专利名称：用于干细胞成像的组合物和方法
用于干细胞成像的组合物和方法领域本发明总体上涉及细胞成像，并且更具体地是对用干细胞中的新型表达载体表达的报告核酸序列成像。背景在活体对象中对单个细胞或细胞群无侵袭性和重复性成像，是体内跟踪细胞的关键，尤其是在基于细胞的疗法领域。在很多应用中已使用不同成像模式来了解正常生理和疾病进展，所述应用包括基于细胞的疗法、细胞运输或基因疗法研究。含有报告核酸序列的表达载体在活体对象中对基因表达的无侵袭性定量成像提供可能。为了阐释分子和细胞事件的复杂性和动力学，期需在单个或多个报告基因构建体 的帮助下在单个细胞中对报告基因表达成像。成像的报告基因编码可由各种无侵袭性成像 技术检测的蛋白质。可在活体对象中视报告基因类型而定用以下技术对报告基因表达成像光学成像、正电子发射断层显像(PET)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)或磁共振成像(MRI)。基于干细胞的疗法显示相当大的潜力，尤其是在再生医学领域。基于干细胞的疗法的障碍之一是缺乏有效的监测方法来跟踪采用的干细胞。监测干细胞的分化状态对于确定治疗功效以及可能的有害作用例如植入的干细胞的致瘤性(tumorogenicity)必不可少。可通过用含有内源启动子驱动的报告基因的转基因来评估细胞培养物中或活体对象中的内源基因表达。对植入的干细胞多能性的评估可使得能够预测将来畸胎瘤的形成。与多能性标记相关的启动子驱动的报告基因系统可帮助检测干细胞的分化状态。为了克服每一种模式的缺点，检测多种不同报告基因表达的多模式方法可能是有用的。此外，在活动物中用无侵袭性报告基因成像技术监测干细胞活性的可靠方法是高度期需的目标。简述本发明总体上包括包含一个或多个报告序列的表达载体。本发明进一步包括用于通过报告核酸表达成像来监测细胞活性的方法和试剂盒。用于监测干细胞的表达载体的实例包含与第一表达调控序列可操作地连接的(operably linked)第一报告核酸序列，和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。所述第一表达调控序列包含启动子。所述第二表达调控序列包含对细胞分化或去分化的一个或多个阶段应答而激活或失活的应答元件。表达载体的实例包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。所述第一表达调控序列包含用于一种或多种多能性标记的启动子。所述第二表达调控序列包含对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答的应答元件。用于监测干细胞的方法实例包括将包含第一报告核酸序列和第二报告核酸序列的第一表达载体递送给所述干细胞；和通过对第一或第二报告核酸序列中至少之一的表达成像来监测干细胞。所述第一报告核酸序列与包含用于一种或多种多能性标记的启动子的第一表达调控序列可操作地连接。所述第二报告核酸序列与第二表达调控序列可操作地连接，所述第二表达调控序列包含应答元件或由一种或多种细胞特异性蛋白调节的细胞特异性启动子，所述应答元件对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答。用于监测干细胞的试剂盒的实例包含表达载体，其中所述表达载体包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。所述第一表达调控序列包含0ct4启动子，和所述第二表达调控序列包含对GATA4蛋白的结合应答的应答元件。表达载体的实例包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，所述第一表达调控序列包含用于一种或多种多能性标记的启动子；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，所述第二表达调控序列包含受一种或多种细胞特异性蛋白调节的细胞特异性启动子。附图
当参考附图阅读以下详述时将更好地理解本发明这些和其它特征、方面和优势，在整个附图中相同的符号代表相同的部分，其中图I为本发明具有组成型泛素启动子和细胞特异性0ct4启动子的构建体的实施方案的示意图。图2A-D为显示胚胎干细胞中或分化的成体细胞系中0ct4表达的特异性的图表。图3为在用0ct4-hRLuc瞬时转染的小鼠ES细胞中海肾(renilla)萤光素酶表达的图表。图4A-B为稳定表达0ct4_hRLuc和Ubiq-FLuc-eGFP的小鼠ES细胞的萤光素酶表达的图表。图5为随时间0ct4mRNA水平和P -肌动蛋白mRNA水平的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶相片。图6A是图表，图6B为一系列小鼠的图像，显示活小鼠中包含0ct4_hRLuC表达载体的ES细胞的萤光素酶表达。图6C是图表，图6D为一系列小鼠的图像，显示活小鼠中包含Ubiq-Fluc表达载体的ES细胞的萤光素酶表达。图7为用于通过将应答元件和最小启动子序列插入多克隆位点来制备表达载体的本发明方法实例的示意图，所述应答元件对GATA4蛋白的结合应答。图7按出现次序分别公开SEQ ID NO. 5和6。图8为本发明表达载体实施方案的示意图，其在pcDNA载体骨架中包含cDNA-编码的GATA4蛋白。图9为编码GATA4蛋白的cDNA序列的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶相片。
