专利名称：一种能够富集并扩增悬浮血液肿瘤干细胞的新方法、新培养基及其在药物筛选中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域中的细胞培养基制造，更具体地，涉及一种从血液系统的肿瘤细胞中筛选、培养和扩增相应肿瘤干细胞亚群的技术和方法，作为白血病治疗药物筛选和生物治疗、基因治疗的筛选、体外评价模型方法和实验材料。
背景技术：
肿瘤是威胁人类健康的一种重要疾病，是目前人类疾病死亡的第二杀手。白血病是人体循环系统的肿瘤，近年来该疾病的发生呈显著的增长态势，并呈现低龄化的趋势。人们对白血病的治疗，主要通过化疗的方法。虽然骨髓抑制被认为是治疗白血病和淋巴瘤的有效手段，但是由于血液配型等异体抑制排斥作用的存在，严重限制了骨髓移植技术的广泛应用。化疗技术虽然能够显著抑制白血病和淋巴瘤的增殖，能够彻底治愈的仍不普遍。大约50年前，人们最早从髓性白血病的发生和演变规律中提出了肿瘤干细胞的概念S并认为这些肿瘤干细胞是正常干细胞和/或祖细胞通过突变形成的。正常造血干细胞能够持续分化成造血细胞，如红细胞、血小板、白细胞(包括T-淋巴细胞和B-淋巴细胞)、中性粒性细胞等。肿瘤干细胞与正常干细胞具有相似的性质，也能分化、增殖成具有基因缺陷的造血细胞系或未成熟的祖细胞，又称胚细胞。人们发现并验证肿瘤干细胞在肿瘤的发生、发展与恶化过程中的作用首先是从急性髓性白血病病人样品中分离出一种具有表面抗原CD96阳性的肿瘤细胞亚型2，这种肿瘤干细胞在肿瘤中的数目极少，但肿瘤的恶性很强，是肿瘤的化疗耐药的重要原因之一，也是白血病化疗失败的重要根源。因此，寻找新的、高效低毒、对肿瘤干细胞专一的新的肿瘤治疗方法和新的药物筛选模型是彻底治愈肿瘤疾患的一个主要技术瓶径。目前从临床血液样品，骨髓或白血病细胞系分离悬浮肿瘤干细胞仍然是一件非常困难的事，主要原因是由于血液肿瘤干细胞的数目非常少。已经被广泛采用的分离方法有两种3，(1)通过标记肿瘤干细胞的特征表面抗原，采用流式细胞分选技术或免疫磁珠分选出富含肿瘤干细胞的组分。目前所使用的表面特征抗原主要有⑶9，⑶33，⑶44，⑶90，⑶96， CD110，CD123等。由于采用单一表面抗原对肿瘤干细胞的区分能力具有局限性，用该法分选出的肿瘤干细胞数量少，分离过程中细胞受损伤以及干细胞的纯度不够高，是限制深入研究肿瘤干细胞的一个技术屏障。( 研究肿瘤干细胞的另一种分选策略是通过细胞流式分选技术将血液肿瘤中的能排出荧光染料，如荧光染料Hoechst 33342，的细胞，称为侧群细胞。由于侧群细胞只是相对富集了肿瘤干细胞，通过研究肿瘤侧群细胞的性质并不能全面反映肿瘤干细胞的性质。因此目前研究和产品研发上迫切需要由血液肿瘤细胞株直接进行肿瘤干细胞筛选、培养、扩增的简便方法。
发明内容
本发明主要涉及到一种从血液系统肿瘤细胞中分选、富集、培养和扩增血液肿瘤干细胞的新方法。用该方法获得的血液肿瘤干细胞具有肿瘤干细胞的特征基因、干细胞表面标志抗原的高表达。用该方法获得的血液肿瘤干细胞是筛选新型白血病治疗药物的体外模型。本发明的核心内容有以下四个方面。第一方面，本发明提供了一种能快速培养血液肿瘤集落的新的方法。在血液肿瘤细胞的集落培养中，以胚胎干细胞培养基如HE&GR0 中加入jadl等因子为培养基主要组分进行半固体培养，血液肿瘤细胞可以形成集落。该集落具有血液肿瘤干(祖)的特征。本领域的技术人员应该理解，本发明所述的胚胎干细胞培养基是血液肿瘤干细胞集落培养的主要成分，该胚胎干细胞培养基不局限于HE&GR0 ，利用胚胎干细胞培养基为基础，添加某些细胞增殖相关的成分，如细胞因子。第二方面，本发明提供了能有效富集血液肿瘤干细胞的添加剂。该添加剂，通过抑制GSK信号通路和酪氨酸激酶抑制剂达到有效抑制干细胞分化，提高血液肿瘤干细胞筛选的效率。第三方面，本发明提供了本发明所述的培养基的用途，其可以用于制备血液肿瘤细胞的干细胞。这些肿瘤细胞可以是已经建株的血液肿瘤细胞株，也可以是原代肿瘤细胞。第四方面，本发明提供了包含本发明所述的核心培养基的血液肿瘤干细胞培养试剂盒。第五方面，本发明提供了一种用于筛选对血液肿瘤干细胞专一、高效的新的药物筛选模型。这里新的药物不仅是化疗药物(化学合成药和天然药物)，也包括现代生物技术药物，如蛋白、多肽药物和核酸药物，小核酸药物。以下将通过实施例对本发明作进一步的阐述，但实施例并不限制本发明的保护范围。本领域的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，进行不背离本发明的精神和范围的修改和变动，这也在本发明的保护范围之内。
