选择性生长优势的新集落，这可能导致肿瘤细胞主要表型随时间而变化。一个这样的例子是HER-2(c-erbB2)原癌基因的扩增，所述扩增导致其编码的上皮细胞生长因子跨膜蛋白受体的过量表达。本研究的目的是确定是否能够根据晚期乳腺癌患者血液内的循环肿瘤细胞(CTC)定量HER-2受体，以及HER-2表达模式是否在治疗期间改变。该信息应当使临床医师能够预测昂贵的新的靶向治疗的结果。虽然本文使用HER-2作为例子，但非常需要以这种方式鉴定和评价在肿瘤细胞上的其它肿瘤性相关分子。表XI陈述了在分离循环肿瘤细胞后可以评价的合适的肿瘤性相关分子。检测肿瘤性相关分子(如与恶性肿瘤有关的核酸或多肽/蛋白)的改变的示例性的方法包括a)比较样品中预定核酸的序列以及对应的野生型核酸序列，确定来自患者的所述样品是否包含突变；或b)在来自患者的样品中，测定是否存在肿瘤性相关分子多肽，如果存在，则确定所述多肽是否是全长的，和/或发生突变，和/或以正常水平表达；或c)使用DNA限制作图法，比较当限制酶切割来自患者的肿瘤性相关分子核酸的样品所产生的限制模式以及从同源的正常基因或从其已知突变获得的限制模式；或d)使用能够结合肿瘤性相关分子核酸序列(正常序列或已知的突变序列)的特异性结合成员，所述特异性结合成员包含可以与所述序列杂交的核酸，或者包含具有抗体域的物质，所述抗体域对天然或突变核酸序列或所述核酸序列编码的多肽有特异性，所述特异性结合成员受到标记，以便能够检测到所述特异性结合成员于其结合配体的结合；或e)使用涉及基于正常或突变基因序列的一个或多个引物的PCR，筛选来自患者的样品中正常或突变的基因序列。
可以使用常规方法评价蛋白分子变化，如那些由于编码核酸中的缺失或点突变而产生的改变，所述常规方法是本领域内一般技术人员众所周知的。所述方法包括凝胶电泳、蛋白质印迹分析、HPLC和FPLC。也可以使用常规方法评价与恶性肿瘤有关的核酸分子变化。
也可以评价在膜糖蛋白上糖类部分内的改变。在Ausubel等，同上的第17章中提供分析糖缀合物以及其上的糖的方法。
在本发明的方法中，评价外科手术切除的原发性肿瘤组织中有限数目基因和/或蛋白的表达。使用乳腺癌作为例子，所述肿瘤性相关分子可以包括HER-2、雌激素以及孕激素的受体。随着疾病的发展，出现问题，因为在原始诊断后常常出现肿瘤细胞表型的改变，并且只有在治疗失败后才能推断出对治疗的抗性。在治疗之前和期间评价CTC表面靶肿瘤性相关分子的存在构成对肿瘤实时、“整体”的活组织检查。考虑到这些目标，发展出一种测定，所述测定既能计算CTC数目，又能定量和表征在肿瘤细胞表面或内部肿瘤性相关分子的表达。在本实施例中，我们描述来自患有转移乳腺癌的患者的血液的CTC表面上HER-2表达的改变。
提供下面材料和方法，以便利实行实施例10。
患者群体在Lombardi Cancer Center of Georgetown University进行本研究。从一个更大的包括24名妇女的组选出参与本研究的患者，所述24名患者患有III期或转移乳腺癌，参加监测治疗期间CTC波动的初步研究(Walker等Proc.Am Soc.Clin.Onc.(2001)19-54b)。在本研究中包括十九名可以获得原发性组织块的患者。所有患者都患有可测量的疾病，并且或者最近被诊断为III期患者、准备开始新佐剂化学治疗，或者是记录有进行性转移乳腺癌、准备开始新的内分泌治疗、化学治疗或实验治疗的患者。由治疗医师自由决定疗法的选择。CTC测定结果既不告知医疗医师，也不告知患者。从二十二名21岁或年龄更大的妇女收集血液标本，作为对照。该研究方案得到IRB的批准。分别从患者以及正常对照患者取得同意或许可。
临床评价在可行的时候，进行两次招募前的评价。第一次评价在进入研究后的4周内，第二次评价(基线)在开始治疗之前进行。记录当前病史，并由临床肿瘤学家进行身体检查。血液学分析包括分化的CBC以及血小板计数；生物化学包括尿分析、BUN、GOT、GPT、LDH、肌酸酐、碱性磷酸酶和总胆红素/直接胆红素。根据物理测量(测径器或直尺)和/或成像研究(CT扫描、MRI、骨扫描等)作出肿瘤评价。使用Union International Contra Cancer(UICC)标准(Monfardini等编辑UICC-Manual of Adult and Pediatric Medical Oncology，Berlin，Germany，Springer 1987，第22-38页)定义治疗反应的评价，并且在不考虑CTC/CTC HER-2结果的情况下进行所述评价。取血时间以及临床状态的评价取决于个体的治疗方案。所有血液样品都取在10mlACD Vacutainer管(Becton-Dickinson，NJ)中，室温下维持，并连夜送到Immunicon。收集样品后24小时内进行处理。
HER-2染色组织块收集来自患者原发性肿瘤的组织块，从石蜡包埋的组织切片制备载玻片。使用HercepTest(DAKO，Carpinteria，CA)，根据厂家指导，根据所述载玻片评价HER-2的表达。由同一名病理学者检查阳性和阴性载玻片，根据厂家的指导，使用从0到3+的等级进行评分。
样品制备将5ml血液样品转移到内径17mm的一次性管(Fisher Scientific，USA)内，打开制动装置，在800g离心10分钟。加入含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)，定容到10ml，然后倒置混合样品。如以前所提到的，特异性针对上皮细胞粘着分子(EpCAM)的单克隆抗体(Mab)与上皮细胞来源的组织有广泛的反应性。Mab VU-1D9识别EpCAM，将其与磁性纳米颗粒(铁磁流体，Immunicon，HuntingdonValley，PA)偶联。为增加EpCAM+细胞的“磁性载量”并降低由于细胞表面EpCAM密度差异引起的捕获效率的可变性，将脱硫生物素偶联到EpCAM标记的磁性纳米颗粒，形成前面实施例所述的CA-EpCAM。然后将CA-EpCAM铁磁流体以及包含链霉抗生物素的缓冲液加入样品，达到所述细胞磁性标记的增加。随后用生物素(包含在下文所述的渗透缓冲液内)取代所述CA-EpCAM铁磁流体上的脱硫生物素，由此逆转所述CA-EpCAM铁磁流体之间的交联。立即将所述样品置于由四块相对的磁铁组成的磁性分离器(QMS17，Immunicon，Huntingdon Valley，PA)中10分钟。