肿瘤干细胞分子标记的制作方法

专利名称：肿瘤干细胞分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子标记，其为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞的分子标记，其在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。
背景技术：
肿瘤干细胞被认为是癌症复发、转移的主要原因，癌症治疗中以肿瘤干细胞为靶标的重要性已被指出。但是肿瘤组织中肿瘤干细胞比率较低(非专利文献4)，特异性识别肿瘤干细胞并进行治疗是极其困难的。肿瘤干细胞的检测技术以及以肿瘤干细胞为靶标的新疗法的开发已成为癌症医疗中的重要课题。目前，作为已知的肿瘤干细胞标记，有⑶133、⑶M、⑶44等分子标记(非专利文献 1 7)，据说仅在极少数癌细胞中具有有效性，为了在更多种类的癌症中检测肿瘤干细胞， 需要鉴定新的分子标记。现有技术文献非专利文献1 :Shu Zhang et al.，Cancer Res. 68 (11) 4311-4320，2008非专利文献2 :Shih-Hwa Chiou et al. , Clin. Cancer Res. 14(13)4085-4095， 2008非专利文献3 =Gang-Ming Zou, J. Cell. Physiol. 217 :598-604, 2008非专利文献4 =Cheong J.Lee et al.，J Clin Oncol 26 :2806-2812,2008非专利文献5 =Madhuri Kakarala et al.，J Clin Oncol 26 :2813-2820,2008非专利文献6 Craig D. Peacock et al.，J Clin Oncol 26 :2883-2889,2008非专利文献7 =Xing Fan et al.，J Clin Oncol 26 :2821-2827,2008

发明内容
发明要解决的问题本发明的目的在于，提供在肿瘤干细胞的检测中有用的分子标记。解决问题的手段为解决上述课题，本发明人等在持续进行深入研究时着眼于如下新的见解，所述新见解为对于肿瘤干细胞标记基因而言必不可少的是，在至少1种组织中有用性更高且优选在多个组织中的来源于该组织的正常细胞中看不到表达、在肿瘤干细胞中能看到表达，即在鉴定肿瘤干细胞基因时的待测物中通常含有正常组织的情况下在该待测物中的正常组织中几乎不表达。并且判明迄今为止所报告的针对肿瘤干细胞的标记基因在正常组织中几乎都高水平表达，而本发明人等在进一步研究中发现，已知的转录因子基因-性别决定Y区域转录因子2(kx determinig Region Y_box2，Sox2)基因虽然在成人正常细胞中看不到表达，但意外的是其在肿瘤干细胞中表达。并且，进一步研究时发现，以精子线粒体相关富含半胱酸蛋白(Sperm Mitochondria-associated Cysteine-rich Protein, Smcp)基因为首的其它基因也是在成人正常细胞中几乎不表达而在肿瘤干细胞中表达，从而完成了本发明。即，本发明涉及分子标记，其为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞的分子标记，其在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。此外，本发明涉及前述分子标记，检测对象为来源于选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、 骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞所组成的组中的1种或2种以上细胞或组织的细胞团。进而，本发明涉及前述分子标记，其在本发明全部检测对象的非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。进而，本发明还涉及前述分子标记，该分子标记为选自0r7Cl、Dnajb8、SOX2、SmCp、 Intsl、Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、 Hes6、Znf415、Nkx2-5、Pamci、Pnmt和kgb3al所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物。此外，本发明涉及以前述分子标记为指标来判定判定对象中是否存在肿瘤干细胞的方法。进而，本发明涉及前述方法，细胞团含有正常细胞和/或非肿瘤干细胞的癌细胞。进而，本发明涉及前述方法，细胞团来源于选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、 肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞所组成的组中的1种或2种以上细胞或组织。此外，本发明涉及前述方法，判定是指在检测到选自0r7Cl、Dnajb8、SOX2、SmCp、 Intsl、Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、 Hes6、Znf415、Nkx2-5、Pamci、Pnmt和kgb3al所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物的情况下，判定为存在肿瘤干细胞。此外，本发明涉及前述方法，基因的表达产物为mRNA和/或内源性多肽。此外，本发明涉及前述方法，基因的表达产物为mRNA，该方法包括利用RT-PCR法检测的步骤。此外，本发明涉及前述方法，基因的表达产物为内源性多肽，该方法包括利用与该内源性多肽特异性反应的试剂检测的步骤。此外，本发明涉及前述方法，试剂为抗体。此外，本发明涉及前述方法，判定在体外或体内进行。此外，本发明涉及癌症治疗药的筛选方法，其包括下述步骤i)测定前述分子标记的、对细胞团投与候补化合物前的检测量A的步骤，ii)对细胞团投与候补化合物的步骤，iii)测定i)中所测定的分子标记的、对细胞团投与候补化合物后的检测量B的步骤，和iv)比较A和B，在A显著大于B的情况下，将候补化合物判定为候补癌症治疗药的步骤。