专利名称：一种不需要分离dna的反转录聚合酶链反应方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及反转录聚合酶链式反应的方法。
背景技术：
反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)是以RNA为原始模板的一种聚合酶链反应。RNA在体内是由RNA聚合酶以DNA为模板经转录而合成，而反转录PCR反应是在体外先由反转录酶以RNA为模板反转录合成cDNA。cDNA的顺序与其对应的DNA顺序完全一样，所以微量DNA的存在必会干扰反转录PCR。现有的各种DNA或RNA分离方法或各种商品试剂盒虽能将DNA与RNA分开，但常会有微量DNA存在于RNA之中，反之亦然。由于TaqDNA聚合酶仅以DNA为模板，所以RNA的存在不干扰以DNA为模板的PCR，但如上所述，DNA的存在将干扰以RNA为原始模板的反转录PCR。为了克服DNA对反转录PCR的干扰，已发展了多种方法，但仍有较大局限和缺点。第一种方法是在反转录之前用DNase分解微量的DNA，但所用的DNAase必须非常纯不能含有RNase，微量的RNase将破坏RNA模板使扩增失败；DNAase作用后又必须彻底破坏，否则也会造成扩增失败。第二种方法是引物跨越至少一个内含子。这种方法通常能区分以RNA为原始模板的反转录PCR扩增产物和以DNA为模板的PCR扩增产物，但不能阻止PCR扩增产物的形成。应用这种方法时PCR后必须用电泳方法将长度不同的二个产物分开。由于以DNA为模板的PCR扩增产物的外显子部位的顺序和以RNA为原始模板的扩增产物顺序完全相同，所以难以用探针和ELISA方法来检测。第三种方法是设计“骑墙”引物，即引物的5’侧在外显子部位而3’侧在内涵子部位。这种方法能阻止以DNA为模板的扩增，但是，设计“骑墙”引物必须知道外显子与内含子衔接部位的顺序，同时，该部位的顺序又需要符合引物高严谨性的要求，往往在实际应用时难以同时满足这二个要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题本发明提供一种不需要分离DNA的反转录聚合酶链反应方法，以克服现有RT-PCR方法难以排除样品中的DNA对以RNA为原始模板的RT-PCR的干扰的缺陷，使RT-PCR能在DNA存在下完成扩增。
发明构思本发明将正反引物分别设计在二个外显子并符合下述二个条件中的任一种。第一种方法正反引物分别在靠近外显子与内含子交接的区段内，以RNA为原始模板的反转录PCR扩增产物的长度就比较短，因加上内涵长度以DNA为模板的扩增产物就长得多，前者的解链温度将会比后者低若干度。第二种方法利用引物设计软件选择扩增产物解链温度较低的若干候选引物对，然后分析内含子的G+C％含量和解链温度，使以DNA为模板的扩增产物的解链温度比以RNA为原始模板的反转录PCR扩增产物高若干度。因为扩增产物在变性阶段分离成二条单链是完成扩增的必要条件，通过控制PCR第三循环以后的循环的变性温度可以使解链温度较低的以RNA为模板的反转录PCR扩增产物能解开成单链完成扩增，而解链温度较高的DNA扩增产物不能在变性步骤解开成单链而流产。
技术方案本发明提供一种不受DNA干扰的反转录聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)反转录酶催化下，依据RNA链合成DNA模板；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；按步骤(2)-(4)循环进行合成反应，其中引物的设计满足以下要求即以RNA为模板的反转录PCR扩增产物的解链温度比包含内涵子的以DNA为模板的扩增产物的解链温度低1-25℃，优选低3-10℃。
引物设计方法为首先以目标扩增基因的cDNA为模板，用人工方法、引物设计软件或人工与软件自动设计相结合的方法，选择具有高严谨性的引物对，并且使RT-PCR的扩增产物的解链温度在65-92℃之间，优选75-88℃。然后以相应的基因组DNA为模板检查，正反引物需至少跨越一个内涵子，并且使包含内涵子部分的基因组DNA扩增产物的解链温度比cDNA扩增产物高1-25℃以上，优选3-10℃。
上述的反转录聚合酶链式反应方法，可采用先以反转录引物引导进行反转录合成cDNA，然后进行PCR反应的二步方法。所述的反转录引物为oligo(dT)、随机引物或基因专一引物。
上述的反转录聚合酶链式反应方法，也可采用反引物引导进行反转录合成cDNA的同时进行PCR反应的一步方法。其中，第三循环以后的变性温度控制在比RT-PCR扩增产物的解链温度高0.5-10℃，而比基因组DNA的扩增产物的解链温度低0.5-10℃。或者，另一个优选方案为第三循环以后的变性温度控制在比RT-PCR扩增产物的解链温度高2-8℃，而比基因组DNA的扩增产物的解链温度低2-8℃。
有益效果本发明提供的不需要分离DNA的反转录聚合酶链反应方法，即设计引物使以RNA为模板的RT-PCR扩增产物的解链温度比包含内涵子的以DNA为模板的扩增产物的解链温度低1-25℃进行RT-PCR的方法，可以排除样品中的DNA对以RNA为原始模板的RT-PCR的干扰。一方面能简化或甚至省略RNA与DNA的分离步骤，另一方面由于完全克服了DNA扩增产物的干扰，有可能使用更简单的方法米检测反转录PCR扩增产物。
其优点归纳如下1.使反转录PCR对RNA的纯度要求降低，避免了用DNase分解DNA的步骤和因酶制剂不纯对扩增带来的负面影响步骤；2.为简化或省略RNA的提纯方法或过程创造了条件；3.为省略电泳分离操作和在不开启反应管直接检测反转录PCR扩增产物创造了条件，使滞后污染得到克服。
具体实施例方式
实施例1.