图10为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件在体外对GATA4蛋白的结合应答。图11为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件对ffiK 293细胞中的GATA4结合应答。图12为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件对HCT 116结肠癌细胞中的GATA4结合应答。图13为与应答元件可操作地连接的报告核酸序列的萤光素酶表达的柱状图，所述应答元件对用5-氮杂胞苷(5-azacytidine)处理HCTl 16结肠癌细胞后的GATA4结合应答。图14为本发明构建体实施方案的示意图，所述构建体包含组成型启动子(泛素)、细胞特异性启动子(0ct4)和应答元件(对GATA4应答)。详述为了更清晰简明地阐述和指出本发明要求保护的主题，对在以下说明及所附权利要求书中使用的特定术语提供以下定义。在整个说明书中，应该将特定术语例证理解为非限制性实例。本文所用术语"表达载体"或"表达构建体"，指可用于将特定基因或特定核酸序列或表达序列标签引入靶细胞的质粒。一旦表达载体在细胞内，就可通过细胞转录和翻 译装置来产生由核酸序列编码的蛋白质。表达载体可包含调节核酸序列或表达调控序列、转录起始序列、目的核酸序列(例如报告核酸序列)、转录终止序列或其组合。表达调控序列可包含充当用于有效转录编码目的蛋白的核酸序列或表达序列标签的增强子和/或启动子的序列。本文所用术语"报告核酸序列"或"报告基因"，指编码具有报告活性的蛋白或肽的核酸序列。报告核酸序列可编码可被独立检测的蛋白或肽。常用报告核酸序列编码固有地具有肉眼可识别特性的蛋白或肽(例如荧光蛋白，例如GFP)，或可产生肉眼可识别特性的蛋白或肽(例如生物发光蛋白，例如萤光素酶)。由于将报告核酸序列表达作为标记使用，因此报告核酸序列可用这样的方式来选择，以使得其在研究中的细胞或生物体中非天然表达。报告核酸序列的非限制性实例包括编码绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、萤光素酶、P -内酰胺酶和P -半乳糖苷酶的核酸序列。本文所用术语"可操作地连接的"，意即当两个核酸分子序列彼此连接时，其连接方式为允许两种序列均转录到同一 RNA转录物上，或允许在一个序列中开始的RNA转录物延伸到第二序列中。因此，若在启动子序列开始转录将产生可操作地连接的第二序列的RNA转录物，那么两个序列例如启动子序列(第一序列)和任何其它第二DNA序列为可操作地连接的。例如，编码报告蛋白的报告核酸序列和表达调控序列可以可操作地连接，以这样的方式连接以便允许通过激活表达调控序列中存在的启动子或增强子来使报告核酸序列表达。成为"可操作地连接的"，两个序列不必彼此紧密相邻。本文所用术语"表达调控序列"，指位于报告核酸序列上游的核酸序列。这些表达调控序列尤其限定RNA聚合酶特异性结合启动子序列以起始转录的位点。表达调控序列可包含启动子、增强子、基因应答元件或核酸应答元件或转录起始序列。表达调控序列可经工程改造以改进下游报告核酸序列的转录和/或翻译效率。本文所用术语"应答元件"，指当位于接近启动子或在启动子内时能够调控转录活性的核酸序列。例如，可将GATA4蛋白-结合序列用作位于接近最小启动子的应答元件。GATA4蛋白的结合可调控最小启动子的启动子活性。应答元件的非限制性实例包括激素应答元件、cAMP应答元件和GATA4蛋白-结合核酸序列。本文所用术语"组成型启动子"，指允许连续转录其同族基因的非调节启动子。组成型启动子在其整个发育期间持续指导活体对象各部分的基因表达。组成型启动子的非限制性实例包括泛素启动子、CT2启动子(编码ATP硫化酶)和与CaMV 35S转录物或农杆菌属(Agrobacterium)Ti质粒胭脂氨酸合成酶基因相关的启动子。本文所用术语"监测"，指在体外或体内观察或记录活性。例如，其可为常规收集关于细胞、组织或器官中的生物过程进展或发展的信息的过程。例如可通过对细胞中产生的或弓I入到细胞中的可成像蛋白或肽成像，来实现在细胞、组织或器官中监测特定活性。例如，可成像蛋白或肽可为生物发光或荧光。可实施监测，例如以确定细胞或组织的存在与否、浓度、定位或分化状态。可监测可成像蛋白或肽的技术的非限制性实例包括光学成像(荧光和生物发光)、PET、MRI或SPECT。本文所用术语"分化"指较少特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。在多细胞生物体发育期间随着生物体从单受精卵到组织和细胞类型的复杂系统的变化，发生无数次分化。在组织修复期间和正常细胞更新(cell turnover)期间，成体干细胞分裂并形成完全分化的子细胞。分化显著改变细胞大小、形状、膜电位、代谢活性和对信号的应答。这些变化主要是由于基因表达的高度受控的修饰。例如，能够分化为很多细胞类型的细胞被称为多能细胞。