10分钟后，从分离器中取出管，颠倒5次，然后放回所述磁性分离器10分钟。重复该步骤一次，然后将所述管放回所述分离器20分钟。分离后，吸出并弃去上清。从所述磁性分离器中取出管，用3ml含BSA的PBS重悬浮从管壁上收集的组份。将所述悬浮液置于磁性分离器中10分钟，然后吸出并弃去上清。将细胞重悬浮于200μl含生物素的渗透缓冲液(Immuniperm，Immunicon Corp.)中，在其中加入饱和条件的Mab-萤光染料缀合物。所述Mab包括缀合藻红蛋白(PE)的识别角蛋白4、6、8、10、13和18的抗细胞角蛋白Mab C11(Immunicon Corp.)、多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)标记的抗CD45(Hle-1，BDIS，San Jose，CA)和花青5(CY5)标记的抗HER-2。所述Mab抗HER-2名为HER-81，识别HER-2胞外结构域上的一个表位，并且不与曲妥单抗或其小鼠原4D5交叉封闭。它是一种小鼠IgG1k，与BT474乳腺癌细胞的Kd是10-10M。将所述细胞与所述Mab温育15分钟后，加入2ml细胞缓冲液(PBS，1％BSA，50mM EDTA)，通过磁性分离所述细胞悬浮液10分钟。弃去未分离的悬浮液后，将收集的细胞重悬浮于0.5ml PBS中，在其中加入用于Procount系统的核酸染料(Procount，BDIS，San Jose CA)。此外，在所述悬浮液中加入10,000个萤光计数珠，证实所述分析样品的体积(Flow-Set Fluorospheres，Coulter，Miami，FLA)。
细胞系在瓶内培养前列腺癌细胞系PC-3和乳腺癌细胞系SKBR-3的细胞，所述瓶内包含10ml补充了10％FCS的RPMI-1640。用胰岛素处理后从瓶中收获细胞，洗涤，重悬浮，获得所需的细胞浓度。为定量评价这两个细胞系的HER-2密度，用缀合PE的Mab HER-81(HER-2PE)染色20,000个细胞。为校正HER-2的表达水平，将100μl含约3,000个细胞的细胞悬浮液掺入5ml血液中。
样品分析在配备488nm Argon离子激光和635nm激光二极管的FACSCalibur流式细胞仪(BDIS，San Jose，CA)上分析样品。使用针对核酸染的萤光设定的阈值，用CellQuest(BDIS，San Jose，CA)进行数据获取。分析8000个珠或80％样品后停止获取数据。对列表式数据进行多参数数据分析(Paint-A-GatePro，BDIS，San Jose，CA)。分析标准包括正向光散射确定的大小、正交光散射确定的颗粒性、用PE标记的抗细胞角蛋白Mab染色为阳性以及不被PerCP标记的抗CD45Mab染色。对于每个样品，在上皮细胞典型区域内存在的事件数目都乘以校正系数1.25，以补偿未被流式细胞仪分析的样品体积。用已知数目的萤光染料分子(QuantiBRITE PE，BDIS，San Jose，CA)校正流式细胞仪，使用藻红蛋白(PE)标记的珠评价细胞表面的HER-2密度。然后测量用PE-抗-HER-2在饱和条件下处理的细胞的萤光强度，评价在乳腺癌细胞系SKBR以及前列腺癌细胞系PC-3表面的HER-2密度。SKBR-3和PC-3细胞表面HER-2受体的平均数目分别是850,000个和9,500个。
计数CTC的数目为获得计数CTC数目所需的灵敏度，需要组合使用多种技术。首先，如下制备血液中EpCAM+细胞的富集样品将细胞与用特异性针对EpCAM的Mab包被的胶体顺磁性颗粒混合，然后进行磁性分离。进行所述免疫磁性样品富集步骤，以减少样品体积和背景造血细胞的数目。然后用PE-抗细胞角蛋白标记其余的细胞以鉴定上皮细胞，用PerCP-抗CD45标记以鉴定白细胞，用Cy5-抗HER-2标记以确定HER-2的表达，随后加入核酸染料以排除残余的红细胞、血小板和其它无核“事件”。在样品制备过程中使用磁性分离(即洗涤)，以除去多余的标记试剂、减少残存的非靶细胞以及允许重悬浮细胞于所需体积。通过流式细胞术分析所述样品，通过两种光散射以及四个萤光参数表征每个事件。图15(图A-D)是流式细胞术分析的一个例子，在该例子中分析从一名转移乳腺癌患者获得的5ml血液样品。图15A显示PerCP-抗CD45与PE-抗细胞角蛋白的相关信息；图15B显示PE-抗细胞角蛋白与核酸染料的相关信息；图15C显示正向散射和右角度散射，图15D显示Cy5-抗HER-2与PE-抗细胞角蛋白的相关信息。在图中描述珠和白细胞的位置，并用黑色标出。在图15A、15B和15C中画出的门指示CTC典型的区域(CD45-，细胞角蛋白+，＞4μm，核酸+)。鉴定为CTC(突出的黑色小方块)的事件必须都落在所有这三个区域内。所有其它事件由碎片组成，用灰色描述。假如CTC超过白细胞的背景染色，则认为它们是HER-2+，如图15D中的点线所示。使用图中显示的同样的门分析本研究中的所有样品。在从22名对照获取的5ml血液中，在分类为CTC的区域内检测到每名患者有1.5±2.1个事件。这些事件中没有一个事件与HER-2的表达有关。与此不同，在来自患有可测量的疾病的患者的19个血液样品中，在10个样品内检测到5-214个CTC/5ml，所述患者正开始接受初期治疗或新的疗法。
HER-2在CTC表面的表达为校正CTC表面的HER-2表达水平，在5ml血液内掺入SKBR-3细胞(约850,000个HER-2受体)以及PC-3细胞(约9,500个HER-2受体)，处理后进行CTC分析。根据细胞角蛋白和CD45表达的独特分布鉴定白细胞、PC-3细胞和SKBR-3细胞。图16A显示每种细胞群体Cy5-抗HER-2染色的萤光强度。将CTC表面HER-2的表达水平分成四类(1)白细胞典型的无表达[少于5,000个受体(-)]，(2)PC-3典型的低表达[5,000到50,000个受体(+)]，(3)中等表达[50,000到500,000个受体(++)]以及SKBR-3典型的高表达[＞500,000个受体(+++)]。图16B、图16C和图16D显示来自三名乳腺癌患者的CTC表面细胞角蛋白和HER-2的表达。图16B所示患者的大部分CTC有低水平表达的HER-2，同时少数缺乏HER-2。在图16C所示患者的CTC表面发现所有水平的HER-2表达。图16D所示患者体内的CTC看起来分为不表达或表达低水平HER-2的CTC以及表达高水平HER-2的CTC。在所有情况下，表达高水平HER-2的CTC表达相对低水平的细胞角蛋白。表XI显示19名乳腺癌患者的治疗形式、治疗反应、原发性组织中的HER-2表达、活组织检查以及评价CTC之间间隔的月份、基线和治疗后CTC以及HER-2在CTC表面的表达。评价诊断时获得的原发性肿瘤组织块内的HER-2表达。在诊断(肿瘤活组织检查)以及测定CTC之间间隔的时间变化非常大(表XI)。根据Herceptest染色，在19名患者中，有七名患者的组织块对HER-2染色阳性(2+或3+)。在这7名患者中，在6名患者体内检测到CTC，在所有这6名患者中，CTC都表达HER-2(表XII)。一名患者的CTC表达HER-2，但组织切片却不表达HER-2。表达HER-2的CTC百分率以及CTC表面HER-2的密度变化相当大。