进而，本发明涉及用于判定肿瘤干细胞是否存在的试剂盒，其含有用于检测前述分子标记的试剂。此外，本发明涉及前述试剂盒，用于检测的试剂为用于检测mRNA的、具有与下述基因互补的碱基序列的探针和/或引物，所述mRNA为选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp, Intsl、Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、 Hes6、Znf415、Nkx2-5、Pamci、Pnmt和kgb3al所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物。此外，本发明涉及用于判定肿瘤干细胞是否存在的试剂盒，用于检测的试剂为用于检测多肽的抗体，所述多肽为选自0r7cU Dnajb8、Sox2、Smcp, IntsU Koxl2、MdfU FLJ13464、667J232、Surf6, Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、 Nkx2-5、Pamci、Pnmt和kgb3al所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物。本发明还涉及癌症的判定方法，其使用前述试剂盒。本发明还涉及多肽，所述多肽为能够用作用于抑制肿瘤干细胞的功能或杀灭肿瘤干细胞的抗原的多肽，所述多肽为由0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp, IntsU Koxl2、MdfU FLJ13464、667J232、Surf6, Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、 Nkx2-5、Pamci, Pnmt和kgb3al所编码的多肽或其一部分，或者在该多肽或其一部分中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸而形成的多肽。本发明还涉及抗体，该抗体与源于选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、Intsl、Koxl2、 Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、 Nkx2-5、Pamci、Pnmt和kgb3al所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物的表位特
异性反应。此外，本发明涉及药物组合物，其含有至少一种以上的前述多肽和/或前述抗体。本发明还涉及前述药物组合物，药物组合物为癌症治疗用或癌症预防用组合物。本发明还涉及将前述多肽作为抗原抑制肿瘤干细胞的功能、或杀灭肿瘤干细胞的方法。此外，本发明涉及前述方法，所述方法使用前述抗体。本发明还涉及编码前述多肽的核酸。本发明还涉及含有前述核酸的药物组合物。此外，本发明涉及前述药物组合物，所述药物组合物为DNA或RNA疫苗用药物组合物。本发明还涉及通过主要组织适合抗原进行抗原呈递的肽的筛选方法，所述方法包括下述步骤i)制备将目标多肽切断而成的具有适当长度的肽片段的步骤，ii)将i)中获得的肽片段、抗原呈递细胞、和用目标多肽和/或i)中获得的肽片段致敏的T细胞一起培养的步骤，iii)测定ii)中获得的T细胞的活化程度的步骤，iv)筛选iii)中使T细胞活化的肽片段的步骤，其中，目标多肽为前述多肽。本发明还涉及核酸，该核酸用于抑制肿瘤干细胞中选自0r7cl、DnajbS, Sox2、 Smcp, IntsU Koxl2、MdfU FLJ13464、667J232、Surf6, Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Ras 11 lb, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt 和 Scgb3al 所组成的组中的基因的表达。此外，本发明涉及前述核酸，该核酸为DNA和/或RNA。此外，本发明涉及药物组合物，其含有至少1种以上前述核酸。此外，本发明涉及药物组合物，该药物组合物为癌症治疗用组合物。此外，本发明涉及使用前述核酸抑制肿瘤干细胞的功能的方法。发明效果本发明提供的分子标记能够判别癌细胞所含的肿瘤干细胞、和非肿瘤干细胞的癌细胞。并且前述判别能够通过检测单一分子标记来进行，因此能够极其简便地判别肿瘤干细胞。此外，本发明的分子标记能够在肺癌细胞、乳腺癌细胞、大肠癌细胞等、多种肿瘤干细胞中通用，作为具有通用性的肿瘤干细胞的分子标记是极其有效的。进而，本发明的分子标记在正常细胞中完全检测不到或者几乎检测不到，因此在肿瘤干细胞的判别、以及含有肿瘤干细胞的肿瘤组织的判别中也是有用的。此外，本发明的分子标记与成瘤性的相关性高，在以它们为靶标的肿瘤干细胞的免疫疗法、分子靶标治疗法、基因导入治疗法以及能够用于癌症治疗的药剂、肽等的筛选中也是有用的。


图1是表示肺癌细胞系中SP解析结果的图。用线包围的部分为各自的SP级分，% 表示SP级分细胞相对于全部细胞的比例。图2是表示在N0D/SCID小鼠中肿瘤形成能力实验的结果的图。a)为移植后第8 周的小鼠的照片。b)为移植了 LHK2(肺癌细胞)的全部小鼠的肿瘤直径平均值士标准偏差、肿瘤存活的小鼠数/移植的全部小鼠数的表。c)为将分别移植了 1500个LHK2(肺癌细胞)、MCF7 (乳腺癌细胞)、SW480 (大肠癌细胞)的组每周肿瘤大小的平均值图表化的图。图3:图3的a)为表示人成人正常细胞中Sox2的表达的图，b)为表示癌细胞细胞系的SP级分和MP级分中Sox2的表达的图。图4 图4的a)为表示人成人正常细胞中Smcp和FLJ13464的表达的图，b)为表示癌细胞细胞系的SP级分和MP级分中Smcp和FLJ13464的表达的图。图5为表示调查的基因在各细胞中的表达的一览表的图。图中，看不到表达者表示为阴性，能看到表达者表示为阳性、能看到极微量表达但尚不能称之为显著表达的微量表达表示为假阳性。另外，假阳性判定为“检测不到”。此外，图中LHK2为肺癌、MFH03为软组织肉瘤、MCF7为乳腺癌、LHK2-S0X2为过度表达S0X2基因的LHK2细胞系、SW480和KMl2 为大肠癌细胞系。图6是表示其它癌细胞系中Sox2的表达的图。图7是表示其它癌细胞系中Smcp的表达的图。表示的是将PCR循环分别设定为 35个循环和40个循环进行调查的结果。图中Caki-I、ACHN、SMKTR-I 4为肾细胞癌的细胞系，Sq-I为肺癌扁平上皮癌的细胞系，1_87、A549、LHK2为肺癌腺癌的细胞系，LC817为肺癌小细胞癌症的细胞系，86-2、Lu99为肺癌大细胞癌症的细胞系，HPC3为胰脏癌症的细胞系，LCC(Mouse)为小鼠肺癌细胞。