本文所用术语"去分化"，指其中部分分化或终末分化的细胞通常作为再生过程的部分回复到较早发育阶段的细胞过程。非限制性实例包括诱导的多能干细胞(iPS)。去分化的细胞能够再分化为特化的细胞类型。例如，特化的细胞类型例如脂肪细胞可去分化为多能干细胞。本文所用术语"多能性标记"指多能性细胞特异性标记蛋白。本文所用"多能细胞"指可分化全部三个胚层(例如内胚层、中胚层和外胚层)的细胞群。多能细胞表达多种多能性细胞-特异性标记。标记具有某些未分化细胞的典型细胞形态，例如致密集落、胞核与胞质比率高或突出的核仁。仅当细胞处于未分化的多能状态或处于去分化的多能状态时才激活多能性标记。多能性标记的非限制性实例包括0ct4、Sox2、Klf和Nanog。本发明表达载体的一个或多个实施方案包含与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列。第一表达调控序列可包含启动子。在一个实施方案中，第一表达调控序列可包含用于一个或多个多能性标记的启动子，例如0ct4启动子。第二表达调控序列可包含对一种或多种应答元件特异性蛋白例如GATA4蛋白的结合应答的应答元件。表达载体可进一步包含与第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列。第三表达调控序列可包含组成型启动子。在一个实施方案中，组成型启动子为泛素启动子。在表达载体中，第一、第二或第三报告核酸序列可分别与第一、第二或第三表达调控序列符合读框的可操作地连接。在某些实施方案中，表达调控序列可包含当细胞分化或去分化时被激活或失活的任何启动子，或对任何蛋白的结合应答的任何应答元件。所述调控序列可包括但不限于0ct4启动子或对GATA-4蛋白结合应答的应答元件。在表达载体中，所述第一、第二或第三表达调控序列调控所述第一、第二或第三报告核酸序列的转录，或修饰所述报告核酸编码的蛋白的翻译。为有效转录报告蛋白，可工程改造表达调控序列和报告核酸序列之间的距离。表达载体可进一步包含一种或多种序列，其在体内或体外或活系统中可用于标记(例如荧光蛋白标签)报告蛋白。表达载体可用于组成型(始终如一表达)或细胞特异性(仅在某些细胞谱系类型中表达)表达报告核酸序列。例如，泛素启动子在任何活细胞中都具有组成型表达。包含与报告核酸序列可操作地连接的泛素启动子的表达载体，可用于持续表达报告核酸序列。可将与组成型启动子(例如泛素)可操作地连接的报告核酸序列用于对细胞存活和增殖成像。可通过采用对特定细胞类型应答的启动子来获得细胞特异性表达。细胞特异性启动子可为特异性针对多能细胞的启动子，其被称为多能性标记特异性启动子。例如，当表达载体存在于干细胞中时，在本发明表达载体中使用的0ct4启动子被激活。第二表达调控序列还可包含最小启动子。最小启动子是对于转录因子结合及随后的与所述启动子可操作地连接的基因转录所需的最小基础核酸序列。最小启动子可与应答元件可操作地连接。最小启动子可被应答元件激活。应答元件在特定细胞谱系中对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答。例如，应答元件可对GATA4蛋白的结合应答。可通过GATA4蛋白与应答元件的结合来诱导最小启动子。在心肌细胞中GATA4蛋白的表达增力口。因此，仅当细胞经历分化到心脏特异性细胞谱系例如心肌细胞时，才诱导与GATA4的应答元件可操作地连接的最小启动子。在一个实施方案中，最小启动子可选自CMV启动子、腺病毒早期启动子、腺病毒晚期启动子或TATA框启动子。在特定实施方案中，最小启动子为CMV启动子。在一个实施方案中，第一表达调控序列包含0ct4细胞特异性启动子，第二表达调 控序列包含与应答元件(其对GATA4蛋白的结合应答)可操作地连接的最小启动子(例如CMV最小启动子)。表达调控序列可在生物体生长期间调控核酸序列表达。某些可调控表达调控序列可在宿主细胞生长期间关闭，然后可在有利表达大量所需蛋白的所需时间点再次打开。第一报告核酸序列与多能性标记的启动子可操作地连接，所述多能性标记在当细胞为多能干细胞或为受诱导的多能干细胞时表达。例如，当细胞处于多能阶段时0ct4启动子活性增加，而当细胞分化为特定细胞谱系时0ct4启动子活性降低。因此，在细胞分化状态，报告基因表达下调。