图1.人急性T-淋巴母细胞瘤Hut-102在含有本发明阐述的半固体琼脂培养基中接种培养过夜后形成Hut-102干/祖细胞(Hut-102Q集落的照片。细胞的放大倍数为100倍。图2.人急性T-淋巴母细胞瘤Hut-102和其干/祖细胞Hut_102S悬浮培养传代的细胞形态。其中Hut-102的培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，Hut_102S为本发明公开的干细胞培养基。细胞的放大倍数为100倍。图3.人早幼粒白血病K562细胞在半固体干细胞培养基中的克隆生长。细胞的放大倍数为100倍。图4.人急性T-淋巴母细胞瘤Hut-102和其干/祖细胞Hut_102S的相关干细胞基因的表达。取人β-actin基因为内参基因。图5.人急性T-淋巴母细胞瘤Hut-102和其干/祖细胞Hut_102S的相关干细胞抗原的表达。图6.人早幼粒白血病K562细胞的干细胞的特异表面抗原的表达。图7.阿霉素和长春新碱分别Hut-102和Hut_102S细胞增殖抑制的量效曲线。其中图A为阿霉素对细胞增殖的抑制作用曲线，图B为长春新碱对细胞增殖的抑制作用曲线。 Hut-102和Hut-102S的培养条件与图2相同，Hut-102和Hut_102S细胞分别在96孔板中接种5000个/孔，过夜后分别加入不同浓度的阿霉素和长春新碱，继续培养4 后，用活细胞记数试剂盒测量活细胞的相对数目，并以不加化疗药的实验孔为0抑制率。
具体实施例方式以下将通过实施例对本发明作进一步详细的阐述。但是，本领域的普通技术人员应该理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，并不限制本发明的保护范围，本发明的精神和范围由后附的权利要求所限定。本领域有关的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，进行不背离本发明的精神和范围的修改和变动，这也在本发明的保护范围之内。实施例1. T-淋巴瘤的肿瘤干/祖细胞集落培养、扩增人T-淋巴细胞瘤株Hut-102购自美国细胞库ATCC(TIB-162)，细胞培养使用含 10%胎牛血清(PAA，FCS500)的DMEM培养基(北京钮因华信科技有限公司，DM10140021)， 在Coring公司生产的T-25细胞培养瓶中培养，培养条件为37°C，5% CO20细胞每两天传代一次。血液肿瘤细胞的集落培养在Corning公司的35mm培养皿中进行。培养皿的下层铺一层含琼脂糖的DMEM半固体培养基。另取新的血液肿瘤干细胞培养基(配方见表1)配成0. 3%的琼脂糖培养基1毫升，并在其中接种1000个Hut-102细胞，混勻后轻轻铺在1 % 琼脂糖的上面。本发明公开的悬浮肿瘤干细胞培养基的配方见表1。细胞在37°C，5% CO2 细胞培养箱中培养。第五日在显微镜下观察，可以看到有细胞集落的形成(见图1)。该方法较目前广泛使用的造血干细胞集落培养方法更有效更快速。目前通常使用的方法培养血液细胞祖细胞通常需要2周以上。表1 悬浮肿瘤干细胞筛选、扩增用培养基配方
成分含量DMEM基础培养基0-30% (ν/ν)胚胎干细胞培养基HEScGRO70-100% (ν/ν)DII40-2mg/mlFGF20-lmg/mlJagl0-2mg/mlCHIR990210-300nM
PD173074,0-1 μ MPD1843520-1 μ MPD03259010-1 μ M将Hut-102单集落挑出到细胞培养瓶中，在血液肿瘤干细胞培养基中(37°C，5% CO2)悬浮培养。肿瘤干细胞可以大量扩增。图2显示与野生型Hut-102相比，干细胞形状规则，呈圆形，细胞比野生型稍大。实施例2.早幼粒白血病K562细胞株的细胞干/祖细胞集落培养、扩增人早幼粒白血病K562细胞株购自美国细胞库ATCC( ？)，细胞培养使用含10% 胎牛血清(PAA，FCS500)的DMEM培养基(北京钮因华信科技有限公司，DM10140021)，在 Coring公司生产的T-25细胞培养瓶中培养，培养条件为37°C，5% C02。细胞每3天传代一次。血液肿瘤细胞的集落培养在Corning公司的35mm培养皿中进行。培养皿的下层铺一层含琼脂糖的DMEM半固体培养基。另取新的血液肿瘤干细胞培养基(配方见表1)配成0. 