表XI晚期乳腺癌患者的数据的小结
Pt#＝患者编号。反应分类P＝恶化，R＝完全或部分反应，S＝稳定。Rx＝治疗Do＝阿霉素，Cy＝环磷酰胺，Flu＝氟甲睾酮，Go＝醋酸戈舍瑞林，An＝阿那曲唑，Exe＝依西美坦，Meg＝醋酸甲地孕酮，Tam＝他莫昔芬，Cap＝卡培他滨，Ta＝紫杉醇，Tr＝曲妥单抗；时间(月)组织/CTC＝组织活组织检查以及评价CTC之间间隔的时间。
CTC-＝＜5个CTC/5ml血液；+＝5-10个CTC/5ml血液；++＝10-100个CTC/5ml血液；+++＝100-1000个CTC/5ml血液。
CTC表面的HER-2-＝＜25％的CTC表达HER-2；+＝25-50％的CTC表达HER-2；++＝50-75％的CTC表达HER-2；+＝75-100％的CTC表达HER-2；na＝由于没有检测到CTC，因此无法应用。为了总结，我们将HER-2表达分类为CTC表达HER-2的百分率。在随后的图中，显示四个时间点处于四种不同密度的CTC的实际数目。
治疗期间的CTC计数以及HER-2在CTC表面的表达八名患者的疾病发展，4名患者疾病保持稳定，7名患者对治疗有反应(表XI)。在三名患者中，治疗开始时在CTC表面没有检测到HER-2表达。在所有这三名患者接受监测期间，他们的疾病发展。在随后的测量中，CTC增多，并且部分CTC表达HER-2(表XI)。图17显示在治疗前和治疗期间在这三名患者体内检测到的CTC数目。箭头指出治疗时间。在长条内指出缺乏(0)HER-2的CTC的数目、表达低水平(+)HER-2的CTC的数目、表达中等水平(++)HER-2的CTC的数目或表达高水平(+++)HER-2的CTC的数目。
HER-2-，
HER-2+，
HER-2++
HER-2+++)。
在疾病发展的三名患者体内，HER-2在CTC表面以基线水平存在，并且表达HER-2的CTC的百分率并不显示明显变化(图18)。在图18A和18B显示的患者体内，CTC在治疗期间稳定增多。在图18C显示的患者的血液内，CTC实质上更少，并且在治疗期间并不增多。图19显示随访期间疾病保持稳定的另外三名患者在治疗前、治疗期间和治疗后检测到的CTC数目。在图19A显示的患者的血液中，CTC数目增加，而另两名患者体内的CTC降低，但在治疗后仍然能够检测到。我们关注的图19C所示的患者接受曲妥单抗以及紫杉酚治疗。98％的CTC在治疗前表达低水平到中等水平的HER-2。开始治疗四周后，CTC数目从214降到79，并且仅有14％表达HER-2。CTC数目在治疗过程中继续降低(23、13和11个CTC)，并且表达HER-2的CTC百分率分别增加到78％、100％和54％。虽然观察到CTC的明显减少，但根据在治疗过程后进行的CT以及骨扫描确定患者的临床状态(稳定的疾病)。
讨论最近曲妥单抗(Herceptin)获得批准用于治疗患有过量表达HER-2的乳腺癌的妇女，这为所述疾病的患者可用的疗法增加了一种重要的治疗方案(Baselga等Proc.Am.Soc.Clin.Onc.(1995)14103a；Pegram等J.Clin.Oncol.(1998)162659-71；Cobleigh等J.Clin.Oncol.(1999)172639)。所述靶向疗法的发展和利用需要“实时”准确、灵敏、有特异性并且可靠的体外诊断测定。所述测定必须能够不仅检测出有可能从给定疗法受益的患者亚群，而且检测出已经对该治疗发展出抗性的患者亚组。目前曲妥单抗疗法的候选资格需要或者通过免疫组织化学(肿瘤显示阳性HER-2染色)得到的阳性诊断，或者通过萤光原位杂交(FISH)确定的HER-2基因扩增的证据而得到的阳性诊断。除涉及这两种技术的准确性和灵敏度的争议外(Lebeau等，J.Clin.Oncol.(2001)19354-363；Kakar等Molecular Diagnosis(2000)5199-207)，这两种技术没有一种检测从初步诊断的时间到检测疾病复发的时间之间肿瘤表型的变化。在疾病临床期间发生的肿瘤基因型和表型的变化已经有文献记载(Vogelstein等N.Engl.J.Med.(1988)319525-532；Pihan等Cancer Res.(2001)612212-2219)，应该在开始昂贵的靶向疗法前测定这种变化。由于大多数(75％)乳腺癌转移是内部的(骨、肝、肺等)，因此病况和获取常规活组织检查的费用是令人望而却步的。在本实施例中，我们已经显示可以使用从血液中分离的上皮细胞定量分析肿瘤性相关分子的存在。癌症患者体内这些细胞数目的增加指示出它们是肿瘤细胞。如本文证明的，可以使用血液内CTC数目来评价肿瘤进展。发明人以前的研究已经揭示一天内在几个时间点测量的CTC并不变化，而在疾病发展的更长时间内，发现CTC数目在实质上增加。在本研究中，从19名III期和IV期乳腺癌患者的10名患者的5ml血液内检测到CTC。为增加在体内可以检测到CTC的患者的频率，可以应用更大的血液体积以及使样品制备程序自动化，以增加所述测定的灵敏度。来自患有过量表达HER-2的肿瘤的患者的CTC是HER-2+，这个观察支持所述测定的理论依据。更重要的是在三名患者中，观察到从HER-2-到HER-2+CTC的表型转化。在开始新的治疗之前在CTC表面没有检测到HER-2的过量表达，但在治疗期间数目同时实质增加的CTC表面检测到HER-2的过量表达。转化为HER-2+CTC可能意味着转化到更有侵袭性的表型。HER-2的表达与细胞角蛋白(与细胞分化有关的细胞骨架蛋白)的表达成反比关系，这个观察支持这一假说(Schaafsma等，在Rosen，P.P.，Fechner，R.E。编辑Pathology Annual第29卷(1994)第21-62页)。因此，就选择HER-2靶向疗法和化学治疗而言，检测HER-2变化的能力有临床重要性。