图8 图8a)为表示正常细胞和癌细胞系SW480、KM12、LHK2、MCF7的SP级分和MP 级分中^tsl的表达的图；b)为表示癌细胞系中^itsl的表达的图。图中癌细胞系与图6 和图7中相同。图9是表示肺癌组织中免疫组织染色的结果的图。情形1和情形2分别为来自不同癌症患者的肺扁平上皮癌组织的染色像。蓝色部分表示通过苏木精染色而被染色的核， 茶色部分为通过抗S0X2抗体染色后的S0X2抗原蛋白。图10是表示乳腺癌组织中免疫组织染色的结果的图。情形1为细胞质图案，情形 2为核图案的染色像，CK5为用抗CK5抗体染色的染色像，S0X2为用抗S0X2抗体染色的染色像。蓝色部分表示通过苏木精染色而被染色的核，茶色部分为通过抗CK5抗体或抗S0X2 抗体染色后的抗原蛋白。图11中a)是表示脑、b)是表示肺、c)是表示胰脏、d)是表示胃中免疫组织染色的结果的图。蓝色部分表示通过苏木精染色而被染色的核，茶色部分为通过抗S0X2抗体染色后的S0X2抗原蛋白。黑箭头所示的部分表示被S0X2抗体稍微染色的细胞。图12是观察S0X2的强制表达所致的成瘤能力变化的图表。左边的照片为肿瘤移植9周后小鼠的照片。右边的图表是将移植了 10000个细胞的组的经过9周后的肿瘤大小的平均值图表化的结果。图表中，黑正方形表示强制表达S0X2的LHK2细胞，黑菱形表示作为转染试剂对照的LHK2细胞。图13是表示S0X2阳性乳腺癌患者和S0X2阴性乳腺癌患者的患者生存率的图表。图14 图14a)是通过RT-PCR法研究导入了 sh_S0X2基因的细胞、导入了 sh_EGFP 的细胞中S0X2基因的表达水平的结果；b)是表示将各细胞在含顺钼培养基中培养M小时时的细胞生存率用相对于顺钼浓度作图来表示的图表。图15是表示来源于S0X2多肽的肽的HLA-AM结合分析结果的图。将显示与用作阳性对照的肽同等程度或与其接近的MFI的肽鉴定为HLA-AM结合性肽。图16是表示S0X2_109肽的细胞毒性分析结果的图。检测到与作为阴性对照的来源于HIV的肽相比显著大的细胞毒性。图17是表示S0X2_109肽的酶联免疫斑点检测结果的图。在作为阴性对照的来源于HIV的肽中没有检测到IFN γ的放出，但在S0X2_109肽中确认到IFN γ的放出。图18 图18的a)是SMCP基因导入中使用的质粒的模式图、移植的小鼠的模式图，
b)是移植导入有SMCP表达基因的LHK2细胞和转染试剂对照LHK2细胞5周后的小鼠照片。
c)是向小鼠中移植1000个导入有SMCP基因的LHK2细胞和10000个转染试剂对照LHK2细胞后各周中测得的肿瘤大小的图表。图表中，黑菱形表示强制表达SMCP基因的LHK2细胞， 黑正方形表示转染试剂对照LHK2细胞。图19 图19的a)是通过RT-PCR法调查下述细胞中SMCP基因的表达水平的结果， 所述细胞为2种导入针对SMCP的siRNA的细胞，和作为阴性对照的导入了 “invitrogen 公司 Stealth RNAi (注册商标)siRNA Negative Control Hi GC 目录 No. 12935-400”的细胞。b)表示在相同条件下培养各细胞时细胞数变化的图表。图表中，黑正方形表示阴性对照的LHK2细胞，黑三角形表示导入了 SMCPl的LHK2细胞，黑圆形表示导入了 SMCP3的LHK2 细胞。图20是将200000个下述细胞移植至N0D/SCID小鼠后各周中测得的肿瘤大小的图表，所述细胞为2种导入针对SMCP的siRNA的细胞，和作为阴性对照的导入了 “invitrogen 公司 Stealth RNAi (注册商标)siRNA Negative Control Hi GC 目录 No. 12935-400”的细胞。图表中，黑正方形表示阴性对照的LHK2细胞，黑三角形表示导入 SMCPl的LHK2细胞，黑圆形表示导入SMCP3的LHK2细胞。图21是在的各组织细胞和培养癌细胞中的DNAJB8的RT-PCR结果。使用G3PDH 作为阳性对照。图22是ACHN、MCF7和RenCa细胞的流式细胞仪解析结果、和对各癌细胞的SP和 MP的DNAJB8进行RT-PCR的结果。图23是表示将RenCa的SP级分、MP级分和未分级的RenCa移植到大鼠中时时间和肿瘤体积的关系的图表。图M 图M的a)是质粒构建物的图谱。正方形部分插入了 Mock、存活素和DNAJB8 的序列。b)是导入a)质粒的细胞的培养上清的蛋白质印迹杂交结果。图25是表示投与各质粒疫苗的小鼠中移植肿瘤的体积和时间的关系的图表。圆形表示投与PBS来代替疫苗的小鼠(阴性对照)的结果，正方形表示投与未插入任何基因的质粒的小鼠的结果，三角形表示投与插入了存活素的质粒的小鼠的结果，竖线表示投与插入了 DNAJB8的质粒的小鼠的结果。图沈图沈的a)是表示曝露于各肽时HLA-AM抗体的荧光变化的图表，b)是表示平均荧光强度的图表。图27是表示转染试剂对照ACHN细胞、和强制表达DNAJB8的ACHN细胞中SP级分变化的图。图观是人的各成熟组织细胞、胎儿组织细胞和培养癌细胞中or7cl的RT-PCR结果。使用G3PDH作为阳性对照。图四是用相位差显微镜观察染试剂对照Sw480细胞、稳定表达or7cl的Sw480细胞和用siRNA敲除or7cl的Sw480细胞形态的图像和表示前述各细胞的or7cl的RT-PCR 结果的图。使用G3PDH作为RT-PCR的阳性对照。图30是表示对野生型Sw480细胞和用siRNA敲除or7cl的Sw480细胞的SP级分进行流式细胞仪解析的结果图。图31是表示将转染试剂对照Sw480细胞和稳定表达or7cl的Sw480细胞移植到小鼠中时肿瘤体积随时间变化的图表、以及表示将用siRNA敲除or7cl的细胞和使用阴性 siRNA的细胞移植到小鼠中时肿瘤体积随时间变化的图表。图32是表示曝露于各肽时HLA-AM抗体的荧光变化的图表。图33是表示使用实验例32中已确认结合的肽进行的酶联免疫斑点检测的结果的图。图34是表示51Cr释放实验中的E/T比和杀伤率的关系的图表。
