专利名称：血细胞重编程产生多潜能干细胞和多功能干细胞的制作方法
血细胞重编程产生多潜能干细胞和多功能干细胞发明背景发明领域本发明总体涉及干细胞领域，更具体地，涉及将血细胞重编程为多潜能(pluripotent)和多功能(multipotent)干细胞。背景信息近年来衍生出了源自患者体细胞的人类的诱导多潜能干(iPS)细胞，其有望产生患者和疾病特异性的干细胞系，用于开发新的细胞疗法和建立疾病模型。这些人类iPS细胞展示出与人类胚胎干(hES)细胞相似的特征，包括在培养基中无限制扩增。大部分公布的方案使用载体递送多种编码转录因子的转基因，例如0CT4、S0X2、KLF4和c_MYC，用于重编程贴壁细胞，例如皮肤和毛发的成纤维细胞和角蛋白细胞。
非常期望对血细胞进行重编程，因其易于获得，且较少暴露于环境的诱变剂中。例如，可使用在多个细胞库中收集和贮存的脐带血(CB)细胞，作为自体同源或异源的但组织相容的iPS细胞系的来源。更关键的是，如果希望产生的iPS细胞含有的体细胞突变仅限于血细胞且存在于获得性血液疾病中，从而以研究这些疾病的机制，那么重编程血细胞的能力就至关重要。之前的研究证明，分化的小鼠B细胞可以重编程为iPS细胞，这主要是通过使用转基因(重编程就绪)小鼠完成，其带有在一定条件下有活性的四种重编程转基因。更近地，由单个同种造血干细胞在小鼠中重建了造血作用，用从这样的小鼠中得到的骨髓祖细胞衍生出了小鼠iPS细胞系，这进一步证明了小鼠造血细胞可以重编程为具有多潜能性。此前一直没有报道过出生后的人类血细胞衍生为iPS细胞，直到最近，报道称粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的健康人外周血(PB)CD34+细胞可以被重编程为iPS细胞。但是，并不清楚通过每天的G-CSF治疗能否影响重编程过程，或由血细胞衍生的iPS细胞的性质。因此，仍然需要由体细胞，特别是血细胞或脐带血细胞，有效地生成诱导的多潜能干细胞。发明概述本发明是基于脐带血(CB)和成人骨髓(BM)CD34+细胞可以重编程为早期干细胞的开创性发现。本发明提供了来源于对主体的CB和成人骨髓(BM)CD34+细胞的重编程，且无需任何预处理。提供了重编程主体血细胞的方法。也提供了建立疾病模型方法和产生主体特异性分化细胞的方法。另外，本发明提供的方法可用于识别试剂，所述试剂能改变主体特异性的分化细胞的功能，以及改变由血细胞重编程获得的分离的多潜能或多功能干细胞的功能。在一个实施例中，本发明涉及一种产生多潜能或多功能干细胞的方法。所述方法包括向培养基中的血细胞引入含有至少一种多潜能因子的非病毒载体，从而将血细胞重编程为多潜能或多功能干细胞。在一方面，载体包括多个多潜能基因。在另一方面，本发明的方法进一步包括向培养基中加入至少一种皮质类固醇。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇选自下组醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮质酮、地塞米松、氟氢可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、以及曲安西龙。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇为地塞米松。在另一方面，本发明的方法进一步包括向培养基中加入至少一种细胞因子。在另一方面，所述至少一种细胞因子选自下组睾丸支持细胞因子(SCF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促红细胞生成素(EPO)、以及白介素3 (IL-3)。在另一方面，所述血细胞为脐带血(CB)细胞、成人骨髓(BM)CD34+细胞、成人外周血(PB)细胞、成人外周血(PB)CD34+细胞、成人外周血(PB)CD34+CD45+细胞、或成人外周血单核细胞(PBMC)。在另一方面，所述主体为哺乳动物。在另一方面，所述主体为人类。在另一方面，所述多潜能或多功能干细胞包括造血干细胞。在另一方面，所述主体有骨髓增殖性疾病(MPD)。在另一方面，所述至少一种多功能因子包括至少三种因子，所述因子选自下组S0X2、S0X7、S0X17、0CT4、Nanog, LIN28、c_Myc、KLF4、ESRRB, EBF1、C/EBPa、C/EBP β 、NGN3、PDX以及MAFA，或其活性片段。在另一方面，所述至少一种因子包括0CT4、S0X2、KLF4、以及c-MYC,或其活性片段。在另一方面，所述至少一种因子包括0CT4、S0X2、KLF4、MYC、LIN28、以及SV40T抗原，或其活性片段。在一方面，所述非病毒载体为游离型载体。在另一方面，所述方法进一步包括向血细胞中引入第二个游离型载体。在另一方面，第二个游离型载体表达SV40T抗原(Tg)。在另一方面，第一个游离型载体包括多个多潜能基因，所述多潜能基因与至少一个调控序列操作性(operatively)连接以表达所述因子。在另一方面，所述游离型载体为oriP/EBNAl质粒。在另一方面，PBMC来自镰状细胞性贫血患者。在另一方面，PBMC包括S⑶B003细胞。在另一实施例中，本发明涉及一种确定对主体细胞有疗效的试剂的方法。所述方法包括使测试试剂接触上述任意方法生成的多潜能或多功能干细胞，并检测测试试剂存在与不存在时功能的变化。在另一实施例中，本发明涉及一种生成分化细胞的方法，所述方法包括诱导上述任意方法生成的多潜能或多功能干细胞的分化，从而获得分化细胞群。在一方面，所述分化细胞包括血细胞、肌细胞、神经元细胞、结缔组织、心肌细胞、巨核细胞、内皮细胞、肝细胞、成肾细胞、成脂细胞、成骨细胞、破骨细胞、肺泡细胞、心脏细胞、肠细胞、肾细胞、视网膜细胞或上皮细胞。在另一方面，所述分化细胞包括胰腺β细胞、肝细胞、心肌细胞或骨骼肌细胞。在另一实施例中，本发明涉及上述任意方法产生的分离的多潜能或多功能干细胞的富集细胞群。在一方面，所述分离的多潜能或多功能干细胞表达一种选自下组的细胞表面标记SSEAl、SSEA3、SSEA4、TRA-l-60、以及 TRA-1-81。在另一实施例中，本发明涉及一种治疗需要更换或更新细胞的疾病。所述方法包括给予主体有效量的由上述任意方法生成的多潜能或多功能干细胞。在另一实施例中，本发明涉及重编程的非病毒游离型载体。在一方面，所述非病毒游离型载体包括至少五个多潜能基因，其与至少一个调控序列操作性连接，以表达至少五种多潜能因子。在另一方面，所述载体为oriP/EBNAl质粒。附图简述图I显示了由CB衍生的未分化iPS细胞(U)和在体内分化之后得到的畸胎瘤细胞⑴中，未分化(0CT4和NANOG)和分化标记物的基因表达。可以用RT-PCR分析测定甲胎蛋白(AFP，内胚层)、CD34(中胚层)和PAX6(外胚层)和管家基因GAPDH的表达。图2显示了由PV iPS细胞生成的造血祖细胞的红系分化增加。为了评估红系分化潜能，在液体培养基(图2A和2C)或含有血清和甲基纤维素的培养基(图2B和2D)中铺板纯化的⑶34+⑶45+细胞，所述细胞来源于正常对照(NC)，或经胚状体介导的造血分化之后的PV iPS细胞。图2A显示了来源于NC(13.5 ±3.6倍)或PV iPS细胞(27·6±3·3倍)的纯化的⑶34+⑶45+细胞在液体中培养7天之后的细胞扩增倍数。图2Β显示了⑶34+⑶45+细胞在甲基纤维素中培养14天之后的细胞扩增倍数，NC为69. 5±24. 7倍，PV iPS细胞为127±28. 3倍。图2A和2B的数据用平均值土标准差(η = 2)表示。图2C显示了用FACS分析的培养7天的细胞的红系表型(⑶235a+⑶45-)。根据分选(gating)和与背景染色的比较，将这种细胞群的百分比在左上象限显示。图2D显示了从含有甲基纤维素的培养基中获取的培养14天的细胞的FACS分析。图3显示人类iPS生成的造血祖细胞展示出独特的基因表达类型，其与PV患者和正常对照的原代CD34+细胞相似。图3A显示了从作为正常对照(NC)的健康供体或PV患者(MPD183)的原代⑶34+细胞中分离的总RNA，所述PV-iPS细胞系衍生自该PV患者。在逆转录RNA之后，可以通过实时定量PCR，分析细胞核因子I-B (NFI-B)、血红蛋白- Y (HBG)和血红蛋白-β (HBB)以及β-actin(作为对照)的基因表达。绘制了标准化的水平(相对于β-actin)。图3Β显示了，用从PV iPS(iMPD183)产生的、以及从正常成人CD34+细胞衍生的正常对照(NC) iPS细胞所产生的纯化的⑶34+⑶45+细胞，进行相同的分析。数据用平均值土 SD(n = 2)表示。图4显示了用于重编程人类新生儿成纤维细胞的示例性EBNAl/OriP游离型载体。图 4A显示了载体OSNL(0ct4+Sox2+Nanog+Lin28) ,OSTK(0ct4+Sox2+SV40 大 T 抗原 +Klf4)、以及0SMK(0ct4+Sox2+c-Myc+Klf4)的构架。图4B显示了使用三个质粒的重编程实施例。图5显示了通过改善的EBNAl/oriP质粒重编程人类血⑶34+细胞的示例性图解。通常，14天之后，细胞可以被抗TRA-1-60+抗体染色。然后可以检查细胞的核型、多潜能性、和/或游离体状态。图6显示了在重编程的和扩增的iPS细胞中，载体DNA逐渐减少。图6A表明，未检测到载体DNA可能是因为在表观遗传学上ENBAl的表达被沉默，而ENBAl的表达是游离型DNA复制所必需的。图6B显示了 EBNAl载体检测的PCR结果。图7显示了重编程CB MNC获得的多种克隆，其表明较新的血液更好。图8显示了 11个人类ESC系、17个iPSC系及其亲代体细胞的全基因组表观遗传学特征。使用InfiniumMethylation27平台，分析在IMR90胚胎成纤维细胞、3个成人骨髓(BM)间质细胞(MSC和BASC)、分离自成人BM、外周血(PB)和脐带血(CB)的CD34+细胞的2个样品中，27，578个基因座的DNA甲基化。也使用了这些体细胞衍生的17个iPSC系和11个hESC样品。图8A显示了使用皮尔森相关系数产生的树状图。树状图表明iPSC作为一个组，其与ESC非常相似，且与其亲代体细胞有区别，并且与MSC/胚胎成纤维细胞相比，人类CD34+细胞与ESC/iPSC组更相似。图SB显示，K均值集群分析显示出相似的结论。为了简化展示，发明人省略了iPSC，因为它们与ESC非常相似。分析了出生后体细胞和11个ESC系中各种基因座(在CpG岛内或外部)的启动子的DNA甲基化(从O到I)水平。出现四个不同的集群1)两者均高；2)体细胞中高，但ESC中低；3)体细胞中低，但ESC中高；和4)两者细胞类型中均较低。