总而言之，我们已经显示可以通过CTC水平的变化评价乳腺癌患者的临床状态，并且可以定量评价这些细胞上的抗原靶。该信息对于尝试“定制”对个体患者疾病的治疗可能是有益的。虽然本文使用HER-2作为例子，但当肿瘤细胞变得更恶性时可能出现许多其它肿瘤性相关分子和标记的改变。表现与恶性肿瘤相关的改变的分子包括但不限于mdr、胸苷酸合成酶、FSFR、p53、ras癌基因、CD 146、src、MUC1、uPA、PAI-1、ACT和许多其它分子。以前已经描述与癌症有关的染色体易位、关键细胞信号分子上的点突变以及表面糖类的变化。表XII提供可以由临床医师评价的生物分子的列表，这提供更准确的对患者病理状况的诊断，更重要的是，用于设计合适的治疗性治疗方案。例如，pS2/pNR-1+乳腺癌指示患者可能对内分泌疗法有反应。其它在恶性进展过程中经常改变、并且可以在分离的循环肿瘤细胞中分析的肿瘤性相关分子列于下表。下表仅是说明性的，并非限于所陈述的分子。
表XII治疗靶激素&激素调节性蛋白雄激素受体组织蛋白酶D雌激素受体雌二醇孕酮受体SomastatinSRC1＝类固醇受体辅激活物-1Onco/抑制基因蛋白Her-2(cERB-b)EGFRrasc-fosc-junc-mycp53p63nm23/NDP激酶PTEN/MMAC1SMAD4/DPC4
Notch-1JAK-3细胞周期&增殖细胞周期蛋白A细胞周期蛋白B细胞周期蛋白C细胞周期蛋白D细胞周期蛋白EKi67MDR/MRP蛋白其它靶PSA前列腺酸性磷酸酶CA125CA15-3CA27-29HGC囊性纤维化跨膜调节物层粘连蛋白受体神经元特异性烯醇化酶(NSE)甲胎蛋白CD99/MIC2DHEA催乳素CD66e/CEA角质纤丝聚集蛋白(表皮细胞)肾细胞癌(gp200)TAG72/CA72-4UPA-受体(CD87)HeregulinIPO-38胸苷酸合成酶拓扑异构酶Iia谷胱甘肽S转移酶(GST)肺抗性相关蛋白/主要过错蛋白(Major Fault Protein)(LRP/MFP)06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)有技术人员可以利用的方法，以分析表XII所列出的肿瘤性相关分子在表达水平、代谢功能和/或遗传变化上的改变。可以通过流式细胞术、激光扫描细胞术、免疫细胞化学、CellTracks等评价细胞表达水平的改变。可以使用限制酶消化、FISH、PCR或DNA印迹杂交分析评价遗传改变如点突变。糖蛋白和糖脂的糖基化的改变是癌症的普遍特征，可能通过允许有利转移的细胞间相互作用或允许癌症细胞逃避免疫监视，从而影响癌症细胞行为。可以使用免疫组织化学技术、质谱和柱色谱评价人类癌症中糖基化的改变。
图20中提供实施本发明方法的图示方案。
实施例11诊断癌症不同方面的检测试剂盒还设想在本发明中应用的试剂盒，所述试剂盒包含用于进行本发明的测定的试剂。所述试剂盒设计用于进行具体应用。组合试剂，以便利根据循环的罕见细胞对患者进行筛选，所述罕见细胞包括但不限于肿瘤细胞。在本实施方案中，所述试剂盒包含以下组成部分包含磁性核心材料的胶体磁性颗粒、蛋白质基质包被材料以及特异性结合所要分离的癌症细胞上特征决定簇的生物特异性配体。所述试剂盒还包括至少一种其它生物特异性试剂，所述生物特异性试剂对要分离的癌症细胞上第二种特征决定簇有亲和性，所述第二种特征决定簇与所述生物特异性配体识别的决定簇不同。所述试剂盒还包括细胞特异性染料，所述细胞特异性染料从分析中排除无核细胞和其它非靶样品成分。示例性的试剂盒还包含用于检测至少一种肿瘤性相关分子的试剂。所述试剂盒还提供实施例2所述的Cell Spotter或Cell Tracks柱。
依照本发明典型的试剂盒包括以下组成部分与磁性纳米颗粒直接或间接偶联的抗EpCAM、一对单克隆抗体，其中第一种抗体识别癌症特异性决定簇，第二种抗体对非肿瘤细胞决定簇(如泛白细胞抗原)有亲和力。所述试剂盒还提供检测至少一种肿瘤性相关分子的试剂。所述试剂盒还包含从分析中排除无核细胞的核酸染料。本发明的试剂盒可以可选地包含生物缓冲液、渗透缓冲液、实验方案、分离容器、分析室、阳性细胞或合适的珠以及信息资料。
也可以生产上文所述的试剂盒，便利诊断和表征在循环中检测到的特定癌症细胞。在本实施方案中，所述试剂盒包含所有上面提到的物品，并且最好还包括一组癌症特异性单克隆抗体。以乳腺癌为例，诊断试剂盒可以包括抗MUC-1、抗雌激素、抗孕酮受体抗体、抗CA27.29、抗CA15.3、抗组织蛋白酶D、抗p53、抗尿激酶型纤溶酶原激活物、抗表皮生长因子、抗表皮生长因子受体、抗BRCA1、抗BRCA2、抗前列腺特异性抗原、抗纤溶酶原激活物抑制剂、抗Her2-neu抗体或上面所述单克隆抗体的亚组。
还提供一种试剂盒，所述试剂盒用于在根除肿瘤后监测患者的疾病复发和/或残余细胞。在本实施方案中，已经诊断癌症类型。因此，所述试剂盒将包含所有用于根据癌症筛选生物学样品的试剂，并且还包含另一种抗体，所述抗体特异性针对患者体内已诊断的癌症类型。同样，以乳腺癌为例，所述试剂盒可能包含抗MUC-1。或者，所述试剂盒可以包含抗Her2-neu。
可以定制本发明的试剂盒，用于筛选、诊断或监测多种不同癌症类型。例如，假如利用所述试剂盒检测前列腺癌，那么在所述试剂盒中包括的抗体或互补核酸将特异性针对在前列腺组织中存在的靶分子。用于该目的的合适抗体或标记包括抗前列腺特异性抗原、游离PSA、前列腺酸性磷酸酶、肌酸激酶、胸腺素b-15、p53、HPCl基本前列腺基因(basic prostate gene)以及前列腺特异性膜抗原。假如筛选患者是否存在结肠癌，那么在所述试剂盒中可以包括特异性针对癌胚抗原(CEA)的抗体。用于筛选膀胱癌患者的试剂盒可以包括针对核基质蛋白(NMP)、Bard膀胱肿瘤抗原(BTA)或血纤蛋白降解产物(FDP)的抗体。许多不同癌症类型的标记和肿瘤性相关分子是已知的。