具体实施例方式以下详细说明本发明。本发明的分子标记为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞的分子标记，其在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。因此典型的是，用于从癌细胞团检测肿瘤干细胞。进而，例如，有时采集任意的作为检测对象的细胞团时混入有正常细胞而变成肿瘤干细胞、非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞混杂存在的细胞团，即使这种情况下也能准确地检测肿瘤干细胞。本发明中，“肿瘤干细胞”是指癌细胞中具有干细胞性质的细胞。干细胞是指即使经过细胞分裂也维持着分化能力的细胞。就肿瘤干细胞而言，在用Hoechst荧光染料 (Hoechst33342)染色用流式细胞仪以UV激光(波长约350nm)为激发光进行检测时，侧群 (Side Population, SP)级分会被浓缩。SP级分是指相对于被Hoechst荧光染料染色的主群(Main Population,MP)级分而言，介由ABC转运体等将染料排出细胞外从而不被染色的级分。本发明中，“正常细胞”是指生物体或组织的活动中具有正常功能的细胞。正常细胞可以含有体干细胞，优选为成熟细胞。本发明的分子标记优选为在多个癌种的肿瘤干细胞共通被检测的分子标记，在多个癌种中能够作为单一的标记使用。在例如来源于心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、 胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞等细胞或组织的多个癌种的肿瘤干细胞中共通表达，因此能进行检测。进而，本发明的分子标记在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。优选在例如来源于心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、 小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞等中的至少1种以上非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。本发明的分子标记能够在肿瘤干细胞中表达或检测，但在正常细胞中不能表达或检测，从而能够在采集自含有肿瘤干细胞的细胞或组织中的任意细胞团中检测肿瘤干细胞。为了用作具有通用性的分子标记，优选在多个癌种中能够用作单一的标记，典型的是，在心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、 白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞等细胞或组织中的至少2种以上的正常细胞中检测不到，优选在至少3种以上中检测不到。最优选在全部的细胞或组织中的正常细胞中检测不到。本说明书中，“基因的表达”是指以该基因的转录为起点的一系列的生物体反应， “表达产物”是指例如mRNA、内源性多肽等该一系列生物体反应所生成的分子。另外，本说明书中，“表达”是指能够用例如RT-PCR、原位杂交、免疫检验法、色谱法等本领域技术人员已知的方法确认到表达产物。另外，“检测不到”是指在前述表达产物的确认方法中无法确认到表达产物。另外，在例如RT-PCR等灵敏度极高的检测方法中出现信号似乎被检测到但信号强度有显著差异、在免疫检验法等本发明实施方式中从实用性观点来看具有足够灵敏度的检测方法的检测水平以下等情况，这些情况在本说明书中也包括在 “检测不到”中。本发明检测的基因的表达产物优选为具有公知序列的基因的表达产物，但也可以为其同源体。优选为具有以下mRNA或cDNA序列的基因的表达产物。Sox2 =Gene accession No. NM_003106Smcp :Gene accession No.NM_030663
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Intsl =Gene accession No. ΝΜ_001080453Koxl2 :Gene accession No. NM_152907Mdfl =Gene accession No. NM_005586FLJ13464 =Gene accession No. AK023526667J232 =Gene accession No. AL833225Surf6 =Gene accession No. NM_006753Pcdhl9 =Gene accession No. NM_001105243Dchs2 =Gene accession No. NM_017639Pcdh21 =Gene accession No. NM_033100Gal3stl :Gene accession No. NM_004861Raslllb =Gene accession No. NM_023940Hes6 :Gene accession No. NM_018645Znf415 =Gene accession No. NM_018355Nkx2-5 =Gene accession No. NM_004387Pamci :Gene accession No. NM_005447Pnmt :Gene accession No. NM_002686Scgb3al :Gene accession No. NM_0528630r7cl :Gene accession No. NM_198944Dnajb8 :Gene accession No. NM_153330本发明中，判定对象优选为人、来源于人的组织和/或来源于人的细胞，但也可以为人以外的动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等啮齿类、黑猩猩等灵长类、牛、山羊、绵羊等偶蹄目、马等奇蹄目、兔子、狗、猫等)、来源于该动物的组织、和/或来源于该动物的细胞。