插入表格中列出了 3个MSC或CD34+细胞中每个常见集群中的基因座数。集群#2和#3由甲基化与ESC不同的基因座组成。结合两个集群，MSC中15. 4%的基因座与ESC不同，⑶34+细胞中只有10. 8%基因座与ESC不同。图8C显示了 ploycomb抑制性复合物靶基因中2586个基因座的多维量表分析。沿着前两维的绘图揭示了 ESC(和iPSC，绘图中省略)相互之间难以区别。相似地，MSC和⑶34+细胞分别聚集。值得注意的是，在这方面，⑶34+细胞群集与ESC更近。图8D显示了 Thomson/Yu的6#组合(表达7个基因的3个质粒)、或EBNAl/OriP组合、pEB-C5(C5)+pEB-Tg(Tg)的重编程效率(表示为用第14天时每IO6个核转染细胞中TRA-l-60+、ESC样集落数)。pEB-GFP (GFP)用作对照。图8E显示了 TRA-1-60+集落数占总集落数的百分比。数据表示为平均值+/-SEM(η = 2)。图8F和SG显示了通过将C5与Tg、pEB-p53shRNA (p53shRNA)或 pEB_NAN0G (NANOG)联用，或仅用 C5，重编程不同 CD34+ 细胞样品的效率。数据表示为平均值+/-SEM(η = 3)。 图9显示了通过单个ENBA-1/OriP质粒从成人外周血(PB)和骨髓(BM)产生的人类iPSC。图9A和9B显示了从PB CD34+细胞(图9A)或BM CD34+细胞(图9B)扩增的每IO6个核转染细胞的TRA-1-60+集落数。数据表示为平均值+/-SEM，η = 6。
图10显示了通过单个ENBA-1/OriP质粒从成人外周血(PB)和脐带血(CB)单核细胞(MNC)产生的人类iPSC。图10A显示了从CB MNC扩增的2X IO6个核转染细胞重编程之后第14天的TRA-1-60+集落数。将两种不同的CB MNC(I. 5个月之前冷冻(GB/CB)和13. 5年之前(AC/CB)冷冻)培养8天。用l-3个ENBAl/0riP质粒，按指示将2X106个培养并准备的细胞进行核转染。C5 pEB-C5 ；Tg pEB-Tg ；Combo#6 Thomson/Yu 组合 #6 (3 个质粒)。再培养2天之后，将细胞置于用MEF包被的12孔板中的6个孔中，并在丁酸钠(NaB)存在和不存在的情况下用ESC培养基培养(从第3天开始)。在第14天对活细胞进行TPvA-1-60细胞表面表达的染色，计数TRA-1-60+(和TRA-60-)集落。TRA-1-60+集落数表示为平均值+/-SEM，η = 6。图10Β显示PB MNC(来自S⑶003供体)由相似的方法被类似地重编程。图11显示了从新生儿脐带血(CB，A)或成人外周血(PB，B)扩增的单核细胞(MNC)的表型。在确定的无血清培养基中培养8天或9天，为重编程作准备，获取细胞，通过1-2个质粒进行核转染，并通过FACS染色对表面标记染色和进行分析。也显示了培养之前(第O天)MNC的表型作为对照。培养之后(第8天或第9天)，大部分细胞与表达高水平CD71 (转铁蛋白受体)的幼红细胞相似，其中一些细胞也表达中等水平的CD235a (血型糖蛋白A)。非常少的细胞表达T细胞(⑶3，<2.4% )、B细胞(⑶19，< 0/4% )、单核细胞(⑶14，< 0. 4% )和粒细胞(⑶15，< 1.6% )的标记。注意也出现了表达低水平⑶34(2. 5%至6.8% )的细胞群。图12显示了从成人外周血(PB)扩增的单核细胞(MNC)功能。在培养之前(第O天)和培养之后(第8天)对细胞进行造血祖细胞测定。在第8天的培养物中，红系祖细胞，例如红系暴发集落形成单位细胞(BFU-E，未成熟红系祖细胞)和红系集落形成单位细胞(CFU-E，更定型的红系祖细胞)，的频率大大增加，而粒系集落生成细胞和单核细胞的祖细胞有适当增加。集落形成单位单核细胞和混合细胞类型的集落形成单位(多潜能红系/骨髓祖细胞)有所降低。图13显示了扩增的成人外周血单核细胞(PBMC)的胚胎和成人血红蛋白表达类型。图13A显示了在培养之前(第O天)和之后(第9天)，用RT-PCR检测编码Y血红蛋白(HBB，胚胎/新生儿形式)和β血红蛋白(ΗΒΒ，成人形式)的基因。未培养的脐带血单核细胞(CBMC)用作HBB和HBG mRNA水平的阳性对照。还包括了从相同PBMC (培养之后)重编程得到的iPSC系(SPE TNCI)的mRNA。培养9天之后，HBB的mRNA水平增加>500倍，HBG增加> 8，000倍。图13B显示用特异性单克隆抗体对细胞内HBB和HBG蛋白进行FACS分析。图14显示六个SPE iPSC不含任何可检测到的与定型T细胞和B细胞有关的体细胞突变。图14A显示使用四组PCR引物，以检测T细胞受体(TCR)重排的任何证据。来源于 克隆的人T细胞系的基因组DNA作为阳性对照，而人类ESC系(HI)作为阴性对照。使用从6个由(供体S⑶003的)PB MNC产生的iPSC系分离出的等量的基因组DNA(500ng)。它们均未显示出TCR重排的任何阳性信号。图14B显示，使用三组PCR引物，以检测在定型B细胞中发生的IgH重排的任何证据。包括一个克隆对照(29)作为阳性对照。六个SPE iPSC均未显示出IgH重排的任何阳性信号，人类ESC也未显示出IgH重排的任何阳性信号。图14C显示，从人类ESC和六个iPSC分离出的基因组DNA的质量控制。可以用PCR很容易地扩增混合引物，并产生从IOObp到600bp的多个产物。图15A显示，培养的血⑶34+细胞显示的特征与hES/iPS细胞的特征相近度比成纤维细胞/MSC与hES/iPS细胞的更接近。图15B显示，成人PBMC产生的iPS细胞不是来源于在TCR基因座有VDJ体细胞突变的T细胞。图15C显示了本发明的示例性实施例的简短总结，本发明中体/血细胞可以重编程、扩增和分化为各种细胞类型。发明详述由体细胞衍生的人类的诱导多潜能干(iPS)细胞有望开发出新的患者特异性的细胞疗法，以及遗传性和获得性疾病的研究模型。之前，人类的贴壁细胞已被重编程，例如将出生后的成纤维细胞重编程为与粘壁的胚胎干细胞相似的iPS细胞。本发明提供了将出生后的人类血细胞衍生为iPS细胞，以及这些多潜能细胞用于疾病建模的潜力。已经从之前冷冻的脐带血或健康供体的成人CD34+细胞中产生了多个人类iPS细胞系，并可重新定向为造血分化。也可以从两名患有骨髓增殖性疾病(MPD)的患者的外周血⑶34+细胞中产生多个iPS细胞系，这些患者的血细胞中获得了 JAK2-V617F体细胞突变。MPD衍生的含有突变的iPS细胞在表型、核型和多潜能性上表现正常。定向造血分化之后，由MPD-iPS细胞衍生的造血祖细胞(⑶34+⑶45+)可表现出红细胞生成增加和特定基因的基因表达增加，重现了衍生出iPS细胞的相应患者的原代CD34+细胞的特点。这些iPS细胞提供了可更新的细胞源，以及预期的造血作用模型，以用于研究MPD的疾病机制。本发明提供了对来源于健康供体的人类CB和成人骨髓(BM)⑶34+细胞的重编程，且无需任何预处理。而且，含有JAK2-V617F突变的PB⑶34+细胞可以衍生出多个iPS细胞系，JAK2-V617F突变在患有骨髓增殖性疾病(MPD)的成年患者的造血祖细胞中很常见。BCR/ABL阴性的MPD是疾病的异质群体，包括真性红细胞增多症(PV)、特发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)，其特征在于，红系细胞、巨核细胞和骨髓系的增殖单独升高或共同升高。> 95% PV和50% ET和PMF患者中出现了获得性的常见体细胞突变JAK2-V617F。为了确定这些血细胞衍生的iPS细胞系能否作为模型，用于研究正常和异常的人体造血作用，可以使用有效的无血清分化方案将iPS细胞定向至造血谱系。从PV患者中(其中一人的血衍生的iPS细胞被使用)分离出的造血祖细胞(CD34+)的红细胞生成增力口，与此相似，由PV-iPS细胞产生的重分化造血祖细胞(⑶34+⑶45+)与正常⑶34+细胞衍生的iPS细胞产生的细胞相比，也表现出红细胞生成的增加。如本文所用，术语“皮质类固醇”是指一组与肾上腺皮质产生的天然皮质类固醇激素相似的药物。已知皮质类固醇通过多种机制抑制晚期过敏反应。皮质类固醇包括糖皮质激素和盐皮质激素。在本发明的一方面，皮质类固醇选自下组醛固酮、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、环索奈德、氯泼尼醇、可的松、可的伐唑、脱氧皮质酮、地奈德、去羟米松、地塞米松、双氟可龙、氟氯缩松、氟米松、氟尼缩松、肤轻松、醋酸氟轻松、氟考丁酯、氟可的松、氟可龙、氟米龙、氟氢缩松、氟替卡松、氟氯舒松、氢化可的松、艾可米松、甲泼尼松、甲泼尼龙、莫米松、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、罗氟奈德、RPR 106541、替可的松、去炎松及其可药用的衍生物。
在本发明的另一方面，皮质类固醇选自下组阿氯米松、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、环索奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、可的伐唑、地夫可特、去氧皮质酮、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、氟氯缩松、氟氢可的松、氟氢缩松、氟米松、氟尼缩松、氟轻松、醋酸氟轻松、氟可丁、氟可龙、氟米龙、氟培龙、氟替卡松、氟泼尼定、福莫可他、氯氟舒松、卤米松、醋丙氢可的松、氢化可的松丁丙酸酯、丁酸氢化可的松、氯替泼诺、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、醋丙甲泼尼龙、莫米松糠酸酯、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松、泼尼松龙、泼尼立定、利美索龙、替可的松、曲安西龙和乌倍他索，及其可药用的衍生物。在本发明的一方面，皮质类固醇是选自下组的糖皮质激素醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮质酮、地塞米松、氟氢可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、以及曲安西龙。在本发明的另一方面，皮质类固醇为地塞米松。 如本文所用，术语“重编程”是指分化状态的细胞转换为去分化状态的细胞的过程。重编程的细胞可以是多潜能或多功能细胞。