使用本发明试剂盒分离的细胞可以进一步用于研究形态学、与器官起源有关的RNA、表面和细胞内蛋白(尤其是那些与恶性肿瘤有关的蛋白)。根据所述分子已知的信息，有可能通过对循环细胞的分析，由所述分子在分离细胞表面的表达确定肿瘤的转移潜力。
本发明的一个目标是为任何已知其特异性标记的癌症提供试剂盒。下面是肿瘤性相关分子及以及有用性和/或指征的列表I 肿瘤来源指示Muc-1--乳腺PSA，PSMA--前列腺CEA--结肠CYPRA 21-1--肺CA125--卵巢细胞角蛋白--见列表抗HI67II 细胞周期核酸染料细胞周期蛋白A、C&Ep27III 细胞活力/编程性细胞死亡baxBcl-2
Caspase7Caspase8Caspase9Fas(CD95)细胞色素camexin V抗金属蛋白酶IV 药物敏感性雌激素、孕酮&雄激素受体HER-2/neuV. 药物抗性P-糖蛋白(MDR)叔谷氨酰半胱氨酸合成酶泰素抗性相关基因1-5顺二胺二氯铂II抗性基因胸苷酸合成酶蛋白激酶C端粒酶VI. 分期Lewis ACBRCA-1 BRCA-2CA15.3(Muc-1)、CA27.29、CA19.9LASAp53组织蛋白酶Dras癌基因下表提供可以评价使用本发明方法分离的细胞的组织来源的不同细胞角蛋白标记。
表XIII细胞角蛋白标记
下面证明如何使用检测循环乳腺癌细胞的试剂盒来便利实施本发明的方法如上文所述，所述试剂盒开始于从全血富集肿瘤细胞的试剂、装置和方法。检测乳腺癌细胞的示例性试剂盒将包括评价六项因素或指示剂。需要设置分析平台，以便通过合适的激发滤镜和发射滤镜区分报道分子DAPi、CY2、CY3、CY3.5、CY5和CY5.5。本实施例中的分析平台使用一台萤光显微镜，所述萤光显微镜配备汞弧光灯以及用于评价所用检测标记的波长的合适滤镜组。用该方法在同一时间引入所有标记。DAPi由UV光激发，对核酸染色，使用DAPi测定细胞的核形态学。用CY2标记的CAM5.2可以用于染色对照细胞。CY3标记的α-细胞角蛋白可以用于标记细胞角蛋白7、8、18和19。使用缀合CY3.5的抗体标记HER-2/neu。使用缀合CY5的抗体标记雌激素受体。使用合适的激发滤镜和发射滤镜，将鉴定出癌症细胞。此外，在所述方法中还设想应用Cell Tracks或Cell Spotter柱。
可以使用本发明的组合物、方法和试剂盒检测的不同类型癌症的例子包括胺前体摄取脱羧细胞瘤、迷芽瘤、鳃原瘤、恶性类癌综合征、类癌心脏病(carcinoid heart disease)、癌(例如Walker、基底细胞，basosquamous，Brown-Pearce，管型，Ehrlich肿瘤，原位，Krebs2，麦克耳细胞，粘蛋白型，非小细胞肺癌，燕麦细胞，乳头状，硬癌，细支气管，支气管，鳞状细胞和移行细胞网状内皮组织增殖)、黑素瘤、成软骨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、间皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、滑膜瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、间质瘤、中肾瘤、肌肉瘤、成釉细胞瘤、牙骨质瘤、牙瘤、畸胎瘤、throphoblastic tumor、腺癌、腺瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、粒层细胞瘤、两性胚细胞瘤、肝细胞瘤、汗腺腺瘤、岛细胞瘤、莱迪希氏细胞瘤、乳头状瘤、塞尔托利氏细胞瘤、膜细胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤、神经瘤、副神经节瘤、非嗜铬性副神经节瘤、antiokeratoma、硬化性血管瘤(angioma sclerosing)、血管瘤病、血管球瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、松果体瘤、癌肉瘤、软骨肉瘤、叶状囊性肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病性肉瘤、脂肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、肉瘤(Kaposi氏肉瘤以及肥大细胞肉瘤)、肿瘤(如骨的肿瘤、消化系统的肿瘤、结肠直肠的肿瘤、肝的肿瘤、胰的肿瘤、垂体的肿瘤、睾丸的肿瘤、眼眶的肿瘤、头颈部肿瘤、中枢神经系统的肿瘤、听神经肿瘤、骨盆的肿瘤、呼吸道的肿瘤以及泌尿生殖器的肿瘤)、神经纤维瘤病以及宫颈异常。
本发明并不仅限于检测循环上皮细胞。在心肌梗塞患者的血液内已经观察到内皮细胞。内皮细胞、心肌细胞和病毒感染的细胞如同上皮细胞一样，都有可得的单克隆抗体所识别的细胞类型特异性决定簇。因此，可以修改本发明的方法和试剂盒，以检测这样的循环内皮细胞。此外，本发明允许检测传染病患者的外周血内的细菌细胞载量，所述患者也可以使用本发明的组合物、方法和试剂盒进行评价。
上文提供了若干杂志文章、美国专利以及美国专利申请的引用。每个前述引用的主题都通过引用结合到本说明书中，如同在本文中完整陈述它们一样。
虽然上文已经描述并特别地举例说明本发明的某些优选实施方案，但这并不是指本发明局限于所述实施方案。在不偏离本发明精神的情况下可以对所述实施方案进行各种修改，在下面权利要求书中描述本发明的完整范围。
权利要求
1.一种评价患者恶性肿瘤存在情况的方法，所述方法包括a)从患者获取生物标本，所述标本包含怀疑包括造血和非造血恶性细胞的混合细胞群；b)制备样品，其中将所述生物标本与一种与所述恶性细胞特异性反应的检测性标记配体混合，以便基本除去其它样品成分；c)使所述样品与至少一种也特异性标记所述恶性细胞的试剂接触；d)分析所述样品，确定标记细胞存在与否及其数目，检测到所述细胞说明存在恶性肿瘤，存在的细胞数目越多，所述恶性肿瘤就越严重；其中所述方法还包括评价所述标记细胞至少一种肿瘤性相关分子的变化。
2.权利要求1的方法，其中在步骤c)和步骤d)之间的中间步骤是使所述样品与一种标记造血细胞使其可被检测的试剂接触。
3.权利要求2的方法，其中对所述肿瘤性相关分子的所述评价包括使所述分子与一种对所述分子有结合亲和力的检测性标记试剂接触。
4.权利要求3的方法，其中所述配体与第一种可检测标记偶联，所述试剂与第二种可检测标记偶联，用第三种可检测标记标记所述造血细胞，并且所述肿瘤性相关分子与一种偶联第四种可检测标记的试剂接触，所述第一种、第二种、第三种和第四种可检测标记不同。