实施例1以人肌动球蛋白基因(基因库编号BC016045)为目标基因。PCR引物的顺序和主要特性示于表1和表2。
表1.实施例1引物顺序
表2.实施例1引物特性
实施例1比较了以人基因组DNA为模板和以人组织总RNA为原始模板时在不同退火条件下的扩增结果。人基因组DNA和总RNA均为Clontech公司产品，反转录用该公司的反转录试剂盒，以Oligo(dT)为引物按试剂盒推荐条件合成cDNA。PCR用Clontech公司的Advantage2PCR试剂盒，每管反应体积为5微升，引物浓度均为0.4uM。基因组DNA浓度为0.5微克/100微升，cDNA加量为10微升/100微升反应液。对照组PCR程序为首次变性94℃1分钟，循环变性94℃10秒钟，退火和延伸70℃1分钟，共28个循环。试验组PCR程序与对照组基本相同，但除第一和第二循环变性为94℃10秒外，其余循环变性为87℃30秒钟。反应结束后按常规电泳并染色用扫描仪检测扩增产物条带。试验结果示于表3。
表3.实施例1试验结果
表3结果说明通过选择引物和控制后续变性温度可阻止基因组DNA对以RNA为原始模板的反转录PCR的干扰。
实施例2.
实施例2以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(基因库编号XM006959)为目标基因。引物顺序和特性示于表4和5。
表4.实施例2引物顺序
表5.实施例2引物特性
人基因组DNA和总RNA来源与实施例1相同。反转录PCR用Clontech公司的单管法反转录PCR试剂盒。每管反应体积为5微升，每100微升反转录PCR液加1微克总RNA或1微克基因组DNA。反转录在50℃反应维持5分钟。引物浓度，对照组PCR程序与实施例1相同，退火和延伸为68℃1分钟。试验组后续循环变性步骤为85.5℃30秒钟。试验结果示于表6。
表6.实施例2试验结果
表6结果说明通过选择引物和控制后续变性温度可阻止基因组DNA对以RNA为原始模板的反转录PCR的干扰。
权利要求
1.一种不受DNA干扰的反转录聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)在反转录酶催化下，依据RNA链合成DNA模板；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；按步骤(2)-(4)循环进行合成反应，其特征在于设计引物使以RNA为模板的RT-PCR扩增产物的解链温度比包含内涵子的以DNA为模板的扩增产物的解链温度低1-25℃。
2.根据权利要求1所述的反转录聚合酶链式反应方法，其特征在于设计引物使以RNA为模板的RT-PCR扩增产物的解链温度比包含内涵子的以DNA为模板的扩增产物的解链温度低3-10℃。
3.根据权利要求1所述的反转录聚合酶链式反应方法，其特征在于RT-PCR的扩增产物的解链温度范围为65-92℃。
4.根据权利要求1所述的反转录聚合酶链式反应方法，其特征在于RT-PCR的扩增产物的解链温度范围为75-88℃。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的反转录聚合酶链式反应方法，其特征在于采用先以反转录引物引导进行反转录合成cDNA，然后进行PCR反应的二步方法。
6.根据权利要求5所述的反转录聚合酶链式反应方法，其特征在于采用的反转录引物为oligo(dT)、随机引物或基因专一引物。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的反转录聚合酶链式反应方法，其特征在于采用反引物引导，进行反转录合成cDNA的同时进行PCR反应的一步方法。
8.根据权利要求5所述的反转录聚合酶链式反应方法，其特征在于第三循环以后的变性温度应控制在比RT-PCR扩增产物的解链温度高0.5-10℃，而比基因组DNA的扩增产物的解链温度低0.5-10℃。
9.根据权利要求5所述的反转录聚合酶链式反应方法，其特征在于第三循环以后的变性温度应控制在比RT-PCR扩增产物的解链温度高2-8℃，而比基因组DNA的扩增产物的解链温度低2-8℃。
全文摘要
本发明提供一种不需要分离DNA的反转录聚合酶链反应方法，即设计引物使以RNA为模板的RT－PCR扩增产物的解链温度比包含内涵子的以DNA为模板的扩增产物的解链温度低1－25℃，以克服现有RT－PCR方法难以排除样品中的DNA对以RNA为原始模板的RT－PCR的干扰的缺陷。一方面简化甚至省略了RNA与DNA的分离步骤，另一方面由于完全克服了DNA扩增产物的干扰，可使用简单的方法来检测反转录PCR扩增产物，能在分子生物学研究和临床高通量快速诊断中普遍应用。
文档编号C12P19/00GK1580273SQ03141989
公开日2005年2月16日 申请日期2003年7月31日 优先权日2003年7月31日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