如本文所用，术语“多潜能细胞”是指处于去分化或未分化状态，且可分化为各种细胞类型的细胞。多潜能细胞表达多潜能细胞特异性标记，并具有未分化细胞的细胞形态学特征(例如，紧密的集落、较高的核质比例、和/或明显的核仁)。典型地，多潜能细胞可被诱导分化成所有三种胚层(例如内胚层、中胚层和外胚层)。当通过皮下、肌内或睾丸内途径向体内引入多功能细胞时，可以在免疫受损的动物(例如SCID小鼠)中观察到畸胎瘤的形成(Thomson et al. (1998) Science 282:1145-47)。如本文所用，术语“多潜能基因”是指与细胞的多潜能性有关的基因。通常，多潜能基因仅在多潜能干细胞中表达，并且对于多潜能干细胞的功能的确定(identity)至关重要。多潜能干细胞是处于相对未分化状态的细胞，并且可以分化为不同类型的细胞。转录因子0CT4就是多潜能基因的一个示例，它是建立和维持胚胎干细胞的未分化表型所必须的(Nichols et al. (1998)Cell 95:379-91 ；Niwa et al. (2000)Nature Genet. 24 :372-76)。Nanog 是多潜能基因的另一个不例(Chambers et al. O 2003) Cell 113 :643-55 ;Mitsuiet al. (2003) Cellll3 (5) :631-42 ；Bortvin et al. (2003) Development 130(8) :1673-80;Saitou et al. (2002) Nature418 (6895) :293-300)。如本文所用，术语“多潜能因子”是指
多潜能基因表达的因子。如本文所用，术语“多潜能特征”是指与多潜能性有关的很多特征，包括，例如分化为各种细胞类型的能力和多潜能细胞典型的表达类型，包括多潜能基因的表达、干细胞表面标记的表达和与多潜能性有关的生物标记的表达。例如，一个重编程细胞可以表达碱性磷酸酶，但是不表达SSEA1，可以增殖超过30代，可以分化为肝细胞或造血细胞。另一个重编程细胞，例如，可以在细胞表面表达SSEA1，可以培养超过一年而不分化，也可以生长为内胚层、中胚层和外胚层组织。可以用一种或多种表面标记或生物标记的存在来定义重编程细胞。例如，某些重编程细胞表达碱性磷酸酶。某些重编程细胞表达SSEA1、SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、和/或TRA-1-81。某些重编程细胞表达0CT4、S0X2、以及Nanog。可以在mRNA水平或蛋白水平测定表面标记或生物标记的表达。 又例如，重编程细胞可以对碱性磷酸酶和SSEAl呈阳性，但是对SSEA4呈阴性。另外一个重编程细胞可以对Nanog、S0X2、以及0CT4呈阳性。在本发明的一方面，重编程细胞可以表达与抗体相互作用的细胞表面抗原，所述抗体能特异性结合TRA-1-60 (例如，ATCCHB-4783)和/或TRA-1-81 (例如，ATCC HB-4784)。进一步地，在本发明的另一方面，可以在没有滋养层的情况下维持重编程细胞。本发明的重编程细胞可以具有分化为不同谱系的各种细胞类型的潜能，所述的谱系包括成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌、内皮、间质、平滑肌、心肌、神经细胞、造血细胞、胰岛、或其他细胞类型。本发明的重编程细胞可以具有分化为所有细胞谱系的潜能。本发明的重编程细胞可以分化为很多谱系，包括1、2、3、4、5、6 10、11 20、以及多于20个谱系。本发明方法使用的多潜能基因或多潜能因子包括但不限于甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)、八聚体-4(0CT4)、Nanog、GABRB3、LEFTB, NR6A1、PODXL, PTEN、SRY (性别决定区 Y)-框 2(也称为 S0X2)、Myc、REX-I (也称为 ZFP42)、整联蛋白 α 6、ROXU LIF-R、TDGFl (CRIPTO)、SALL4 (sal 样 4)、白细胞衍生趋化因子 I (LECTI)、BUBI、F0XD3、NR5A2、TERT、LIFR、SFRP2、TFCP2L1、LIN28、XIST、以及 Kruppel 样因子(KLF)例如 KLF4 和 KLF5。本发明的方法可以使用I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11 20个、以及多于20个多潜能基因或多潜能因子。在一方面，本发明的方法使用至少三个多潜能基因或多潜能因子。在另一方面，本发明的方法使用至少四个多潜能基因或多潜能因子。在另一方面，本发明的方法使用至少五个多潜能基因或多潜能因子。在另一方面，本发明的方法使用至少六个多潜能基因或多潜能因子。根据本发明的方法，测试试剂可以是，例如，多核苷酸、肽、素拟肽、类肽例如乙烯类肽、有机小分子、或类似物，并且可以以任何不同的方式作用，以改变细胞功能。例如，测试试剂可以通过结合细胞表面受体产生细胞外作用，从而改变由配体结合介导的功能，所述配体通常与受体结合并通过受体作用。或者，测试试剂可以被动地或通过主动运输机制横穿细胞膜，并在细胞内产生作用改变功能。根据本发明所述的方法，肽测试试剂可包括大约两个至四个残基至几百或几千个氨基酸。如本文所用，术语“肽”并不表示含有分子的氨基酸包含特定大小或数量，肽测试试剂可以含有多达数个氨基酸残基或更多。可以通过，例如，化学合成方法制备肽测试试剂，或使用蛋白纯化方法，随后进行蛋白水解，并且如果希望的话，通过色谱法或电泳法进一步纯化，或者可以通过编码多核苷酸表达。此外，肽测试试剂可以基于已知肽，例如，天然存在的肽，但是可以与天然存在的序列不同，例如，通过在相应的L-氨基酸的位置上含有一个或多个D-氨基酸；或通过含有一个或多个氨基酸类似物，例如，在反应性侧链有衍生的或修饰的氨基酸。相似地，可以修饰肽测试试剂中的一个或多个肽键，或者可以修饰氨基末端或羧基末端或两端的反应性基团。这种肽对蛋白酶、氧化剂或其在生物环境中可能遇到的其他反应物质的稳定性提高。也可以修饰这种肽测试试剂以降低其在生物环境中的稳定性，使得肽在这种环境中的活性时间减少。根据本发明所述的方法，多核苷酸测试试剂可以包括大约两个至四个残基至几百或几千个核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”并不局限于两个或多个由磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。也可使用磷酸二酯键以外的的连接。
术语“多核苷酸”包括RNA和DNA，可以是基因或其一部分、cDNA、人工合成多聚脱氧核糖核苷酸序列或类似物，且可以是单链的或双链的，以及DNA/RNA杂合体。此外，如本文所用，术语“多核苷酸”包括可从细胞中分离的天然存在的核酸分子，以及人工合成分子，人工合成分子可以通过，例如，化学合成方法或酶法例如聚合酶链反应(PCR)制备。在不同的实施例中，本发明的多核苷酸可以包括核苷或核苷酸类似物，或磷酸二酯键以外的骨架键。总的来说，含有多核苷酸的核苷酸是天然存在的脱氧核糖核苷酸，例如与2，-脱氧核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或核糖核苷酸，例如与核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。但是，多核苷酸也可以含有核苷酸类似物，包括非天然存在的人工合成核苷酸或修饰的天然存在的核苷酸。所述核苷酸类似物是本领域已知的，并可通过商业获得，如含有所述核苷酸类似物的聚核苷酸(Lin et al. (1994)Nucl. AcidsRes. 22 :5220-34 ；Jellinek et al. (1995)Biochemistry 34 :11363-72 ;Pagratis etal. (1997) Nature Biotechnol. 15 :68_73，每篇文献均在此参考并入)。在多核苷酸中连接核苷酸的共价键一般是磷酸二酯键。但是，共价键也可以是任意的其他多种键，包括二硫酯键、硫代磷酸酯键、肽样键或现有技术已知的对连接核苷酸以产生人工合成聚核苷酸有用的其他任何键(参见，例如，Tarn et al. (1994)Nucl. AcidsRes. 22 :977-86 ；Ecker and Crooke (1995) BioTechnology 13 :351-60,每篇文献均在此参考并入)。当多核苷酸需要暴露于具有核酸降解活性的环境中时，例如，在组织培养基中或施用于活的主体时，掺入非天然存在的核苷酸类似物或连接核苷酸或类似物的键将特别有用，因为修饰的多核苷酸不容易被降解。可以通过化学合成或使用重组DNA方法，使用适当的多核苷酸作为模板，以生成含有天然存在的核苷酸和磷酸二酯键的多核苷酸。相比之下，含有核苷酸类似物或非磷酸二酯键共价键的多核苷酸一般是通过化学合成的，虽然如T7聚合酶这样的酶可以将一定类型的核苷酸类似物结合为多核苷酸，从而可以用于从适当的模板通过重组生成所述多核苷酸(Jellinek et al. (1995)Biochemistry 34:11363-72)。
可以通过使用本文公开的方法或现有技术已知的方法将多核苷酸测试试剂与细胞接触或引入细胞。通常，但不是必需地，将多核苷酸引入细胞，使其在细胞中直接、或经转录或翻译或两者之后发挥其作用。例如，多核苷酸可以编码肽测试试剂，肽测试试剂在细胞中表达并改变细胞的功能。多核苷酸测试试剂也可以是，或可以编码，反义分子、干扰RNA、小RNA、核酶或三联试剂，它们可以设计为靶向作用于一个或多个特异性的靶核酸分子。反义多核苷酸、核糖酶和三联试剂一般设计为与靶序列互补，其可以是DNA或RNA序列，例如mRNA，可以是编码序列、含有内含子-外显子连接的核苷酸序列、调控序列例如Shine-Delgarno序列等等。其互补的程度使得多核苷酸，例如，反义多核苷酸，可以在细胞中与靶序列特异性地相互作用。根据反义或其他多核苷酸的总长度，与靶序列的一个或几个错配序列是容许的，且不会失去多核苷酸对其靶序列的特异性。因此，在例如由20个核苷酸组成的反义分子中，可以容许有少量的错配序列，然而对于例如与编码细胞多肽的靶mRNA全长互补的反义分子而言，数个错配序列也不会影响反义分子的杂交效率。可以容许的错配序列数量可以通过例如确定杂交动力学的已知公式来估计(参见Sambrook, J.；Fritsch, E. F. and Maniatis, T. " Molecular Cloning A Laboratory Manual, " vol.