5.权利要求1要求保护的方法，其中用一种选自以下的方法分析所述标记恶性细胞多参数流式细胞术、免疫萤光显微术、激光扫描细胞术、亮视野基础图像分析、毛细管容量分析、光谱成像分析手动细胞分析、Cell Spotter分析、Cell Track分析和自动细胞分析。
6.权利要求1要求保护的方法，其中在至少一种肿瘤根除治疗方法后，应用所述方法检测和计数所述生物标本中的残余癌细胞，并进一步分析所述细胞至少一种预定肿瘤性相关分子的变化。
7.权利要求1要求保护的方法，其中定期从所述患者获取所述生物学样品，评价是否存在循环癌细胞及其数目，并进一步分析所述细胞至少一种预定肿瘤性相关分子的变化，用以说明所述恶性肿瘤进展情况。
8.权利要求1要求保护的方法，其中使所述标记恶性细胞与化学治疗药物接触，评价所述细胞对所述药物的敏感性。
9.权利要求1要求保护的方法，其中所述样品是免疫磁性样品，所述样品包含与偶联所述配体的磁性颗粒混合在一起的生物学样品，在制备所述免疫磁性样品以及使所述免疫磁性样品与至少一种试剂接触之间的中间步骤是将所述免疫磁性样品置于磁场中获得用作免疫磁性样品的富集恶性细胞悬浮液。
10.权利要求9要求保护的方法，其中相对于所述原始生物样品的体积减少包含所述富集恶性细胞的所述免疫磁性样品的体积。
11.权利要求9要求保护的方法，其中所述磁性颗粒是胶体。
12.权利要求9要求保护的方法，其中所述配体是特异性针对至少一种癌细胞决定簇的单克隆抗体，所述至少一种试剂包含至少一种特异性针对第二种癌症细胞决定簇的其它单克隆抗体以及特异性针对在非肿瘤细胞上存在的抗原的第三种单克隆抗体，所述方法还包括在包含所述标记癌细胞的组份内加入细胞特异性染料，以便从分析中除去残余的无核细胞以及细胞碎片。
13.权利要求12要求保护的方法，其中所述配体特异性结合在所述恶性细胞表面的一种上皮细胞粘着分子。
14.权利要求12要求保护的方法，其中所述一种或多种试剂特异性结合细胞角蛋白。
15.权利要求1的方法，其中所述肿瘤性相关分子是至少一种表XII中的分子。
16.权利要求1的方法，其中所述发生改变的肿瘤性相关分子是在各个细胞表面存在的蛋白质，用一种选自以下的方法评价所述分子变化Cell Spotter细胞术、Cell Tracks细胞术、免疫萤光、质谱和流式细胞术。
17.权利要求1的方法，所述方法还包括培养从所述生物标本中分离的恶性细胞。
18.权利要求17的方法，其中用单细胞集落扩增所述培养恶性细胞，产生所述恶性细胞的克隆群体。
19.权利要求18的方法，其中评价所述细胞克隆群体肿瘤性相关分子变化。
20.一种恶性细胞，所述恶性细胞是用权利要求17的方法获得的培养细胞分离制得。
21.一种肿瘤疫苗，所述疫苗包含权利要求20要求保护的细胞或其组分。
22.一种发生改变的素质相关分子，所述素质相关分子从权利要求19的细胞分离获得。
23.一种肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗包含权利要求19的发生改变的素质分子或其片段。
24.权利要求17的方法，所述方法还包括使所述细胞与一种治疗药物接触，以评价所述细胞对所述治疗药物的敏感性。
25.权利要求22的方法，其中用一种选自以下的方法分析在所述培养细胞内存在的蛋白质性肿瘤性相关分子蛋白质凝胶电泳、柱色谱、HPLC、FPLC、免疫组织化学、组织化学以及蛋白质印迹分析。
26.权利要求1的方法，其中所述发生改变的肿瘤性相关分子是核酸，用至少一种选自以下的方法评价所述分子变化核酸文库扩增、聚合酶链反应、琼脂糖凝胶电泳、DNA印迹分析和RNA印迹分析。
27.权利要求26的方法，其中对从个体细胞分离的遗传材料进行所述文库扩增，并且对所述扩增的遗传材料进行基因特异性探测。
28.权利要求26的方法，其中对从多种恶性细胞分离的遗传材料进行所述文库扩增，并且对所述扩增的遗传材料进行基因特异性探测。
29.一种评价患者非造血恶性肿瘤存在情况的方法，所述方法包括a)从患者获取生物标本，所述标本包括含造血和非造血恶性细胞的混合细胞群体；b)制备免疫磁性样品，其中将所述生物标本与偶联配体的磁性颗粒混合，以便基本除去其它样品成分，所述配体与所述恶性细胞特异性反应；c)将所述包含磁性颗粒的恶性细胞以及非磁性颗粒造血细胞分离开，然后d)分析所述包含磁性颗粒的细胞，确定所述样品中所有恶性细胞的存在情况和数目，检测到所述细胞说明存在恶性肿瘤，存在的细胞数目越多，所述恶性肿瘤就越严重；其中所述方法还包括评价所述包含磁性颗粒的恶性细胞的肿瘤性相关分子变化。
30.权利要求29的方法，其中所述发生改变的肿瘤性相关分子是核酸，通过至少一种选自以下的方法评价所述分子变化核酸文库扩增、聚合酶链反应、琼脂糖凝胶电泳、DNA印迹分析和RNA印迹分析。
31.权利要求30的方法，其中对从个体细胞分离的遗传材料进行所述文库扩增，并且对所述扩增的遗传材料进行基因特异性探测。
32.权利要求30的方法，其中对从所有恶性细胞分离的遗传材料进行所述文库扩增，并且对所述扩增的遗传材料进行基因特异性探测。
33.权利要求1的方法，其中所述发生改变的肿瘤性相关分子是糖类，通过选自以下的方法评价所述分子变化质谱、凝集素色谱和boronate affinity。
34.权利要求1要求保护的方法，其中所述患者已经诊断患有选自以下的上皮细胞癌前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、头颈部癌、胰癌和肺癌。
35.权利要求34的方法，其中评价标记细胞的选自以下的肿瘤性相关分子的变化雌激素受体、孕酮受体、Her2/neu和MUC1。
36.权利要求34的方法，其中评价所述标记细胞的选自以下的肿瘤性相关分子的变化雄激素受体、PSA、uPA和PSMA。
37.权利要求34的方法，其中评价所述标记细胞的选自以下的肿瘤性相关分子的变化胸苷酸合成酶、EGFR、MUC2和CEA-15。
38.权利要求34的方法，其中评价所述标记细胞的选自以下的肿瘤性相关分子的变化CEA-19-3、HCG、MDR和MUC1。
39.权利要求34的方法，其中评价所述标记细胞的选自以下的肿瘤性相关分子的变化胸苷酸合成酶、MDR、Her-2/neu和EGFR。