因此，当细胞处于多能状态时，与可操作地连接0ct4启动子的报告核酸序列成像相关的信号为"开"，当细胞已分化时所述信号为"关”。第二报告核酸序列与应答元件可操作地连接，而所述应答元件与最小启动子可操作地连接。可通过应答元件特异性蛋白例如GATA4蛋白与应答元件的结合来激活最小启动子。在某些实施方案中，应答元件包含GATA4结合序列的至少四个重复。当干细胞分化为心脏特异性细胞例如心肌细胞时，GATA4蛋白的表达增加。因此，当细胞处于分化状态(分化为心脏特异性细胞)时，与连接GATA4的报告核酸序列相关的信号为"开"，当细胞为多能或处于去分化的状态时，所述信号为“关”。例如，当干细胞分化为心脏特异性细胞谱系时，GATA4蛋白的表达增加。然而，当心脏特异性细胞去分化为受诱导的多能干(iPS)细胞时，GATA4蛋白的表达降低。在某些实施方案中，可通过细胞特异性蛋白与应答元件的结合，来激活与最小启动子可操作地连接的第二报告核酸序列。举一个例子，当干细胞分化为内皮细胞时，胎儿肝激酶-I (FLK-I)可被激活，其可与第二表达调控序列中存在的应答元件结合，并激活与应答元件相关的最小启动子。细胞特异性标记的非限制性实例列于表I中。在某些实施方案中，第二表达调控序列可包含分化的细胞-特异性启动子。分化的细胞特异性启动子包括但不限于FLK-1、BM88或HLA_Dra。在某些实施方案中，细胞特异性标记(表I中列举的非限制性实例)可为与应答元件结合的应答元件特异性蛋白，或为与分化细胞中的启动子结合的细胞特异性蛋白。表I:细胞特异性标记
权利要求
1.用于监测干细胞的表达载体，所述表达载体包含 与包含启动子的第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和 与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，其中所述第二表达调控序列包含对细胞分化或去分化的一个或多个阶段应答而激活或失活的应答元件。
2.表达载体，所述表达载体包含 与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，所述第一表达调控序列包含一种或多种多能性标记的启动子；和 与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，所述第二表达调控序列包含对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答的应答元件。
3.权利要求2的表达载体,其中所述启动子选自0ct4、FoxD3、Sox2或Nanog。
4.权利要求2的表达载体，其中所述启动子为0ct4。
5.权利要求2的表达载体，其中所述应答元件特异性蛋白为GATA4。
6.权利要求2的表达载体，其中所述细胞特异性蛋白选自FLK-1、BM88或HLA-Dra。
7.权利要求2的表达载体，其中所述第二表达调控序列还包含与所述应答元件可操作地连接的最小启动子。
8.权利要求7的表达载体，其中所述最小启动子选自CMV启动子、腺病毒早期启动子、腺病毒晚期启动子和TATA框启动子。
9.权利要求6的表达载体，其中所述应答元件包含GATA-4蛋白-结合序列的至少四个重复。
10.权利要求2的表达载体，其还包含与第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列。
11.权利要求10的表达载体，其中所述第三表达调控序列包含组成型启动子。
12.权利要求11的表达载体，其中所述组成型启动子为泛素启动子、鸡￠-肌动蛋白启动子(CAG)、人ROSA启动子。
13.权利要求10的表达载体,其中所述第一、第二或第三报告核酸序列中至少一种编码多肽，所述多肽可通过光学成像、磁共振成像、正电子发射断层显像、单光子发射计算机断层显像或其组合来成像。
14.权利要求2的表达载体，其中所述第一或第二报告核酸序列中至少一种编码可由正电子发射断层显像成像的多肽。
15.权利要求2的表达载体，其中至少所述第一或第二报告核酸序列中至少一种编码与底物反应时产生生物发光的多肽。
16.权利要求2的表达载体，其中所述第一和第二报告核酸序列二者都编码与底物反应时产生生物发光的多肽。
17.权利要求15或16的表达载体，其中所述编码与底物反应时产生生物发光的多肽的第一或第二报告核酸序列中至少一种选自萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶或gaussi萤光素酶。
18.权利要求2的表达载体,其中所述第一或第二或二种报告核酸序列都编码本身产生荧光的多肽。
19.权利要求2的表达载体，其中所述第一报告核酸序列编码海肾萤光素酶，所述第二报告核酸序列编码萤火虫萤光素酶。
20.包含权利要求2的表达载体的培养细胞。
21.包含权利要求I的表达载体的权利要求20的培养细胞的子代。