I.2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或可以使用本文公开的方法或现有技术已知的方法根据经验确定，特别是通过确定细胞中存在的反义多核苷酸、核酶、或三联试剂降低靶序列的水平或细胞中由靶序列编码的多肽的表达。可用作反义分子、核酶或三联试剂的多核苷酸可以抑制翻译或剪切核酸分子，从而改变细胞的功能。反义分子，例如，可以与mRNA结合，以形成在细胞中不能被翻译的双链分子。优选至少有约15至25个核苷酸的反义寡核苷酸，因为它们容易合成，并可以与靶序列特异性杂交，虽然也可以由引入靶细胞的多核苷酸表达出较长的反义分子。可以使用已知方法，例如，基因步移法(参见，例如，Seimiya et al. (1997) J. Biol. Chez. 272 =4631-36,其在此参考并入)，确定可用作反义分子的特定核苷酸序列。当反义分子与靶细胞直接接触时，它可以操作性连接于化学反应基团，例如，铁结合的EDTA，其在杂交位点将靶RNA剪切。相比之下，三联试剂可以使转录停顿(Maher et al. (1991)Antisense Res. Devel. I :227 ；Helene (1991)Anticancer Drug Design 6:569)。本发明筛选试验的进行可以通过将测试试剂与细胞在体内接触，例如，将细胞施予或植入主体之后进行，或者通过将测试试剂与细胞在体外接触，例如，将测试试剂加入到含有细胞的培养基中，或加入到向从培养基中分离出的细胞中。在未分化的多潜能干细胞中，由于与试剂接触而导致发生改变的功能可以是任意的功能。例如，功能可以是在细胞中通常表达(或不表达)的基因的表达，所述试剂对功能的改变可以通过增加或降低表达基因的表达水平(例如，降低阶段特异性的表面抗原_4、碱性磷酸酶、或0CT4转录因子的表达)，或通过开启细胞中未表达基因的表达(例如诱导阶段特异性的表面抗原-I的表达)。在一个实施例中，发挥细胞功能的试剂是诱导细胞分化从而产生分化细胞的试齐U。所述分化细胞可以是多功能人类肝细胞(例如造血干细胞)或可以是终末分化细胞(例如肌细胞、神经元细胞、血细胞、结缔组织、或上皮细胞)。因此，本发明的方法可用于鉴定试剂，其可诱导细胞分化为胰腺β细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、或其他细胞类型。本发明的筛选方法提供了如下优势它可适用于高通量分析，从而可用于筛选测试试剂的组合文库，以鉴定那些可以改变多潜能或多功能细胞的功能的试剂。现有技术已知多种方法，可用于制备分子组合文库以供检测所需的活性，包括，例如，制备肽的噬菌体展示文库的方法，所述肽可以是限制性肽(参见，例如，美国专利号5，622，699 ;美国专利号5,206, 347 ；Scott and Smith (1992)Science 249 :386-90 ；Markland et al. (1991)Gene109 :13-19 ;每篇文献均在此参考并入)；肽文库(美国专利号5，264，563，其在此参考并入)；素拟妝文库(Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14 :83-92 ；a nucleic acidlibrary (0 1 Connell et al. (1996)Proc. Natl. Acad. ScL, USA 93:5883-87 ；Tuerk andGold(1990) Science 249 :505-10 ；Gold et al. (1995) Ann. Rev. Biochem. 64 :763-97 ;每篇文献均在此参考并入)；寡糖文库(York et al. (1996) Carb. Res. 285 :99-128 ；Liang etal. (1996)Science 274 :1520-22 ;Ding et al. (1995)Adv. Expt. Med. Biol. 376 :261-69 ；每篇文献均在此参考并入)；脂蛋白文库(de Kruif et al. (1996)FEBS Lett. 399 =232-36,其在此参考并入)；糖蛋白或糖脂文库(Karaoglu et al. (1995) J Cell Biol. 130 :567-77,其在此参考并入)；或含有，例如，药物或其他药学制剂的化学文库(Gordon et al. (1994)J Med. Chem. 37 :1385-1401 ；Ecker and Crooke (1995) BioTechnologyl3 :351-60 ;每篇文献均在此参考并入)。 多核苷酸特别适用于作为改变细胞功能的试剂，因为自然界中存在对细胞靶点，包括细胞多肽具有结合特异性的核酸分子，也因为具有这种特异性的合成分子很容易制备和识别(参见，例如，美国专利号5，750，342，其在此参考并入)。对于高通量形式，可以将本发明的细胞引入多孔板或载玻片或微芯片的孔中，并且可以与测试试剂接触。通常，细胞的排列方式为阵列，特别是可寻址的阵列，从而可以使用机器人方便地操作细胞和溶液，并监测本发明的细胞，特别是监测待检功能。使用高通量形式的优势是可以平行地检测很多测试试剂，如果需要的话，也可以在与试验条件相同的条件下进行对照反应。因此，本发明的方法提供了筛选一个、数个或很多测试试剂的方法，以识别可以改变细胞功能的试剂，例如，诱导多潜能或多功能细胞分化为目标细胞类型的试剂，或防止自发分化的试剂，例如通过将调控分子例如0CT4的表达维持在较高的水平。本发明的游离型载体包括允许载体在细胞内自我复制的组分。例如，已知埃泼斯坦-巴尔oriP/核抗原-I (EBNA-I)组合可以在哺乳动物细胞，特别是灵长类动物细胞中支持载体自我复制。(Lindner and Sugden(2007)Plasmid 58(1) :1-12,在此整体参考并入)。适用于本发明构建表达载体的标准分子生物学技术是本领域的普通技术人员公知的，并可以在Sambrook等的“分子克隆实验室手册”(第三版，Cold Spring harbor Press, ColdSpringHarbor, N. Y. 2001)中找到，其整体在此参考并入。天然存在的脂肪酸和家常营养补充剂大大提高了从人类体细胞衍生出诱导多潜能干(iPS)细胞的效率。提供了新型生物活性分子，用于重编程和治疗因潜在突变导致的生物学结果。提供了将(来源于CB或成人PB的)血细胞重编程为多潜能或多功能干细胞的方法，以产生保持了天然和未改变基因组的iPS细胞(没有载体插入或体细胞突变)。提供了制备(准备(prime))PB和CB单核细胞以进行有效重编程的方法。提供了细胞因子和激素的混合物。在某些实施例中，地塞米松的加入(一种人工合成的糖皮质激素)是成功有效重编程的关键。提供了地塞米松和其他糖皮质激素(天然的或人工合成的)用于重编程体细胞，包括血细胞，并产生iPS细胞的用途。地塞米松和其他糖皮质激素已用于建立和扩增骨髓间质细胞/间质肝细胞(多功能干细胞或MSC)和红系祖细胞，但是在本发明之前，它们在重编程中的用途仍然未知。提供了从CB、成人血液和骨髓⑶34+细胞产生的iPS细胞系，以及它们向造血的定向分化。从脐带血衍生iPS细胞的技术有望很多个体生成组织相容性的干细胞，因为脐带血库中收集了大量的脐带血。由于从CB和成人来源获得的造血干/祖细胞难以在体外扩增，因此通过用衍生的iPS细胞进行无限扩增，加上进一步优化的造血分化方法，可以提供一个重要的备选方法，用于贮存和扩增组织相容性干细胞，以用于血液/BM移植。根据本发明，可以比较⑶34+细胞衍生的iPS细胞和其他出生后的细胞类型衍生的iPS细胞的重编程效率和性质。本发明提供了通过所述的重编程方法，生成具有体细胞突变的MPD特异性iPS细胞系，所述体细胞突变发生于血细胞谱系中。当衍生自MPD(PV和PMF)患者外周血的iPS细胞系被作为未分化的多潜能干细胞维持时，可以显示出典型的hES和iPS细胞的形态学和生长类型。一旦被诱导，它们就可以分化为源自三种胚胎胚层的各种细胞类型，包括造 血细胞。值得注意的是，由PV iPS细胞重分化的造血祖细胞可以显示出与PV患者的原代⑶34+细胞相似的红细胞生成增加的特征，而PV就是一种以红细胞生成过剩为特征的造血系统疾病。本发明也提供了衍生自PMF患者(MPD562)的两个iPS细胞系的完全特征。这些iPS细胞系可以一起为研究MPD发病机制提供一个潜在的模型系统。虽然对JAK2-V617F突变的发现显著促进了对MPD发病机制的理解，但问题仍然存在，包括JAK2-V617F克隆显性是如何发生的，一个突变如何促成三种不同的疾病。转基因鼠模型表明，JAK2-V617F的剂量效应可能会促成不同的MPD显性(Tiedt et al. (2008)Bloodlll :3931-40 ；Xing et al. (2008)Blood 111 :5109-17)。很多之前的研究表明，其他遗传或表观遗传事件对MH)发展很重要，最近的研究与此前的研究一致，证明了生殖细胞系中的 SNP 与 JAK2-V617F+MPD 的发展倾向有关。(Olcaydu et al. (2009)Nat Genet. 41 450-54 ；Kilpivaara et al. (2009)Nat Genet.41:455-59 ;Jones et al. (2009)NatGenet. 41 :446-49)。作为这些研究的补充，可更新的iPS细胞系和随后的造血分化技术可为研究MPD发病机制提供一个新颖的、潜在的模型。虽然当PV iPS衍生的造血祖(⑶34+⑶45+)细胞和来源于相同PV患者的原代⑶34+细胞与其各自的正常对照相比较时，在红细胞生成增加(图2)和基因表达类型(图3)方面显示出显著的相似性，但是可能只有少量的iPS克隆可用于阐明其造血潜能的完全特征。可以根据本发明，分析来源于更多PV和其他MH)患者和正常对照的其它iPS细胞系。另外，本发明提供了使用血细胞(带有JAK2-V617F突变)和骨髓间质细胞(缺乏JAK2突变)从相同的患者产生iPS细胞系的过程(Mercier et al. (2009)Exp Hematol. 37 416-20)，在配对的iPS细胞系建立后，可以根据本发明比较它们的造血潜能。结合在人类iPS和ES细胞中的改进的基因打靶技术，本发明提供了 iPS细胞系及其造血子代，作为有力的工具用于研究JAK2-V617F基因剂量和其他遗传变异如何影响MPD祖细胞的行为(Zouet al. (2009)Cell Stem Cell 5:97-110)。当前iPS技术的主要顾虑之一是反转录病毒的使用和基因组整合。本发明提供了无需永久基因组改变即可获得人成纤维细胞重编程的方法，可能也适用于人类血细胞(ffoltjen et al. (2009)Nature 458 :766-70 ;Yu et al. (2009)Science 324:797-801;Yusa et al. (2009)Nat Methods6 :363-69 ；Zhou et al. (2009)Cell Stem Cell 4 :381-84 ；Kim et al. (2009)Cell Stem Cell4 :472-76)。这些方法使我们可以从血细胞中衍生出适当的患者或疾病特异性iPS细胞，用于研究各种伴有获得性或遗传性突变的血液疾病。本发明也涉及人类血细胞的独特的表观遗传标记，允许通过非整合质粒进行有效的iPS细胞衍生。本发明提供了，通过I 2个质粒对人类成人外周血(PB)或脐带血(CB)细胞进行有效的重编程，以产生基因组未改变的诱导多功能干细胞(iPSC)。可将PB或CB单核细胞(MNC)或纯化的⑶34+细胞培养4 9天，然后用表达重编程基因的新型EBNAl/OriP质粒转染一次。两个质粒转染之后十四天，每IO6个转染的CB和PB⑶34+细胞可以分别获得平均250个和9个iPSC样克隆。或者，可以将未分割的MNC培养8 9天，并用同样的方法产生iPSC。在一个实施例中，表达5个细胞因子的单个EBNAl/OriP质粒也可以从所有培养的细胞类型中产生iPSC，虽然有效性比使用成人PB细胞低 5倍。重编程和扩增之后，游离型DNA逐渐在增殖的iPSC中消失。