判定是指在检测到本发明的分子标记时判定为存在肿瘤干细胞，判定对象中也可以含有正常细胞和/或非肿瘤干细胞的癌细胞。从能够在多个癌种中用作单一的标记的观点出发，优选检测 Sox2、Smcp, IntsU Koxl2、MdfU FLJ13464、667J232、Surf6, Pcdhl9、 Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Rasllib、Hes6、Znf415> Nkx2_5、Pamci、Pnmt、Scgb3al、0r7cl、禾口 DnajbS的表达产物来进行判定，最优选检测Sox2的表达产物来进行判定。本发明的分子标记为mRNA时，其检测中使用探针、引物等与mRNA特异性结合的试剂。从检测灵敏度高、操作简便性等观点出发，优选用RT-PCR法检测。本发明的分子标记为内源性多肽时，其检测中使用抗体、配体等与肽特异性结合的试剂。例如，抗体可以使用多克隆抗体和/或单克隆抗体。从非特异性反应更低的观点出发，优选使用单克隆抗体。判定可以是体内或体外的判定。本说明书中，“体外的判定”是指使从生物体采集的组织或细胞在例如培养液等生物体外环境中生长繁殖后进行判定。与此相对，“体内的判定”是指在生物体内直接判定，或者从生物体采集组织或细胞后立即判定或固定后判定。组织或细胞采集可以通过例如切开、细胞抽吸、采血、采尿等来进行，但并不仅限于此。在体内进行判定时，可以使用本领域技术人员公知的体内检测法来进行。体内的判定可以使用例如血液检查、原位杂交、原位PCR、免疫组织染色等公知的检测法来进行。
在体外进行判定时，可以使用例如免疫组织染色、RT-PCR等本领域技术人员公知的体外检测法来进行，但不仅限于此。进行RT-PCR时，循环数优选为30 35个循环。在组织培养后的肿瘤组织中进行判定等也包括在体外的判定中。本发明的分子标记在肿瘤干细胞中特异性表达，因此推测其检测量与肿瘤干细胞的个数是相关的。因此，在投与针对对象的候补化合物的前后，如果本发明的分子标记的检测量减少，则这可以认为是肿瘤干细胞的个数已减少。即，通过比较投与前后的分子标记的检测量，能够筛选作为针对肿瘤干细胞的候补治疗药的化合物。因此，该筛选方法也包含在本发明中。另外，本发明还包含含有用于检测上述分子标记的试剂的试剂盒。试剂盒中，例如为了用于检测mRNA，可含有探针、引物等特异性检测mRNA的试剂；为了用于检测多肽，可含有配体、抗体等特异性检测多肽的试剂。试剂盒中可含有至少1种以上前述试剂。试剂盒中可含有例如反应用缓冲液、反应促进剂等适合于其使用方式的附带试剂。从在多个癌种中能够单独利用的观点出发，可含有用于检测基因序列优选为 Sox2、Smcp, IntsU Koxl2、MdfU FLJ13464、667J232、Surf6, Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、 Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、Nkx2-5、Pamci、Pnmt、Scgb3al、0r7cl^Dnajb8iiftit 为Sox2的基因产物的试剂。本发明中，“具有与基因互补的碱基序列的探针和/或引物”是具有与基因序列的一部分序列互补的序列从而能够与其特异性结合的DNA或RNA，其可以用例如荧光标记、放射线标记等随意标记。使用上述试剂盒检测肿瘤干细胞从而判定判定对象是否为癌的方法也包含在本发明中。本发明的具有作为分子标记功能的多肽能够用作抑制肿瘤干细胞功能、或杀灭肿瘤干细胞的抗原。这些多肽只要具有例如抗体识别部位、蛋白质结合部位等功能性部位即可，长度可以为例如9 11个氨基酸左右。另外，例如蛋白质的三级结构被抗体识别的情况、以多聚体形式进行抗体识别的情况、通过结合修饰基而成为抗体识别部位的情况等需要经过一些修饰、变形等方能显示功能性部位的情况下，也可以具有该功能性部位的结构。这些多Jft优选来源于选自 Sox2、Smcp Jntsl、Koxl2、Mdf l、FLJ13464、667J232、Surf6、 Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415> Nkx2_5、Pamci、Pnmt、Scgb3al、 0r7cl和DnajbS所组成的组中的基因的表达产物。以这些多肽为抗原杀灭肿瘤干细胞的方法包括例如基于诱导CTL的方法、利用多肽特异性抗体引起免疫反应的方法、通过与多肽结合从而抑制或拮抗其功能的方法等，但不仅限于此。本发明基因表达产物来源的表位、和与其特异性反应的抗体结合时，其结合抗体作为信号而活化免疫反应。该表位自身为在肿瘤干细胞中特异性表达的分子标记或其结构的一部分，因此强烈暗示通过特异性抗体结合能够引起特异性识别肿瘤干细胞的免疫级联的活化。另外，抗体也能够与攻击癌细胞的药剂等结合使用。因此，能够应用于阻击肿瘤干细胞的所谓导弹疗法中。因此，上述方法中使用的抗体以及含有多肽和/或抗体的药物组合物也包含在本发明中。