22.用于监测干细胞的方法，所述方法包括 将包含第一报告核酸序列和第二报告核酸序列的第一表达载体递送给所述干细胞；和 通过对所述第一或第二报告核酸序列表达的至少一种成像来监测所述干细胞， 其中所述第一报告核酸序列与第一表达调控序列可操作地连接，所述第一表达调控序列包含一种或多种多能性标记的启动子，并且所述第二报告核酸序列与第二表达调控序列可操作地连接，所述第二表达调控序列包含对一种或多种应答元件特异性蛋白的结合应答的应答元件。
23.权利要求22的方法，其中所述启动子选自Oct4、FoxD3、Sox2或Nanog。
24.权利要求22的方法，其中所述启动子为0ct4。
25.权利要求22的方法，其中所述应答元件特异性蛋白为GATA4。
26.权利要求22的方法，其中所述应答元件特异性蛋白选自FLK-1、BM88或HLA-Dra。
27.权利要求22的方法，其中所述第二表达调控序列还包含与所述应答元件可操作地连接的最小启动子。
28.权利要求27的方法，其中所述最小启动子选自CMV启动子、腺病毒早期启动子、腺病毒晚期启动子和TATA框启动子。
29.权利要求22的方法，其中所述表达载体还包含与第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列。
30.权利要求29的方法，其中所述第三表达调控序列包含组成型启动子。
31.权利要求29的方法，其中所述第一、第二或第三报告核酸序列中至少一种编码多肽，所述多肽可通过光学成像、磁共振成像、正电子发射断层显像、单光子发射计算机断层显像或其组合来成像。
32.权利要求22的方法，其中所述第一和第二报告核酸序列中任一种或两种都编码与底物反应时产生生物发光的多肽。
33.权利要求32的方法，其中所述与底物反应时产生生物发光的多肽选自萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶或gaussi萤光素酶。
34.权利要求29的方法，其中所述干细胞选自单能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、全能干细胞、诱导的多能干细胞或其组合。
35.权利要求29的方法，其中将所述表达载体经由转染、转导、核转染、电穿孔或其组合递送给所述干细胞。
36.权利要求29的方法，其中所述干细胞的监测在活体对象中进行。
37.权利要求29的方法，其中所述监测包括确认所述干细胞的存在情况、不存在情况、浓度、定位或分化状态。
38.权利要求37的方法，其中所述分化状态表明任何类型的成体细胞变为干细胞的去分化状态。
39.权利要求22的方法，所述方法还包括 将第二表达载体递送给所述干细胞，然后进行所述监测步骤，其中所述第二表达载体包含与包含组成型启动子的第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列。
40.用于监测干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括 表达载体，其中所述表达载体包含 与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列；和 与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列， 其中所述第一表达调控序列包含0ct4启动子，并且所述第二表达调控序列包含对GATA4蛋白的结合应答的应答元件。
41.权利要求40的试剂盒，所述试剂盒还包括另外的表达载体，其中所述另外的表达载体包含与包含组成型启动子的第三表达调控序列可操作地连接的第三报告核酸序列。
42.表达载体，所述表达载体包含 与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，所述第一表达调控序列包含一种或多种多能性标记的启动子；和 与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，所述第二表达调控序列包含由一种或多种细胞特异性蛋白调节的细胞特异性启动子。
全文摘要
本文提供包含以下的表达载体与第一表达调控序列可操作地连接的第一报告核酸序列，所述第一表达调控序列包含启动子；和与第二表达调控序列可操作地连接的第二报告核酸序列，所述第二表达调控序列包含应答元件，所述应答元件随着一种或多种细胞分化或去分化而被激活或失活。亦提供用于包含表达载体的干细胞成像并监测所述干细胞的方法及试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102803508SQ201080051618
公开日2012年11月28日 申请日期2010年9月6日 优先权日2009年9月9日
发明者S·鲍米克, S·S·贾姆比尔, R·保罗慕鲁甘, S·亚霍比, B-C·安, N·帕拉舒拉马 申请人:通用电气公司