这些iPSC有未改变的核基因组和正常的核型，并且是多潜能性的。本发明提供了产生无整合的人类iPSC的方法，通过向短暂培养和准备的成人PB和CB MNC中转染质粒，这些成人PB和CB MNC显示出期望的表观遗传标 记，这会加速它们在研究和将来临床应用中的使用。自2007年以来，通过用病毒载体表达具体的重编程因子，以及从多种体细胞类型中产生了在形态学上和功能上与人类胚胎干细胞(ESC)相似的人类iPSC。从血液MNC中产生人类iPSC比其他细胞类型有若干优势(Yamanaka(2010)Cell Stem Cell 7(1) :1_2)。PB比表皮成纤维细胞和角质形成细胞更加容易获得，且损伤性更小，因为表皮成纤维细胞和角质形成细胞需要从皮肤活组织中经数周时间建立原代细胞培养物。发明人和其他人通过从脐带CB、成人PB和骨髓(BM)产生的表达⑶34或⑶133标记的人类未成熟MNC，使用表达4个或更少重编程基因的标准逆转录病毒载体，经过2 4天培养之后，已经成功地了产生 iPSC(Ye et al. (2009)Blood 114 :5473-80 ;Loh et al. (2009)Blood 113:5476-79;Giorgetti et al. (2009) Cell Stem Cell 5:353-57)。随后，5 个组通过使用病毒载体，将未分割的MNC经较长时间的细胞培养以使它们活化为增殖状态，并生成了人类iPSC。因为T细胞在PBMNC中最充足，并且易于扩增和被病毒载体感染，所以5项研究中所有或绝大部分衍生的iPSC均在T细胞受体(TCR)基因座有重排的核基因组，这也就不足为奇了。目前正在测试多种无病毒和无整合的方法，以有效地重编程人类出生后的细胞。但是，这些使用质粒或蛋白的公开的研究中，大部分报道的效率都极低，甚至当使用最简单的细胞类型时也是如此。相比于其他基于质粒的递送方法，例如piggyBac DNA转座子和延长表达并激活重编程人类出生后细胞的微环质粒，过去的二十年中已广泛使用的EBNAl/OriP游离型载体系统具有若干优势。从EBV基因组衍生的反式EBNAl元件和顺式OriP元件能使一个简单的质粒在增殖的人类细胞中复制并作为游离体持续存在。它也可以在人类ESC中以游离形式留存，且几乎不影响其自我更新和多潜能性。在没有任何选择的情况下，递送至人类ESC的游离型EBNAl/OriP质粒逐渐消失，这可能是由于质粒的表观遗传修饰(例如DNA甲基化)导致ENBAl表达和/或OriP功能的丧失。利用EBNAl/OriP质粒的独特性质，Thomson Yu的小组成功地将人类新生儿的成纤维细胞重编程为无整合的iPSC系(Yu et al. (2009) Science 324:797-801)。但是，即使使用了表达7个基因的3个ENBAl/OriP质粒，其效率仍然较低(每IO6个新生儿的成纤维细胞约3 6个)。随后，有报道表明，用表达较少基因的游离型载体重编程了人类胎儿神经干细胞。但是，为发展细胞疗法和建立疾病模型，非常需要开发一种有效的方法，从成人体细胞中产生无整合和无病毒的人类iPSC，而成人体细胞比其对应的胎儿/新生儿细胞在重编程方面的容许性更小。本发明提供了改善的EBNAl/oriP质粒，用于测试是否可以通过一个多顺反子的质粒，对出生后的体细胞实现有效的重编程。另外，本发明提供了更好的出生后的人类细胞类型，这些细胞类型容易获得、制备或准备以用于重编程，可被质粒有效地转染，并且更重要的是，可有效地生成高质量的iPSC。观察到人类⑶34+造血细胞具有较高的效率，这可能是因为与iPSC生成相关或必需的基因的表达水平较高，或者是因为在采用的培养条件下具有较高的增殖活性。并非相互排斥，高效率可能是由于未成熟的人类造血细胞在细胞培养和细胞因子活化之后具有的有利的表观遗传标记。本发明提供了对以下细胞的全基因组启动子的DNA甲基化特征的分析来源于CB、成人PB和BM的培养的人类CD34+细胞(每个2份样品)，成人BM衍生的培养的MSC (4份样品)和IMR90胚胎成纤维细胞，以及通过各种载体从这些体细胞衍生的17个iPSC系。另外,包括了至少11份ESC样品,用于建立本底水平。使用IUumina' slnfinium Methylation27平台，以单核苷酸的分辨率，在启动子区附近的27，578个有信息的CpG位点处检测DNA的甲基化，其超甲基化与基因表达的抑制有关。排除位于X和Y染色体的1091个基因座，使用皮尔森相关系数的树状图表明，来源于各种体细胞的17个经验证的iPSC系与ESC高度相似，但是与其亲代细胞不同(图8A)。本发明提供培养的CD34+细胞集群，与MSC/胚胎成纤维细胞组相比，CD34+细胞集群与ESC/iPSC组更近。为了更密切地检查该特征，本发明提供了对数据的K均值集群分析(图SB)。分析了 26，487个常染色体基因座的启动子的DNA甲基化水平(从O到I)。根据体细胞中启动子DNA甲基化与作为本底的11个ESC的相对水平，得到四个不同的集群。集群2(体细胞中较高，但是ESC中较低，含有最多的多潜能基因)和集群3 (体细胞中较低，ESC中较高)含有的基因座表明体细胞和ESC之间的启动子DNA甲基化水平不同。MSC中有15. 4%的基因座与ESC不同，⑶34+细胞中只有10. 8%的基因座与ESC不同，表明通过该整体分析，⑶34+HSPC更接近于ESC(和iPSC，未显示)。当发明人进一步研究在MSC中超甲基化而在⑶34+细胞和ESC/iPSC中低甲基化的基因时，发明人注意到这些基因与多潜能性有关，例如HMGAl和CD34标记基因(X，Y)。将新型ENBAl/OriP质粒组合用于重编程具有有利的表观遗传标记的CB⑶34+细胞。在第一个ENBAl/OriP质粒(称为pEB_C5)中，5个重编程因子(0CT4、S0X2、KLF4、c-MYC和LIN28)被表达为单个多顺反子单元。在第二个ENBAl/OriP质粒组合中，各自表达了 SV40大T抗原(Tg)、NANOG或靶向作用于p53的小发夹RNA(p53shRNA)。在第一组3项试验中，使用pEB-C5和pEB-Tg质粒,与Thomson/Yu的含有3个质粒的6号组合相比较。用细胞因子扩增(大约5倍)4天之后，CB CD34+细胞被转染一次，然后根据衍生人类iPSC的标准方案进行培养。本发明提供了产生iPSC的方法，其中将分离的CBCD34+细胞用细胞因子培养4天，然后在第O天用2个或3个质粒(总共10 μ g DNA)进行核转染。将转染细胞再培养2天，然后转移至包被有MEF滋养细胞的6个孔。在第3天，使用含有或不含有NaB (0. 25mM)或VPA (0. 5mM)的ESC培养基。第9天之后，使用MEF衍生的条件培养基(CM)替代普通ESC培养基。与2质粒组合(pEB-C5+pEB-Tg)相比，Thomson/Yu的6号组合能更有效地产生转化的集落。在第14天，用TRA-1-60抗体将培养物进行活细胞染色。计数所有的集落，然后挑选出有ESC样形态学的TRA-1-60+集落。但是，即使到了第10-14天时，6号组合的大部分集落仍然不是ESC样，与之前的新生儿成纤维细胞的报道一致。少数对TRA-1-60染色阳性，TRA-1-60是在人类ESC和iPSC中表达的细胞表面标记。已表明，获得TRA-1-60或相关抗原TRA_1_81的细胞表面表达是监测人类体细胞完全重编程的更好的标记。本发明提供了在第14天对全部培养基进行活细 胞染色，并计算出TRA-1-60阳性和阴性集落。2质粒组合产生的TRA-1-60+集落在数量上与6号组合相似(图8D)，但是它们在总集落中所占的百分比更高(图SE)。丁酸钠( NaB)，一种刺激人类成纤维细胞重编程的HDAC(组蛋白去乙酰化酶)抑制剂，也可以通过任何一种载体组合始终提高TRA-1-60+集落的数量(和百分比)(图8D和8E)。在第二组实验中，发明人用NANOG或p53shRNA替换Tg，或完全省略Tg(图8F和8G)。通过向pEB-C5质粒中加入pEB-Tg质粒产生TRA-1-60+集落的总效率与通过表达p53shRNA或NANOG的EBNAl/OriP质粒产生TRA-1-60+集落的总效率(程度较小)相似，但是p53shRNA产生更多不需要的TRA-1-60-集落。单独用pEB_C5质粒也能够从IO6个核转染细胞中(从最初大约O. 2 X IO6个⑶34+细胞扩增4天之后)产生大约50个TRA-1-60+集落。当在重编程过程中，在NaB存在时使用pEB-C5，产生大约160个TRA-1-60+集落(图8F)。TRA-1-60染色之后，发明人挑选出单个的ESC样集落，这些集落是通过用单独的PEB-C5 (C)、pEB-C5+pEB-Tg (CT)或在NaB存在时(CTN)转染而衍生得到。检测了每种类别中通过标准方法得到的至少两个CB衍生的克隆。可以观察到一种代表性克隆，CT5，的未分化表型。通过C5+Tg游离型载体从CB⑶34+细胞(男性)衍生的iPSC(克隆CT5)的未分化表型可以被各种抗选择性标记的抗体染色。0CT4、NANOG、SSEA4以及TRA-1-60标记的免疫荧光染色可以表明，扩增的CT5克隆显示出对人类ESC/iPSC独特的未分化表型。也可以以相似的方式检查其它的克隆，例如CTN4和C7。本发明提供了 6个克隆中的5个具有正常核型(CT5和CTN4)。可以检查iPSC克隆CT5和CTN4 (由C5+Tg载体加上NaB衍生的另外一个代表性克隆)的核型，并表现出正常的男性核型。也可以观察到来源于女性样品的由单个质粒(PEB-C5)的核转染衍生的两个iPSC系(C7和CNl)的正常核型。由单个载体(PEB-C5)衍生的两个扩增iPSC克隆的核型也均正常，并表现出未分化的表型。本发明提供了全基因组SNP分析，以检查CT5和CTN4基因组与来自相同CB供体的原代CB⑶34-细胞的相似性。全基因组数据(覆盖> IO6SNP)表明，CT5和CTMiPSC在本质上与CB供体的CD34-细胞相同，并且游离型载体的重编程不会导致基因组发生可检测的改变。本发明也提供了不同时期重编程细胞中游离型DNA存在的分析。本发明提供了使用EBNAUTg或β-actin (基因组DNA)的特异引物，对游离型DNA进行PCR检测。未转染(天然)细胞和在PEB-C5转染之后第2天收集的细胞可以分别作为阴性或阳性对照。pEB-Tg质粒(含有EBNAl和Tg DNA)可以用作普通的DNA对照，数量相当于每个细胞DNA基因组I个或O. 2个拷贝。通常，在重编程(14天)和扩增9代(大约50天)之后，可以检测到痕量的游离型DNA (每个细胞< O. 2个拷贝)，但是到第11 12代，就检测不到了。该数据与之前的新生儿成纤维细胞或胚胎神经祖细胞的报道一致，即人类iPSC中EBNAl/OriP游离型DNA在重编程之后逐渐消失。对具有或没有Tg(CT5、CTN4和C7)短暂表达而衍生的iPSC系也进行了多潜能性的测定。本发明提供了通过胚状体(EB)形成而进行的体外多潜能性试验。可以发现由外胚层(β_3-微管蛋白)、中胚层(平滑肌肌动蛋白)和内胚层(α-胎蛋白或AFP)衍生的细胞类型。本发明也提供通过畸胎瘤形成而进行的体内多潜能性试验。可以发现各种细胞类型，例如神经菊形团(外胚层)、软骨(中胚层)和腺状结构(内胚层)。可以观察到CTMiPSC克隆的多潜能性数据。基本上，所有3个克隆(CT5、CTN4和C7)显示出的多潜能性与人类ESC和其他确证的iPSC均无差别。CT5和CTN4的全基因组启动子DNA甲基化分析也表明，它们相互接近，并且与其他iPSC和ESC密切相关(图8A)。相同的分析也揭示了，多潜能基因，例如CT5和CTMiPSC中的0CT4，的启动子上的DNA甲基化。本发明提供了一种通过I个或2个EBNAl/OriP质粒从人类成人PB或BM CD34+细胞衍生iPSC的方法。4天培养和扩增之后，用相同的质粒组对IO6个准备的细胞进行核 转染。在第10 12天出现ESC样克隆，比那些来源于⑶34+细胞的克隆晚大约4天。在第14天进行活细胞染色之后，可以计数TRA-1-60+重编程集落的数量(图9A和9B)。由同样的载体组转染的每IO6个细胞中，成人CD34+细胞的重编程效率比CB CD34+细胞低大约20 40倍。