3%的琼脂糖培养基1毫升，并在其中接种1000个K562细胞，混勻后轻轻铺在琼脂糖的上面。细胞在37°C，5% CO2细胞培养箱中培养。第五日在显微镜下观察，可以看到有细胞集落的形成(见图3)。将上述克隆挑出，转移到本发明公开的干细胞培养基中扩增培养，获得具有干细胞特性的早幼粒白血病细胞亚群。本发明为研究K562干细胞的行为特征提供了研究素材的保证，因为用传统的分离方法很难获得大量的K562干细胞。实施例3.淋巴瘤干细胞的干细胞基因表达为了验证所筛选、培养的Hut-102新亚型(Hut_102Q是肿瘤干细胞，对该细胞亚型的几个干细胞特征基因表达情况的变化进行了测定。这里选的是研究胚胎干细胞中使用比较普遍的Nanog，0ct4和Sox2这四个基因。所用的PCR引物见表2，PCR实验采用天根生物技术公司的RT-PCR试剂盒(KR114)，并按照试剂盒操作说明书进行。图4给出了在 Hut-102和Hut-102S的PCR产物的凝胶照片。图中显示内参基因β -actin在Hut-102和 Hut-102S中的表达量相同，干细胞标志基因NANOG在Hut-102中不表达，在Hut_102S中表达显著上升，而S0X2基因在Hut-102S的表达出现一定程度的下降，而干细胞基因0ct4在 Hut-102与Hut-102S中的表达没有显著的变化。近来有文献报道4⑶90和⑶110是一个鉴定急性淋巴母细胞瘤干细胞的特征标志物，但是使用本发明制备的肿瘤干细胞Hut-102S 的⑶90和⑶110的表达与野生型细胞没有差别，两者的⑶90表达均成阳性，而⑶110的表达均成阴性(结果未显示)。上述结果验证了使用本发明的制备方法和培养基获得的血液肿瘤细胞亚型具有更强的干细胞的基因表达特征，符合血液肿瘤干细胞的特征，且不同于已经鉴定的T-淋巴瘤干细胞。表2PCR用的引物序列
权利要求
1.一种能够大量并快速富集和培养悬浮肿瘤干细胞的方法及培养基配方。
2.权利1要求所述的快速富集和培养悬浮肿瘤干细胞的方法由下述几个关键环节组成A)制备相互分离的肿瘤细胞悬液，B)无血清的悬浮肿瘤干细胞半固体培养基的配制， C)抑制干细胞分化成份的添加，D)加快干细胞增殖成份的补给，E)肿瘤干细胞与半固体培养基的混合、培养和换液。
3.权利1和2要求所述的培养悬浮肿瘤干细胞的方法及培养基配方，必须在胚胎干细胞培养基或具有类似功能的胚胎干细胞培养基中添加适量的Delta-like4(D114)，Jagged 1 (Jagl)和 FGF2 成分。
4.权利1和2要求所述的培养悬浮肿瘤干细胞的方法及培养基配方，必须在培养基中加入抑制GSK信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂，这些抑制剂包括但不局限于 CHIR99021, PD173074, PD184352, PD0325901 等。
5.权利1中所要求的培养基配方可包含添加的基础培养基，如DMEM，RPMI1640；添加的浓度范围为0-30% (体积/体积)。
6.权利1要求所述的悬浮肿瘤干细胞培养基配方可制造成不同的培养试剂盒，其中包括不同悬浮肿瘤干细胞增殖所需要的细胞增殖因子、细胞分化抑制剂。
7.权利1要求的通过使用本发明的方法和/或培养基获得的血液肿瘤干细胞标志物， 可用于肿瘤的诊断和治疗效果的评估。
8.权利1要求的通过使用本发明的方法和/或培养基获得的血液肿瘤干细胞可用于化疗药物的筛选、评估和使用。
全文摘要
本发明提供了一种利用胚胎干细胞培养基能够大量并快速富集和培养血液悬浮肿瘤细胞中的干/祖细胞亚群的新方法和培养基组成。采用胚胎干细胞培养基并通过添加抑制GSK信号通路和酪氨酸激酶的抑制剂小分子化合物以及其它因子，可以在半固体培养基中挑选出血液肿瘤细胞的干/祖细胞克隆，该克隆在本发明所提供的血液肿瘤干细胞培养基中能够大量悬浮培养和扩增。利用该方法获得的血液肿瘤干细胞在细胞形态，干细胞基因表达，干细胞表面特征抗原表达等方面均拥有特定的标志，所筛选出的悬浮干细胞的干细胞特性更接近于胚胎干细胞，对化疗药物更具有非常明显的抗药性。此项发明在富集和克隆血液悬浮肿瘤干细胞，和筛选和鉴定针对肿瘤干细胞的特效药物等方面具有很好的应用前景。
文档编号C12N5/095GK102409026SQ20101028930
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月25日 优先权日2010年9月25日
发明者张洪杰, 殷勤伟, 王珊珊, 黄兵 申请人:张洪杰, 殷勤伟, 黄兵