作为药物组合物，可列举出例如癌症疫苗、抗癌剂等，但不仅限于此。这些组合物中，除本发明的多肽和/或抗体外，根据需要可适当含有例如具有抗肿瘤作用的药剂、助剂、药学上允许的载体等。进而编码上述多肽的核酸、和含有该核酸的药物组合物也包含在本发明中。含有前述核酸的药物组合物可列举出例如DNA疫苗等，但不仅限于此。这些组合物中，除本发明的核酸外，根据需要可适当含有例如具有抗肿瘤作用的药剂、助剂、药学上允许的载体等。在本发明的分子标记的多肽片段中，存在通过被称为主要组织适合抗原(MHC分子)蛋白进行抗原呈递的片段。细胞毒性T细胞(CTL)通过识别与MHC I类分子结合的特定抗原，引发引导抗原呈递细胞进入细胞凋亡的免疫反应。根据发明人等的研究获知，来源于本发明的分子标记的多肽中，一部分多肽与人 MHC分子之一的HLA-AM显示较高亲和性，进而其一部分具有诱导CTL、引导细胞进入细胞凋亡的能力。该结果强烈暗示通过本发明的多肽能够赋予针对肿瘤干细胞的免疫记忆。这表示，本发明的多肽显示出能够实际应用于特异性治疗肿瘤干细胞的方法的性质。由于本发明的分子标记在肿瘤干细胞中特异性表达，因此暗示其多肽的一部分中的一者能够通过MHC分子进行抗原呈递。通过该MHC分子进行抗原呈递的多肽(表位肽) 的筛选对于癌的治疗是有用的。因此，该筛选方法也包含在本发明中。筛选中可使用通常的表位作图法。例如，将目标多肽切成适当长度的肽片段，并制备多种该肽片段后，将目标多肽和/或肽片段、抗原呈递细胞和T细胞一起培养，从而致敏T 细胞。然后，将致敏的T细胞、抗原呈递细胞和肽片段一起培养，对T细胞进行再刺激。然后，测定T细胞的活化程度，筛选出活化程度高的肽，测定表位序列。此时，活化程度、细胞毒性活性、细胞因子产生量的测定等可适当选择本领域技术人员公知的方法。另外，通过限定τ细胞的HLA型，能够选择限定于特定的HLA型的抗原肽。可以认为，本发明的具有作为分子标记功能的DNA为在肿瘤干细胞中特异性表达的DNA，通过抑制其表达，从而能够抑制肿瘤干细胞所具有的功能。由此用于抑制本发明的具有作为分子标记功能的DNA表达的核酸也包含在本发明中。抑制表达的方法可列举出例如RNAi、阻遏物的表达等，但不仅限于此。因此，用于抑制DNA表达的核酸包含例如siRNA、shRNA、shDNA等，但不仅限于此。核酸只要具有足以抑制DNA表达的碱基数即可，可以为任意长度。核酸除了为DNA、RNA外，也可以为核酸类似物，从通用性等观点出发，优选为DNA 和/或RNA。通过抑制本发明的具有作为分子标记功能的DNA的表达，暗示能够特异性和/或高效攻击肿瘤干细胞。即，暗示了上述核酸能够应用于基因导入治疗。因此含有本发明的核酸的药物组合物也包含在本发明中。上述的药物组合物可以用作例如抗癌剂、转移抑制剂、包括DNA疫苗在内的癌症疫苗等癌症治疗药，但不仅限于此。这些药物组合物中，除本发明的核酸外，根据需要可适当含有例如具有抗肿瘤作用的药剂、助剂、药学上允许的载体等。另外，使用本发明的核酸抑制肿瘤干细胞中的本发明的具有作为分子标记功能的 DNA表达的方法也包含在本发明中。以下的实验例是对本发明进行具体说明的例子，对本发明范围无任何限定。本领
14域技术人员可根据所具有的常规知识和技术在不脱离本发明的精神的范围内对下述实验例所述的实施方式进行多种改变，所述改变后的方式当然也包含在本发明内。实施例1实验例1 癌细胞的SP级分的分离a)试剂的调制培养基调制加入5%的抗胎牛血清(FCS)的DMEM培养基，预先升温到37°C。戊脉安调制成 50mM，用 5% FCS+DMEM 稀释至 5mM。Hoechst33;342 用 5% FCS+DMEM 调制成 250 μ g/mlo DNAseI 用DDW调制成lmg/ml并用0. 2 μ m的过滤器过滤灭菌。b)流式细胞仪(FACS)用细胞的调制将细胞用細1的5% FCS+DMEM悬浮，数出细胞数。再加入5% FCS+DMEM，将细胞浓度调整为IX IO6个/ml，对于戊脉安(+)用，在i^lcon管中加入Iml上述细胞。将戊脉安(+)用和剩余的细胞(戊脉安(_)用)在水浴中于37°C孵育10分钟。孵育后，在戊脉安 (+)用中加入戊脉安溶液，使戊脉安的最终浓度为50 75 μ M，然后，在戊脉安(+)用和戊脉安(“)用中加入Hoechst33342溶液，使Hoechst33342的最终浓度为2. 5 μ M 5. 0 μ M。于37°C下震荡孵育90分钟，立即在冰上冷却。以1100 1500rpm、4°C离心分离 3分钟，除去上清。用lXPBS+5% FCS液悬浮，转移至预先冰冷的FACS管。再次以1100 1500rpm、4°C离心分离3分钟，除去上清，用1 XPBS+5 % FCS液悬浮。再一次以1100 1500rpm、4°C离心分离3分钟，除去上清，在lXPBS+5% FCS中加入EDTA使EDTA最终浓度达到2mM，用500 μ 1该液体悬浮。加入0. 5 μ 1 DNAseI液，移液，使其通过FACS用过滤器。 加入0. 5 μ 1 lmg/ml的碘化丙啶(PI)，以流动速度1000 2000个/秒来进行FACS。c)流式细胞仪(FACS)流式细胞仪使用的是BD FACS Aria II special edition(注册商标)(ecton， Dickinson and Company公司制)。FACS的操作按照操作说明书来进行。最初流入戊脉安 (-)的细胞，确认是否能检测到SP级分的细胞，若能够检测到，则对SP级分设门，流入戊脉安(+)的细胞，确认SP级分的细胞是否消失。若消失，则断定该级分的细胞是SP级分细胞， 分离出该级分的细胞。将分离后的细胞于4°C、1500rpm离心分离15分钟，除去上清后，以 100 200 μ 1的IXPBS悬浮，数出细胞数。其结果，在腺癌Α549、LHK2、和小细胞癌Lc817中检测到了 SP级分的细胞。其结果如图1所示。在肺癌中，也在被视为较易发生转移的系统的腺癌、小细胞癌中检测到了 SP级分的细胞，这与肿瘤干细胞是转移的主要原因的见解是一致的。实施例2实验例2 肿瘤形成能力实验通过与实验例1同样的方法分别使用LHK2、MCF7和SW480细胞系进行分级，将分级得到的SP细胞和MP细胞接种于小鼠中，以确认肿瘤形成能力。将数量相同的SP细胞和 MP细胞分别在冰上悬浮于100 μ 1的IXPBS中，混合到100 μ 1的基底胶(Matrigel)中。 将100 μ 1的细胞基底胶混合液接种到N0D/SCID小鼠(由才1J工 > 夕 >工房公司获得)的背部皮下，且SP和MP细胞分别在每1处接种1500个，从形成肿瘤时起测定长径和短径的长度，近似成旋转椭球体，计算体积并进行比较。结果如图2所示。