如前所述，挑选并扩增通过单个PEB-C5载体(即没有Tg)从成人⑶34+细胞衍生的人类iPSC克隆。在5-12次传代之后，对来源于PB⑶34+细胞(PCI)的一个克隆和来源于BM⑶34+细胞(BCl)的一个克隆进一步进行表征。人类血细胞，特别是来源于CB、成人BM和PB的HSPC富集的⑶34+组群，与年龄匹配的成纤维细胞或成人BM衍生的MSC相比，更倾向于被逆转录病毒载体和质粒重编程。这可能是部分因为CD34+HSPC中独特的表观遗传标记。通过三种不同的方法分析全基因组启动子DNA甲基化的数据，其均指向一个相似的结论，即人类CD34+HSPC与ESC/iPSC的相关性比其与成人MSC的相关性更密切(图8)。但是，这些表观遗传的差异还不足以解释所观察到的CB和成人PB CD34+HSPC之间20 40倍的差异。一个可能的因素是CBCD34+细胞比成人CD34+HSPC增殖更快，这会通过细胞分裂依赖性的机制促进(表观遗传学的)重编程。第二个促成CB⑶34+细胞较高效率的可能因素与个体发生学有关，因为这些细胞是来源于新生儿。更多的表观遗传学测量和更好的DNA甲基化覆盖度会使我们能够解释支配重编程或总体细胞命运确定的分子机制。本发明的EBNAl/OriP载体系统在几个方面优于之前的载体组合，例如6号组合。首先，PEB-C5质粒(+/-pEB-Tg)产生较高百分比的TRA-1-60+前-iPSC集落，特别是在NaB存在的情况下，可促进目标TRA-1-60+集落的分离。其次，如果需要省略或用其他因子替换Tg，那么该平台会更灵活。本发明提供了在其他成人体细胞类型(例如成人MSC)中的pEB-C5+/-pEB-Tg质粒系统，当在这些细胞中使用6号组合时，效率较低(每IO6个细胞< 2个集落)。本发明灵活的载体系统允许直接比较Tg过度表达和p53敲除对重编程的效应。Tg可以阻断p53和RB蛋白的功能，从而促进细胞增殖，p53和RB蛋白是细胞周期进展的主要负调控物。本发明提供了，当使用Tg或p53shRNA进行瞬时表达时，人类出生后的血细胞的重编程效率可以激活3 6倍(图9和10)。重要的是，没有观察到基因组改变。因此，当使用游离体介导的瞬时表达时，使用Tg或p53shRNA的益处(提高重编程效率)对比于风险(改变基因组的完整性)更有利。在一些实施例中，本发明可以用单个ENBAl/OriP质粒递送5 6个基因以进行瞬时表达，使用多少因子已不再重要。本发明使用I 2个质粒，用完整的基因组衍生出iPSC系的简便方法相比于病毒介导方法的具有多种优势，包括将来在GMP条件下可能更易于转换以生成临床级别的IPSC0 一旦未分割的PBMC的培养有进一步的改进，并且有一种更有效地转染更少细胞的方法，本发明就能提供通过EBNAl/OriP质粒更有效和一致地重编程这些细胞的能力。从少量血液中有效地衍生出无整合的iPSC会把iPSC技术引入一个新水平。在一个实施例中，本发明涉及一种重编程主体血细胞的方法。所述方法包括将多种因子引入血细胞，从而将血细胞重编程为多潜能或多功能干细胞。在一方面，生成了一个稳定的细胞系。在一方面，在血细胞中引入表达多种因子的病毒DNA构建体。在其它方面，病毒构建体是慢病毒构建体或腺病毒构建体。在另一方面，病毒DNA构建体包括多种多潜能因子，其与至少一个调控序列操作性连接，以表达所述多种多潜能基因。在另一方面，使用非病毒 构建体在血细胞内表达所述多种因子。在另一方面，本发明的方法进一步包括向细胞加入至少一种皮质类固醇。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇包括人工合成的糖皮质激素。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇包括地塞米松。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇选自下组醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮质酮、地塞米松、氟氢可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、以及曲安西龙。在另一方面，所述方法进一步包括向细胞中加入至少一种细胞因子。在一方面，所述至少一种细胞因子选自下组睾丸支持细胞因子(SCF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促红细胞生成素(EPO)、以及白介素3 (IL-3)。在另一方面，所述至少一种细胞因子包括睾丸支持细胞因子(SCF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3或FL)、以及促血小板生成素(TPO)。在另一方面，所述至少一种细胞因子包括睾丸支持细胞因子(SCF)、促红细胞生成素(ΕΡ0)、以及白介素3(IL-3)。在另一方面，所述多种因子包括多潜能因子。在另一方面，血细胞为脐带血(CB)细胞、成人骨髓(BM)CD34+细胞、成人外周血(PB)细胞、成人外周血(PB)CD34+细胞、成人外周血(PB)CD34+CD45+细胞、或成人外周血单核细胞(PBMC)。在其它方面，PBMC来源于镰状细胞性贫血患者。在其它另一方面，PBMC包括S⑶B003细胞。在另一方面，所述主体获得体细胞突变。在另一方面，所述主体为哺乳动物。在其它方面，所述主体为人类。在另一方面，所述主体有骨髓增殖性疾病(MPD)并获得JAK2-V617F体细胞突变。在另一方面，多潜性或多功能干细胞包括造血干细胞。在另一方面，多种因子包括至少四个选自下组的因子S0X2、S0X7、S0X17、0CT4、Nanog、LIN28、c_Myc、KLF4、ESRRB,EBFU C/EBPa、C/EBP β、NGN3、PDX以及MAFA，或其活性片段。在另一方面，多种因子包括0CT4、S0X2、KLF4、以及c_Myc，或其活性片段。在另一方面，多种因子包括0CT4、S0X2、KLF4、MYC、LIN28、以及SV40T抗原，或其活性片段。在另一实施例中，本发明涉及一种重编程主体血细胞的方法。所述方法包括(a)将第一个游离型载体引入血细胞；(b)从(a)的细胞产生稳定的细胞系；以及(c)通过多次传代，(b)的稳定细胞系中失去第一个游离型载体，从而将血细胞重编程为多潜能或多功能干细胞。在一方面，所述方法进一步包括向血细胞中引入第二个游离型载体。在其它方面，所述第二个游离型载体表达SV40T抗原(Tg)。在另一方面，所述第一个游离型载体包括多个多潜能基因，所述多潜能基因与至少一个调控序列操作性连接以表达多种多潜能因子。在其它方面，所述游离型载体为oriP/EBNAl质粒。在另一方面，所述方法进一步包括向细胞中加入至少一种皮质类固醇。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇包括人工合成的糖皮质激素。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇包括地塞米松。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇选自下组醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮质酮、地塞米松、氟氢可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、以及曲安西龙。在另一方面，所述方法进一步包括向(a)细胞中加入至少一种细胞因子。在一方面，所述至少一种细胞因子选自下组睾丸支持细胞因子(SCF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促红细胞生成素(EPO)、以及白介素3 (IL-3)。在 另一方面，所述至少一种细胞因子包括睾丸支持细胞因子(SCF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3或FL)、以及促血小板生成素(TPO)。在另一方面，所述至少一种细胞因子包括睾丸支持细胞因子(SCF)、促红细胞生成素(ΕΡ0)、以及白介素3(IL-3)。在另一方面，血细胞为脐带血(CB)细胞、成人骨髓(BM)⑶34+细胞、成人外周血(PB)细胞、成人外周血(PB)CD34+细胞、成人外周血(PB)CD34+CD45+细胞、或成人外周血单核细胞(PBMC)。在其它方面，PBMC来源于镰状细胞性贫血患者。在其它另一方面，PBMC包括SCDB003细胞。在另一方面，所述主体为哺乳动物。在其它方面，所述主体为人类。在另一方面，多潜能或多功能干细胞包括造血干细胞。在另一方面，所述第一个oriP/EBNAl表达至少四个选自下组的因子S0X2、S0X7、S0X17、0CT4、Nanog、LIN28、c_Myc、KLF4、ESRRB,EBFl、C/EBPa、C/EBP0、NGN3、PDX以及MAFA，或其活性片段。在其它方面，所述第一个oriP/EBNAl表达0CT4、S0X2、KLF4、Myc、以及LIN28，或其活性片段。在另一方面，在步骤(c)之后，所述第一个游离型载体不管是作为游离体还是在稳定细胞系的基因组中均检测不到。在另一实施例中，本发明涉及一种建立疾病模型的方法。所述方法包括用待测试剂以如上所述任何方法接触多潜能或多功能干细胞，并检测待测试剂存在与待测试剂不存在时相比，功能的改变。在另一实施例中，本发明涉及产生主体特异性分化细胞的方法。所述方法包括对如上所述的任何方法产生的多潜能或多功能干细胞进行诱导分化，从而获得分化细胞群。在一方面，所述分化细胞包括血细胞、肌细胞、神经元细胞、结缔组织、或上皮细胞。在另一方面，所述分化细胞包括血细胞。在备选的一方面，所述分化细胞不包括血细胞。在另一方面，所述分化细胞包括胰腺β细胞、肝细胞、心肌细胞、或骨骼肌细胞。在另一实施例中，本发明涉及一种确定试剂的方法，所述试剂能改变主体特异性的分化细胞的功能。所述方法包括用待测试剂接触上述任何方法中描述的主体特异性分化细胞，并检测在待测试剂存在与待测试剂不存在时相比，功能的改变，从而确定所述待测试剂是改变主体特异性分化细胞的功能的试剂。在一方面，所述功能包括至少一种生物标记的表达水平。在另一实施例中，本发明涉及多种从血细胞重编程的分离的多潜能或多功能干细胞。在一方面，所述分离的多潜能或多功能干细胞根据如上所述的任何方法产生。在另一方面，所述分离的多潜能或多功能干细胞表达一种选自下组的细胞表面标记SSEA1、SSEA3、SSEA4、TRA-l-60、以及 TRA-1-81。在另一实施例中，本发明涉及多种分离的主体特异性分化细胞，其中所述主体特异性分化细胞根据如上所述的任何方法产生。在一方面，所述主体特异性分化细胞包括血细胞、肌细胞、神经元细胞、结缔组织、或上皮细胞。在额外的一方面,所述主体特异性分化细胞包括血细胞。在备选的一方面，所述主体特异性分化细胞不包括血细胞。在另一方面，所述主体特异性分化细胞包括胰腺β细胞、肝细胞、心肌细胞、或骨骼肌细胞。在另一实施例中，本发明涉及未分化的多潜能或多功能干细胞的培养物，其中所述培养物包括根据如上所述任何方法产生的多潜能或多功能干细胞。在另一实施例中，本发明涉及主体特异性分化细胞的培养物，其中所述培养物包括根据如上所述任何方法产生的主体特异性分化细胞。在一方面，所述主体特异性分化细胞包括血细胞、肌细胞、神经元细胞、结缔组织、或上皮细胞。在其它方面，所述主体特异性分化细胞包括血细胞。在备选的一方面，所述主体特异性分化细胞不包括血细胞。在另一方面，所述主体特异性分化细胞包括胰腺β细胞、肝细胞、心肌细胞、或骨骼肌细胞。 在另一实施例中，本发明涉及一种治疗需更换或更新细胞的疾病的方法。所述方法包括给予主体有效量的根据如上所述任何方法产生的多潜能或多功能干细胞。在另一实施例中，本发明涉及一种治疗需更换或更新细胞的疾病的方法。所述方法包括给予主体有效量的根据如上所述任何方法产生的分化细胞。在另一实施例中，本发明涉及一种重编程非病毒游离型载体。所述非病毒游离型载体包括至少四个多潜能基因，所述多潜能基因与至少四个调控序列操作性连接以表达至少四种多潜能因子。在一方面，所述非病毒游离型载体包括oriP/EBNAl质粒。