40.权利要求1的方法，其中所述患者是I期癌症患者。
42.权利要求1的方法，其中所述患者是II期癌症患者。
43.权利要求1的方法，其中所述患者是III期癌症患者。
44.权利要求1的方法，其中所述患者是IV期癌症患者。
45.权利要求29要求保护的方法，其中所述患者已经诊断患有选自以下的上皮细胞癌前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、头颈部癌、胰癌和肺癌。
46.权利要求45的方法，其中评价标记细胞的选自以下的肿瘤性相关分子的变化雌激素受体、孕酮受体、Her2/neu和MUC1。
47.权利要求45的方法，其中评价所述标记细胞的选自以下的肿瘤性相关分子的变化雄激素受体、PSA、uPA和PSMA。
48.权利要求45的方法，其中评价所述标记细胞的选自以下的肿瘤性相关分子的变化胸苷酸合成酶、EGFR、MUC2和CEA-15。
49.权利要求45的方法，其中评价所述标记细胞的选自以下的肿瘤性相关分子的变化CEA-19-3、HCG、MDR和MUC1。
50.权利要求45的方法，其中评价所述标记细胞的选自以下的肿瘤性相关分子的变化胸苷酸合成酶、MDR、Her-2/neu和EGFR。
51.权利要求29的方法，其中所述患者是I期癌症患者。
52.权利要求29的方法，其中所述患者是II期癌症患者。
53.权利要求29的方法，其中所述患者是III期癌症患者。
54.权利要求29的方法，其中所述患者是IV期癌症患者。
55.一种测定肿瘤性相关分子变化的方法，该方法用作预测治疗措施疗效的手段，所述方法包括a)从患者获取样品；b)从所述样品中分离并计数循环恶性细胞，如果所述样品中存在循环恶性细胞，所述方法还包括c)测定所述样品内个体细胞表面存在的至少一种预定肿瘤性相关分子的数目，作为预测治疗措施疗效的手段。
56.一种测定肿瘤性相关分子变化的方法，该方法用作评价治疗方法合适剂量的手段，所述方法包括a)从患者获取样品；b)从所述样品中分离并计数循环恶性细胞，如果所述样品中存在循环恶性细胞，所述方法还包括c)测定所述样品内个体细胞表面存在的至少一种预定肿瘤性相关分子的数目，作为评价治疗方法合适剂量的手段。
57.一种测定肿瘤性相关分子变化的方法，该方法用作监测治疗方法疗效的手段，所述方法包括a)从患者获取样品；b)从所述样品中分离并计数循环恶性细胞，如果所述样品中存在循环恶性细胞，所述方法还包括c)测定所述样品内个体细胞表面存在的至少一种预定肿瘤性相关分子的数目，作为监测治疗方法疗效的手段。
58.权利要求57的方法，其中在给予治疗药物之前、期间和之后从所述患者获取所述样品。
59.权利要求57的方法，所述方法还包括分离所述细胞并使所述细胞与一种治疗药物接触，以评价所述细胞对所述治疗药物的敏感性。
60.权利要求55的方法，其中所述患者患有乳腺癌，所述肿瘤性相关分子是Her-2/neu，所述疗法是给予抗Her-2/neu抗体或其片段。
61.权利要求56的方法，其中所述患者患有乳腺癌，所述肿瘤性相关分子是Her-2/neu，所述疗法是给予抗Her-2/neu抗体或其片段。
62.权利要求57的方法，其中所述患者患有乳腺癌，所述肿瘤性相关分子是Her-2/neu，所述疗法是给予抗Her-2/neu抗体或其片段。
63.权利要求55的方法，其中所述患者患有乳腺癌，所述至少一种肿瘤性相关分子包括Her-2/neu和雌激素受体，所述疗法是给予抗Her-2/neu抗体或其片段以及他莫昔芬。
64.权利要求56的方法，其中所述患者患有乳腺癌，所述至少一种肿瘤性相关分子是Her-2/neu和雌激素受体，所述疗法是给予抗Her-2/neu抗体或其片段以及他莫昔芬。
65.权利要求57的方法，其中所述患者患有乳腺癌，所述至少一种肿瘤性相关分子是Her-2/neu和雌激素受体，所述疗法是给予抗Her-2/neu抗体或其片段以及他莫昔芬。
66.一种测定肿瘤性相关分子变化的方法，该方法用作评价癌症进程的手段，所述方法包括a)从患者获取样品；b)从所述样品中分离并计数循环恶性细胞，如果所述样品中存在循环恶性细胞，所述方法还包括c)确定所述细胞是否包含与不良预后有关的预定肿瘤性相关分子，作为评价癌症进程的手段。
67.权利要求66的方法，其中所述肿瘤性相关分子发生改变，所述分子选自以下雄激素受体、组织蛋白酶D、雌激素受体、雌二醇、孕酮受体、Somastatin、类固醇受体辅激活物-1(SRC-1)、Her-2(cERB-b)、EGFR、ras、c-fos、c-jun、c-myc、p53、p63、nm23/NDP激酶、PTEN/MMAC1、SMAD4/DPC4、Notch-1、JAK3、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白C、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、Ki67、MDR/MRP蛋白、PSA、前列腺酸性磷酸酶、CA125、CA 15-3、CA 27-29、HGC、囊性纤维化跨膜调节物、层粘连蛋白受体、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、甲胎蛋白、CD99/MIC2、DHEA、促乳素、CD66e/CEA、角质纤丝聚集蛋白、gp200、TAG72/CA72-4、UPA-受体(CD87)、Heregulin、IPO-38、胸苷酸合成酶、拓扑异构酶Iia、谷胱甘肽S转移酶(GST)、肺抗性相关蛋白/主要过错蛋白(LRP/MFP)和06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)。