其结果，从LHK2分级得到的SP细胞，在仅移植15个细胞时，5匹中的2匹中形成了肿瘤，或者在移植150个时5匹全部形成了肿瘤，等；可知其与移植150个时1匹中都没有形成肿瘤的MP细胞相比，具有非常高的肿瘤形成能力。这与肿瘤干细胞是肿瘤形成的极其重要的原因、SP级分细胞中浓缩了肿瘤干细胞的见解是一致的。(参考文献Kondo T, Setoguchi T, Taga T.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line.Proc Natl Acad Sci U S A. 20 :781-786,2004.)实施例3实验例3 利用DNA微阵列确认表达a)mRNA 的提取将通过与实验例1同样的方法分离得到的SP细胞和MP细胞于室温、1500rpm下离心分离5分钟，除去上清。mRNA的提取使用RNeasy试剂盒^IAGEN K. K.制)并按照试剂盒的规程来进行。b)mRNA的扩增和标记使用从Sigma Genosys公司获得的RNA扩增试剂盒，对提取得到的mRNA进行mRNA 扩增，再用从Sigma Genosys公司获得的mRNA标记试剂盒，对扩增得到的mRNA进行标记， 其中从SP级分提取得到的产物用Cy5标记，从MP级分提取得到的产物用Cy3标记，再交换染料，用Cy3标记从SP级分提取得到的产物，用Cy5标记从MP级分提取得到的产物。c)微阵列 将用不同染料标记的来源于SP级分的mRNA和来源于MP级分的mRNA混合，使用由 Sigma Genosis公司获得的DNA下芯片(Panorama (注册商标)微芯片，Human)，按照微阵列试剂盒的规程进行杂交，进行mRNA的表达解析。其结果，确认了 Sox2基因、Smcp基因、 Intsl 基因、Kox 12 基因、Mdfl 基因、FLJ13464 基因、667J232 基因、Surf6 基因、Pcdhl9 基因、Dchs2 基因、Pcdh21 基因、Gal3stl 基因、Raslllb 基因、Hes6 基因、Znf415 基因、Nkx2_5 基因、Pamci基因、Pnmt基因、kgb3al基因、0r7cl基因、和Dnajb8，在SP级分中表达但在 MP级分中不表达或虽然表达但极微量。实施例4实验例4:Sox2的表达a) RT-PCR中使用的引物实验例中RT-PCR中使用的引物的列表如表1所示。[表1]
正向引物反向引物Sox2acttttgtcggagacggagagttcatgtgcgcgtaactgtSmcptgtgtgaccagacaaaacacaggttgggctcagactccatgtIntsltgtccagcatgagcaaactcaaaccgtagcagggtcacac
权利要求
1.分子标记，其为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞的分子标记，在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。
2.根据权利要求1所述的分子标记，检测对象为来源于选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、 骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞所组成的组中的1种或2种以上细胞或组织的细胞团。
3.根据权利要求2所述的分子标记，其在全部检测对象的非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到。
4.根据权利要求1 3中任意一项所述的分子标记，该分子标记为选自0r7cl、 Dnajb8、Sox2、Smcp、Intsl、Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、 Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、Nkx2_5、Pamci、Pnmt 和 kgb3al 所组成的组中的 1 种或 2种以上基因的表达产物。
5.以权利要求1 4中任意一项所述的分子标记为指标来判定判定对象中是否存在肿瘤干细胞的方法。
6.根据权利要求5所述的方法，细胞团含有正常细胞和/或非肿瘤干细胞的癌细胞。
7.根据权利要求5或6所述的方法，细胞团来源于选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单核细胞所组成的组中的1种或2种以上细胞或组织。
8.根据权利要求5 7中任意一项所述的方法，判定是指在检测到选自0r7cl、 Dnajb8、Sox2、Smcp、Intsl、Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、 Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415, Nkx2_5、Pamci、Pnmt 和 Scgb3al 所组成的组中的 1 种或 2种以上基因的表达产物的情况下，判定为存在肿瘤干细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，基因的表达产物为mRNA和/或内源性多肽。
10.根据权利要求9所述的方法，基因的表达产物为mRNA，该方法包括利用RT-PCR法检测的步骤。
11.根据权利要求9所述的方法，基因的表达产物为内源性多肽，该方法包括利用与该内源性多肽特异性反应的试剂检测的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，试剂为抗体。
13.根据权利要求5 12中任意一项所述的方法，判定在体外或体内进行。
14.癌症治疗药的筛选方法，其包括下述步骤i)测定权利要求1 4中任意一项所述的分子标记的、对细胞团投与候补化合物前的检测量A的步骤，ii)对细胞团投与候补化合物的步骤，iii)测定i)中所测定的分子标记的、对细胞团投与候补化合物后的检测量B的步骤，和iv)比较A和B，在A显著大于B的情况下，将候补化合物判定为候补癌症治疗药的步骤。