在另一方面，所述非病毒游离型载体是oriP/EBNAl质粒。在一方面，所述非病毒游离型载体包括至少五个多潜能基因，所述多潜能基因与至少五个调控序列操作性连接以表达至少五种多潜能因子。在另一方面，所述非病毒游离型载体包括至少六个多潜能基因，所述多潜能基因与至少六个调控序列操作性连接以表达至少六种多潜能因子。在另一方面，所述非病毒游离型载体包括至少七个多潜能基因，所述多潜能基因与至少七个调控序列操作性连接以表达至少七种多潜能因子。在另一实施例中，本发明涉及一种提高细胞重编程效率的方法。所述方法包括向细胞中加入至少一种皮质类固醇。在另一实施例中，所述方法涉及一种使多潜能或多功能干细胞生成增加的方法。所述方法包括向细胞中加入至少一种皮质类固醇。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇包括人工合成的糖皮质激素。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇包括地塞米松。在另一方面，所述至少一种皮质类固醇选自下组醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮质酮、地塞米松、氟氢可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、以及曲安西龙。在另一方面，所述方法进一步包括向细胞中加入至少一种细胞因子。在一方面，所述至少一种细胞因子选自下组睾丸支持细胞因子(SCF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促红细胞生成素(EPO)、以及白介素3(IL_3)。在另一方面，所述至少一种细胞因子包括睾丸支持细胞因子(SCF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3或FL)、以及促血小板生成素(TPO)。在另一方面，所述至少一种细胞因子包括睾丸支持细胞因子(SCF)、促红细胞生成素(EPO)、以及白介素3(IL-3)。提供了以下实施例以进一步说明本发明的优势和特点，但并不旨在限制本发明的范围。虽然它们代表了那些可能使用的实施例，但是也可以选择使用本领域技术人员所知的其他程序、方法或技术。除非另有说明，否则所有引用文献均参考并入。
实施例实施例I人类CD34+细胞和通过转基因重编程人类ES细胞和iPS细胞的扩增培养基和条件人类iPS细胞的衍生、扩增和核型分析(G带显带技术)的培养基和培养条件之前已有描述(Mali et al. (2008) Stemcells26 :1998-2005)。
来源于CB和成人BM的冷冻的人类CD34+细胞购自AllCells and Poietics (现在是Lonza的一部分)。在本研究中也使用了来源于在约翰霍普金斯慢性骨髓增殖性疾病中心(Moliterno et al. (2008)Exp Hematol. 36 :1480-86)登记的两名患者的之前冷冻的PB⑶34+细胞，并获得了这两名患者的书面同意。用G-CSF动员之后分离的PB⑶34+细胞购自AllCells,并用作正常对照以分析基因表达。从Addgene (www. addgene. org)获得了由Dr. Yamanaka实验室构建的四个典型的逆转录病毒载体,pMXs-0ct4、pMXs-Sox2、pMXs_Klf4以及pMXs_c_Myc,其编码(小鼠)重编程因子。由三种质粒的混合物转染293T细胞。得到逆转录病毒的上清液，这三个质粒为一个转导(重编程)载体，一个表达VSV-G包膜蛋白的质粒和一个表达逆转录病毒Gag/Pol基因的辅助质粒。解冻后，将CD34+细胞与细胞因子SCF(100ng/ml)、FL(50 100ng/ml)和TP0(20ng/ml)培养2 4天，然后用逆转录病毒转导。将刺激后的⑶34+细胞(2X105)与含有4ng/ml聚凝胺的逆转录病毒上清液混合，并用相同的培养基和三种细胞因子培养。在转导和培养2 3天之后，转导的细胞在转导之后的第5天以4X IO5细胞/孔的密度置于6孔板中。在预铺板的胚胎成纤维细胞(MEF)滋养细胞中进行培养，以进行与之前描述相似的重编程(Mail et al. (2008) Stem Cells 26:1998-2005)。在第 7 天，使用 hES 细胞培养基直到最后。实施例2对未分化的iPS细胞及其衍牛物讲行免疫染色TRA-1-60 活细胞染色在 hES 培养基中稀释 TRA-1-60 抗体(Millipore，l 300)和Alexa555-结合二抗抗鼠IgM(Invitrogen, I : 400),并将其加入重编程板。将平板在37°C下孵育I小时，然后将培养基改变为新鲜的条件培养基。在倒置荧光显微镜下鉴定TRA-1-60阳性集落。按照之前描述的方法，对iPS克隆进行未分化标记物的免疫染色，并在胚状体(EB)形成之后，对分化细胞进行免疫染色(Mail et al. (2008) Stem Cells 26 :1998-2005 ；Chen et al. (2008)Cell Stem Cell 2 :345-55 ；Yu et al. (2008)Cell Stem Cell 2 461-71)。实施例3多潜能性的畸胎瘤形成试验
通过胶原酶IV (Sigma)消化获取三至五百万iPS细胞，用PBS洗涤，在200 μ L稀释(I I)基质胶溶液中重悬浮。将细胞经肌肉内注射进入Rag-/-Y C-/-小鼠，或其他改良的天然杀伤细胞水平进一步降低的免疫缺陷小鼠体内。注射6 10周之后切除肿瘤。如前所述进行组织学处理(Mail et al. (2008) Stem Cells 26 :1998-2005 ;Chen et al. (2008)Cell Stem Cell2 :345-55 ;Yu et al. (2008)Cell Stem Cell 2:461-71)。根据生产商的推荐条件，使用Trizol试剂(Invitrogen)提取畸胎瘤RNA。如前所述对AFP、CD34、PAX6、0CT4 和 NANOG 人类基因进行 RT-PCR(MaiI et al. (2008) Stem Cells 26 :1998-2005 ;Chenet al. (2008)Cell Stem Cell 2 :345-55 ;Yu et al. (2008)Cell Stem Cell 2:461-71)。实施例4DNA指纹图谱和TAK2V617F等位某闵分析根据所述方法,进行基因组DNA分离，并使用Invitrogen的用于PCR的MapPairs引物测定DNA指纹图谱。如前所述，使用JAK2-V617F的定制TaqMan SNP基因分型试验(Applied Biosystems)进行 JAK2 等位基因分析(Moliterno et al. (2006)Blood 108 3913-15 ；Molitemo et al. (2008)Exp Hematol. 36 :1480-86)。实施例5分化和数据分析造血分化和分析通过改进的EB形成方法(称为spin-EB)和在无滋养细胞和无血清的条件下进行造血分化，检查⑶34+细胞衍生的iPS细胞的造血分化潜能，方法与之前描述的相似(Yu et al. (2008)Cell Stem Cell 2:461-71 ；Ng et al. (2005)Blood 106 1601-03 ；Ng etal(2008)NatProtoc. 3 :768-76)。在第 2 3 周之间收获 EB，并如前所述，通过造血集落形成实验和FACS，分析是否存在造血标记(Yu et al. (2008) Cell Stem Cell2 :461-71 ；Zhan et al. (2004) Lancet 364 :163-71)。如前所述，使用细胞离心涂片器(Zhanet al. (2004) Lancet364 :163-71),并用 Hema 3 染色组合(Fisher Diagnostics)染色载玻片。液体培养基中的红系分化和扩增spin-EB造血分化之后二至三周，用FACS分选从年龄匹配的正常iPS EB和PV-iPS EB，从中收集CD34+CD45+细胞群。在含有SCF(20ng/ml)、IL-3(50ng/ml)和EP0(lU/ml)的无血清培养基中培养2 X IO4个CD34+CD45+细胞。在第7天收获细胞，并计数相应的细胞数。也用抗⑶235a抗体(BD Biosciences)和抗⑶45抗体(Invitrogen)将分化的细胞染色，以进行FACS分析。数据呈现和统计对于流式细胞计数(FACS)分析，收集并分析至少10，000个事件。显示了总活细胞中所选细胞群的百分比(基于使用同种型配对的抗体时与显示的背景染色的对比)。直方图中显示了平均值和标准差(SD)。当复制次数(η)较小时(η < 10)，应用Wilcoxon双样本检验。用SAS 9. I包(SAS Institute, Cary, NC, USA)在无监督下进行该检验。如果P为O. 05或更小，结果就判断为具有统计学意义。实施例6基因表汰的定量实时PCR分析EB介导的造血分化(21天)之后，分选来源于正常BM⑶34+细胞衍生的iPS和MPD183CD34+细胞衍生的iPS的CD34+CD45+细胞，并根据生产商(Invitrogen)的方案使用Trizol试剂对其进行RNA提取。使用随机的六聚物制备cDNA，并使用由AppliedBiosystems供应的针对核因子I-B(NFI-B)、血红蛋白(HBG)、和血红蛋白-β (HBB)基因的引物和探针进行定量PCR。使用7500实时PCR系统(Applied Biosystems)进行实时PCR0使用人类白血病细胞系DAMI生成标准曲线。用相同细胞样品中的β-acin对单个基因的表达信号进行标准化。实施例7脐带血和成人CD34+细胞的重编程为了检测出生后的人类血细胞能否通过常规的四种重编程因子进行重编程，测试了从CB和成人BM纯化的、在培养基中显示出广泛的增殖潜能的⑶34+细胞(Novelli etal. (1999)Hum Gene Ther. 10 =2927-40)。将CD34+细胞解冻，培养并活化2 4天以刺激细胞增殖(Novelli et al. (1999) Hum Gene Ther. 10 :2927-40)，然后用 4 种标准逆转录病毒载体进行基因转导(Takahashi et al. (2007)Cell 131 :861-72)。在CB样品中转导基因之后大约第16天，以及在成人BM CD34+细胞中大约第21天，出现了与人类ES/iPS细胞相 似的集落。一周之后，用TRA-1-60抗体对整个培养基进行活细胞染色，抗体可以识别未分化的hES和iPS细胞上的细胞表面表位。本发明提供了，在CB⑶34+细胞转导之后3 4周，活的培养物可以被TRA-1-60抗体染色。可以在第3周首次见到TRA-1-60+集落，并在第4周挑选(再次染色之后)。本发明提供了，TRA-1-60染色也是一种简便、可靠的鉴定人类血细胞衍生的候选iPS集落的方法。BM⑶34+细胞转导之后4周，用TRA-1-60和第二荧光试剂进行活细胞染色之后，可以识别出多个集落。小部分形成的集落是TRA-1-60+。单独挑选出TRA-1-60+集落并生成iPS克隆。扩增之后，挑选的TRA-1-60阳性的克隆显示出特征性的hES/iPS细胞形态，并表达了包括TRA-1-60在内的其他多潜能标记。可以观察到从CB扩增的iPS细胞的免疫荧光染色图像。除了 TRA-1-60，它们也表达其他多潜能标记，包括NANOG和SSEA4。它们不再表达⑶34或⑶45标记，反而从内源性的基因座表达0CT4和NANOG基因(图I)。扩增> 9代之后，检查的多个iPS系仍保持正常的核型。通过分化实验，例如体外胚状体(EB)形成和体内畸胎瘤形成，证明了这些iPS克隆的多潜能性，其生成了由三个胚层衍生的多种细胞类型。通过胚状体(EB)形成(10天)并进行体外分化之后，可以观察到CB衍生的iPS细胞的分化潜能，可以观察到内胚层的AFP染色，中胚层的CD34染色和外胚层的b-III微管蛋白染色。