68.权利要求66的方法，其中所述肿瘤性相关分子相对于野生型表达发生异常表达，所述分子选自雄激素受体、组织蛋白酶D、雌激素受体、雌二醇、孕酮受体、Somastatin、类固醇受体辅激活物-1(SRC-1)、Her-2(cERB-b)、EGFR、ras、c-fos、c-jun、c-myc、p53、p63、nm23/NDP激酶、PTEN/MMAC1、SMAD4/DPC4、Notch-1、JAK3、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白C、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、Ki67、MDR/MRP蛋白、PSA、前列腺酸性磷酸酶、CA 125、CA 15-3、CA 27-29、HGC、囊性纤维化跨膜调节物、层粘连蛋白受体、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、甲胎蛋白、CD99/MIC2、DHEA、促乳素、CD66e/CEA、角质纤丝聚集蛋白、gp200、TAG72/CA72-4、UPA-受体(CD87)、Heregulin、IPO-38、胸苷酸合成酶、拓扑异构酶Iia、谷胱甘肽S转移酶(GST)、肺抗性相关蛋白/主要过错蛋白(LRP/MFP)和06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)。
69.权利要求67要求保护的方法，其中所述肿瘤性相关分子是核酸。
70.权利要求68要求保护的方法，其中所述肿瘤性相关分子是核酸。
71.权利要求67要求保护的方法，其中所述肿瘤性相关分子是蛋白质。
72.权利要求68要求保护的方法，其中所述肿瘤性相关分子是蛋白质。
73.一种对患者进行整体活组织检查的方法，所述方法包括a)从患者获取血液样品；b)从所述样品分离并计数循环非造血恶性细胞，如果所述样品存在循环非造血恶性细胞，所述方法还包括c)分析所述细胞上的一组预定肿瘤性相关分子存在与否及其数目。
74.权利要求73的方法，其中所述肿瘤性相关分子包括至少两种选自以下的分子雄激素受体、组织蛋白酶D、雌激素受体、雌二醇、孕酮受体、Somastatin、类固醇受体辅激活物-1(SRC-1)、Her-2(cERB-b)、EGFR、ras、c-fos、c-jun、c-myc、p53、p63、nm23/NDP激酶、PTEN/MMAC1、SMAD4/DPC4、Notch-1、JAK3、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白C、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、Ki67、MDR/MRP蛋白、PSA、前列腺酸性磷酸酶、CA125、CA 15-3、CA 27-29、HGC、囊性纤维化跨膜调节物、层粘连蛋白受体、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、甲胎蛋白、CD99/MIC2、DHEA、促乳素、CD66e/CEA、角质纤丝聚集蛋白、gp200、TAG72/CA72-4、UPA-受体(CD87)、Heregulin、IPO-38、胸苷酸合成酶、拓扑异构酶Iia、谷胱甘肽S转移酶(GST)、肺抗性相关蛋白/主要过错蛋白(LRP/MFP)和06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)。
75.权利要求73要求保护的方法，其中所述患者患有选自以下的上皮细胞癌症前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、子宫癌、头颈部癌、胰癌和胃癌。
76.一种鉴定循环肿瘤细胞相对于原位肿瘤细胞的变化的方法，所述方法包括a)从患者获取所述肿瘤的活组织检查标本；b)从所述患者分离循环肿瘤细胞，如果存在循环肿瘤细胞，则c)使所述标本和所述分离的循环肿瘤细胞分别接触一组试剂，所述试剂检测多种肿瘤性相关分子；d)确定在所述循环肿瘤细胞和所述标本中存在的所有肿瘤性相关分子；e)确定所述循环肿瘤细胞的所述肿瘤性相关分子是否中相对于所述活组织检查标本发生改变。
77.一种检验试剂盒，所述检验试剂盒用于筛选患者样品中非造血恶性细胞的存在情况，所述检验试剂盒包括a)包含磁性核心材料的包被磁性纳米颗粒，一种蛋白质基质包被材料以及一种特异性结合所述恶性细胞的第一种特征决定簇的抗体，所述抗体直接或间接与所述碱性包被材料偶联；b)至少一种对所述恶性细胞的第二种特征决定簇有结合特异性的抗体；c)从分析中排除所述恶性细胞以外的样品成分的细胞特异性染料；d)选自以下的装置Cell Spotter柱或Cell Track柱；e)至少一种对肿瘤性相关分子有结合亲和力的检测性标记试剂。
78.权利要求48要求保护的试剂盒，所述试剂盒还包括一种对非靶细胞有结合亲和力的抗体、一种生物缓冲液、一种渗透缓冲液、实验方案，并且可选地可以包含信息资料。
79.权利要求77要求保护的试剂盒，所述试剂盒用于筛选乳腺癌患者，其中所述至少一种对所述肿瘤相关分子具有结合亲和力的检测性标记试剂选自以下MUC-1、雌激素、孕酮受体、组织蛋白酶D、p53、尿激酶型纤溶酶原激活物、表皮生长因子、表皮生长因子受体、BRCA1、BRCA2、CA27.29、CA15.5、前列腺特异性抗原、纤溶酶原激活物抑制剂以及Her2-neu。
80.权利要求77要求保护的试剂盒，所述试剂盒用于筛选前列腺癌患者，其中所述至少一种对所述肿瘤相关分子具有结合亲和力的检测性标记试剂选自以下前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、胸腺素b-15、p53、HPC1基本前列腺基因、肌酸激酶以及前列腺特异性膜抗原。
81.权利要求77要求保护的试剂盒，所述试剂盒用于筛选结肠癌患者，其中所述至少一种对所述肿瘤相关分子具有结合亲和力的检测性标记试剂选自以下癌胚抗原、C蛋白、APC基因、p53、胸苷酸合成酶以及基质金属蛋白酶(MMP-9)。
82.权利要求77要求保护的试剂盒，所述试剂盒用于筛选膀胱癌患者，其中所述至少一种对所述肿瘤相关分子具有结合亲和力的检测性标记试剂选自以下核基质蛋白(NMP22)、Bard膀胱肿瘤抗原(BTA)以及血纤蛋白降解产物(FDP)。
83.权利要求77要求保护的试剂盒，其中所述至少一种抗体包括一组抗体，所述一组抗体中的每一种抗体都对一种不同的癌症细胞特征决定簇有结合特异性。
全文摘要
本发明提供检测循环肿瘤细胞以及评价所述细胞肿瘤性相关分子变化的方法和组合物。
文档编号C07K16/18GK1871517SQ02807927
公开日2006年11月29日 申请日期2002年2月19日 优先权日2002年2月19日
发明者L·W·M·M·特尔斯塔彭, G·C·劳, S·M·奥哈拉, P·A·利伯蒂, S·格罗斯, G.多伊尔 申请人:免疫公司