15.用于判定肿瘤干细胞是否存在的试剂盒，其至少含有用于检测权利要求1 4中任意一项所述的分子标记的试剂。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，用于检测的试剂为用于检测mRNA的、具有与下述基因互补的碱基序列的探针和/或引物，所述mRNA为选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp, Intsl、Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、 Hes6、Znf415、Nkx2-5、Pamci、Pnmt和kgb3al所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物。
17.根据权利要求15所述的试剂盒，用于检测的试剂为用于检测多肽的抗体，所述多月太为选自 0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp, IntsU Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6, Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Rasllib、Hes6、Znf415> Nkx2_5、Pamci、Pnmt 禾口 Scgb3al 所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物。
18.癌症的判定方法，其使用权利要求15 17中任意一项所述的试剂盒。
19.多肽，该多肽为能够用作用于抑制肿瘤干细胞的功能、或杀灭肿瘤干细胞的抗原的多月太，所述多Jft为由 0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp, IntsU Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、 Surf6> Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Rasllib、Hes6、Znf415> Nkx2_5、Pamci、Pnmt 禾口 Scgb3al所编码的多肽或其一部分，或者在该多肽或其一部分中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸而形成的多肽。
20.抗体，该抗体与源于选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp, IntsU Koxl2、Mdfl、 FLJ13464、667J232、Surf6, Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、 Nkx2-5、Pamci、Pnmt和kgb3al所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物的表位特异性反应。
21.药物组合物，其含有至少1种以上权利要求19所述的多肽和/或权利要求20所述的抗体。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，该药物组合物为癌症治疗用或癌症预防用组合物。
23.将权利要求19所述的多肽作为抗原抑制肿瘤干细胞的功能、或杀灭肿瘤干细胞的方法。
24.根据权利要求23所述的方法，该方法使用权利要求20所述的抗体。
25.编码权利要求19所述的多肽的核酸。
26.含有权利要求25所述的核酸的药物组合物。
27.根据权利要求沈所述的药物组合物，该药物组合物为DNA或RNA疫苗用组合物。
28.通过主要组织适合抗原进行抗原呈递的肽的筛选方法，该方法包括下述步骤 i)制备将目标多肽切断而成的具有适当长度的肽片段的步骤， )将i)中获得的肽片段、抗原呈递细胞、和用目标多肽和/或i)中获得的肽片段致敏的T细胞一起培养的步骤，iii)测定ii)中获得的T细胞的活化程度的步骤，iv)筛选iii)中使T细胞活化的肽片段的步骤， 其中，目标多肽为权利要求19所述的多肽。
29.核酸，该核酸用于抑制肿瘤干细胞中选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp,IntsU Koxl2、Mdn、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、(ial3stl、Raslllb、Hes6、 &if415、Nkx2-5、Pamci、Pnmt和kgb3al所组成的组中的基因的表达。
30.根据权利要求四所述的核酸，该核酸为DNA和/或RNA。
31.药物组合物，其含有至少1种以上权利要求四或30所述的核酸。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，该药物组合物为癌症治疗用药物组合物。
33.使用权利要求四所述的核酸抑制肿瘤干细胞的功能的方法。
全文摘要
本发明涉及分子标记，该分子标记为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞的分子标记，其在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞和正常细胞中检测不到；还涉及以该分子标记为指标来判定判定对象中是否存在肿瘤干细胞的方法。进而，本发明涉及试剂盒，其为用于判定肿瘤干细胞是否存在的试剂盒，至少含有用于检测前述分子标记的试剂。进而，本发明还涉及前述分子标记所编码的多肽、识别该分子标记的基因表达产物的表位的抗体、抑制该分子标记表达的核酸、含有来源于该分子标记的基因的核酸疫苗。
文档编号A61P35/00GK102203290SQ20098014267
公开日2011年9月28日 申请日期2009年10月27日 优先权日2008年10月27日
发明者上口権二郎, 佐藤昇志, 守田玲菜, 岛越俊彦, 广桥良彦, 西泽哲, 高桥阿卡利 申请人:北海道公立大学法人札幌医科大学, 大日本住友制药株式会社