另外，CB衍生的iPS细胞形成畸胎瘤之后，可以观察到体内的分化潜能。切片之后，各种载玻片的苏木精-伊红染色可以显示来源于三个胚层的各种组织肠上皮(内胚层)、软骨(中胚层)和糖原生成上皮(外胚层)。免疫荧光染色之后，可以看见表达AFP、⑶34和β-III微管蛋白(一种外胚层标记)的分化细胞。将特定染色的图像与细胞核的DAPI染色叠加。因此，由人类CB和成人BM⑶34+细胞系衍生的iPS细胞在形态上、表型上和功能上均与hES细胞和成纤维细胞衍生的iPS细胞相似。由MPD患者的外周血细胞衍生的人类iPS细胞系测试了从两名MPD患者(没有G-CSF 动员)的外周血中分离的 CD34+细胞(Moliterno et al. (2008)Exp Hemotal. 36 :1480-86)。在> 95%的PV患者、大约50%的ET和PMF患者的血细胞中，具有JAK2基因的获得性常见体细胞突变(1849G > T，导致使细胞内激酶活化的V617F替换)(James etal. (2005)Nature434 :1144-48 ；Kralovics et al. (2005)N. Engl J Med. 352 :1779-90 ；Levine et al. (2005 ；Cancer Cell 7 :387-97 ；Zhao et al. (2005)J. Biol. Chem. 280 22788-92 ;Baxter et al. (2005)Lancet365 :1054-61 ；Moliterno et al. (2006)Blood108 :3913-15 ；Levine and Gi11iland (2008)Bloodl12 :2190-98 ;Skoda R. (2007)Hematology Am Soc Hemotol Educ Program 1-10)。在两名 MPD 患者(伴有 PV 的 MPD183和伴有PMF的MPD562)的PB⑶34+细胞中，100 %的集落形成红系祖细胞都具有杂合的JAK2-V617F 基因型(Moliterno et al. (2008)Exp Hematol. 36 :1480-86)。使用相同的定量等位基因特异性 PCR 分析(Moliterno et al. (2006)Bloodl08 :3913-15 ；Moliterno etal. (2008) Exp Hematol. 36 :1480-86)，本发明提供了，突变的(1849T 导致 V617F) JAK2 等位基因在每名患者的解冻的⑶34+细胞中的百分比为大约50% (表I)。应用在正常人类CD34+细胞中使用的相同的重编程方案，本发明提供了来源于两名患者中每一名的多个iPS克隆(表I)。所有成功扩增的iPS克隆对于JAK2-V617F均是杂合的，这与亲代CD34+细胞相同(表I)。与由成纤维细胞和正常CD34+细胞衍生的人类iPS细胞相似，扩增的JAK2-V617F iPS克隆可以展现出特征性的未分化的hES/iPS细胞形态和标记物的表达。对由MPD 183衍生的代表性iPS系(克隆8)的不同集落进行免疫染色，显示其表达了未分化的细胞标记TRA-1-60、SSEA4和NAN0G。在EB形成和畸胎瘤形成后对分化细胞进行分析，揭示其存在来源于三个胚层的各种细胞类型，表明这些患者特异性 iPS系具有多潜能性。与之前对人类ES细胞和其他(正常)iPS细胞的实验一样，本发明提供了在EB形成(第10天)之后，对来源于MPD183(iMPD183.C8)的iPS克隆8进行的多潜能性试验，其显示了 JAK2-V617F iPS细胞也可以分化为表达三个胚层标记的各种细胞类型。在EB介导的分化之前和之后，从第二名MPD患者(iMPD562. C3)的iPS克隆3中也获得了相似的结果。本发明也提供了，由MPD 183衍生的iPS细胞在畸胎瘤形成之后的体内分化潜能。切片之后，各种载玻片的苏木精-伊红染色可以显示来源于三个胚层的各种组织肠上皮(内胚层)、软骨(中胚层)和糖原生成上皮(外胚层)。通过G带显带分析显示，来源于两名MH)患者的扩增的JAK2-V617F iPS细胞系具有正常的核型。可以观察到，来源于两名女性MPD患者(MPD 183和MPD562)的扩增的iPS系分别在10和11代之后仍保持正常的核型(46，XX)。血细胞衍生的iPS细胞的定向造血分化通过改进的EB形成方法和无滋养层和无血清条件下的分化，检查正常的和PV⑶34+细胞衍生的人类iPS细胞的造血分化潜能(Yu et al. (2008)CelI Stem Cell 2 :461-71 ；Ng et al. (2005)Blood 106 :1601-03 ；Ng etal. (2008)Nat Protoc. 3 :768-76)。到第2周，很多与造血细胞相似的小细胞长出EB0正常对照(NC)和成人CD34+细胞或PV CD34+细胞衍生的人类iPS细胞可以置于微量滴定孔中，并聚集以进行EB形成和定向造血分化。大约10 14天之后，可以发现EB周围出现大量与未成熟的造血细胞相似的小圆细胞，并在接下来的几天中增长。随后收集这些细胞，并用造血集落形成实验和FACS，分析造血标记是否存在。随后收集全部细胞，并分析是否存在造血标记，以及在半固体甲基纤维素培养基中(正常对照iPS和PV-iPS)是否存在造血集落形成单位(CFU)。再培养10 14天之后，可以在培养基中观察到CFU-粒细胞/单核细胞和CFU-红系集落。使用从NC和PV样品中纯化的⑶34+⑶45+细胞，进行了一次相似的CFU测定。本发明提供了，从正常⑶34+细胞衍生的iPS细胞产生的髓系和红系集落中挑选单个集落，在离心涂片之后进行赖-吉染色。可以观察到与幼红细胞和髓样细胞的多个谱系相似的细胞。使用hES细胞可以如之前一样检测出髓系和红系集落(Zhan et al. (2004)Lancet 364 :163-71)。使用分化的iPS细胞产生的纯化⑶34+⑶45+细胞证实了这一点，所述分化的iPS细胞衍生自正常或PV⑶34+血细胞。挑选的造血集落中的单个细胞的染色证实了各种髓系和红系细胞类型的存在。表I.衍生自MPD患者的iPS细胞系的JAK2-V617F基因分型
权利要求
1.一种产生多潜能或多功能干细胞的方法，包括向培养基中的血细胞中引入含有至少一种多潜能因子的非病毒载体，从而将所述血细胞重编程为多潜能或多功能干细胞。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述载体包括多个多潜能基因。
3.根据权利要求I所述的方法，进一步包括向所述培养基中加入至少一种皮质类固醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一种皮质类固醇选自下组醛固酮、倍氯米松、倍他米松、可的松、去氧皮质酮、地塞米松、氟氢可的松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、泼尼松、以及曲安西龙。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种皮质类固醇为地塞米松。
6.根据权利要求I或3所述的方法，进一步包括向所述培养基中加入至少一种细胞因子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一种细胞因子选自下组睾丸支持细胞因子(SCF)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FLT3或FL)、促血小板生成素(TPO)、促红细胞生成素(EPO)、以及白介素3 (IL-3)。
8.根据权利要求I所述的方法，其中所述血细胞为脐带血(CB)细胞、成人骨髓(BM)CD34+细胞、成人外周血(PB)细胞、成人外周血(PB)CD34+细胞、成人外周血(PB)CD34+CD45+细胞、或成人外周血单核细胞(PBMC)。
9.根据权利要求I所述的方法，其中所述主体为哺乳动物。
10.根据权利要求I所述的方法,其中所述主体为人类。
11.根据权利要求I所述的方法，其中所述多潜能或多功能干细胞包括造血干细胞。
12.根据权利要求I所述的方法,其中所述主体有骨髓增殖性疾病(MPD)。
13.根据权利要求I所述的方法，其中所述至少一种多潜能因子包括至少三个选自下组的因子S0X2、S0X7、S0X17、0CT4、Nanog、LIN28、c_Myc、KLF4、ESRRB, EBFU C/EBPa、C/EBP P、NGN3、PDX以及MAFA，或其活性片段。
14.根据权利要求I所述的方法，其中所述至少一种因子包括0CT4、S0X2、KLF4、以及c-MYC，或其活性片段。
15.根据权利要求I所述的方法，其中所述至少一种因子包括0CT4、S0X2、KLF4、MYC、LIN28、以及SV40T抗原，或其活性片段。
16.根据权利要求I所述的方法，其中所述非病毒载体为游离型载体。
17.根据权利要求16所述的方法，进一步包括向所述血细胞中引入第二个游离型载体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二个游离型载体表达SV40T抗原(Tg)。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一个游离型载体包括多个多潜能基因，所述多潜能基因与至少一个调控序列操作性连接以表达所述因子。
20.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述游离型载体为oriP/EBNAl质粒。
21.根据权利要求8所述的方法，其中所述PBMC来自镰状细胞性贫血患者。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述PBMC包括S⑶B003细胞。
23.一种确定对主体细胞有疗效的试剂的方法，包括用待测试剂接触如权利要求I或.20所述的多潜能或多功能干细胞，并检测在待测试剂存在与待测试剂不存在时相比，功能的改变。
24.一种产生分化细胞的方法，包括对由权利要求I所述方法产生的多潜能或多功能干细胞进行诱导分化，从而获得分化细胞群。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述分化细胞包括血细胞、肌细胞、神经元细胞、结缔组织、心肌细胞、巨核细胞、内皮细胞、肝细胞、成肾细胞、成脂细胞、成骨细胞、破骨细胞、肺泡细胞、心脏细胞、肠细胞、肾细胞、视网膜细胞或上皮细胞。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述分化细胞包括胰腺P细胞、肝细胞、心肌细胞或骨骼肌细胞。
27.根据权利要求I所述方法产生的分离的多潜能或多功能干细胞的富集细胞群。
28.根据权利要求27所述的分离的多潜能或多功能干细胞，其中所述分离的多潜能或多功能干细胞表达选自下组的细胞表面标记SSEA1、SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、以及TRA-1-81。
29.一种需更换或更新细胞的疾病的治疗方法，包括给予主体有效量的根据权利要求I产生的多潜能或多功能干细胞。
30.一种重编程的非病毒游离型载体，包括至少五个多潜能基因，所述多潜能基因与至少一个调控序列操作性连接，以表达至少五种多潜能因子。
31.根据权利要求30所述的载体，其中所述载体为oriP/EBNAl质粒。
全文摘要
本发明是基于脐带血(CB)和成人骨髓(BM)CD34+细胞可以重编程为早期干细胞的开创性发现。本发明提供了对来源于主体的CB和成人骨髓(BM)CD34+细胞的重编程，且无需任何预处理。提供了重编程主体血细胞的方法。也提供了建立疾病模型方法和产生主体特异性分化细胞的方法。另外，本发明提供的方法可用于识别试剂，所述试剂能改变主体特异性的分化细胞的功能，以及改变由血细胞重编程获得的分离的多潜能或多功能干细胞的功能。
文档编号C12N5/0789GK102803476SQ201080051633
公开日2012年11月28日 申请日期2010年9月14日 优先权日2009年9月14日
发明者程临钊 申请人:程临钊