专利名称：一种能够筛选并富集实体肿瘤干细胞的新方法
技术领域：
本发明属于细胞培养制造领域，更具体地，涉及一种从实体肿瘤细胞中筛选、富集、培养和扩增相应肿瘤干细胞亚群的技术，作为实体瘤治疗药物筛选和生物治疗、基因治疗的筛选、体外评价模型方法和实验材料。
背景技术：
实体瘤是肿瘤疾病中的主要种类，是威胁人类健康的一种重要疾病。关于实体瘤的起源，目前存在着两种不同的模型。一种模型认为肿瘤是一种多基因功能异常的疾病。细胞/组织在病变过程中，随着致癌基因以及表观遗传基因突变的增加，细胞/组织逐渐形成癌前病变，癌变细胞/组织以及恶性癌变细胞/组织。另一类模型认为肿瘤是由肿瘤干细胞增殖分化出来的。肿瘤干细胞在肿瘤细胞/组织中的含量非常少，但却具有类似于胚胎干细胞的自我更新的能力。肿瘤干细胞是干细胞(胚胎干细胞以及成体干细胞)发生基因以及表观遗传基因突变后形成的具有恶性增殖特征的一类干细胞，是肿瘤细胞化、放疗失败的重要因素。肿瘤干细胞最初在白血病患者的肿瘤细胞中被分离出来，发现该肿瘤干细胞具有表面特征抗原CD96。随后在实体瘤中也发现并鉴定了肿瘤干细胞的存在。如在乳腺癌中存在着一种ABCG2基因高表达的细胞亚群，具有肿瘤干细胞的特征。另外还发现ALDH1， ⑶M，⑶44，⑶90，⑶133也是用来鉴定肿瘤干细胞常用的一些生物标志物分子。肿瘤干细胞的分离主要是从新鲜的肿瘤组织中分离。分离方法主要是通过流式细胞分选技术以及免疫磁珠的方法进行(1-3)。采用流式细胞分选方法获得的肿瘤干细胞纯度较高，可达95% 以上，但分选过程会对细胞有较大的损伤，磁珠分选方法虽然条件比较温和，但是分选的干细胞纯度较低，达到80%就是一个比较好的分离结果了。上述两种方法面临的一个共同问题就是分离干细胞需要使用高质量的单克隆抗体，分离成本非常高。另外分离出的肿瘤干细胞如何扩增而不失去或改变其干细胞的特征仍然是一个当前没有解决的一个技术瓶径，是制约肿瘤干细胞研究和发展新的肿瘤治疗技术的技术障碍。因此目前研究和产品研发上迫切需要由实体肿瘤细胞(株)直接进行肿瘤干细胞筛选、培养、扩增的简便方法。
发明内容
本发明主要涉及到一种从实体肿瘤细胞株中分选、富集、培养和扩增肿瘤干细胞的新方法。用该方法获得的实体肿瘤干细胞具有肿瘤干细胞的特征基因、干细胞表面标志抗原的高表达。用该方法获得的肿瘤干细胞是筛选新型抗肿瘤治疗药物的体外模型。本发明的核心内容有以下四个方面。第一方面，本发明提供了一种能快速培养和富集实体肿瘤干细胞的新方法。在实体肿瘤细胞的培养中，以DMEM/F12，胚胎干细胞培养基如HE&GR0 为培养基主要组分的改性干细胞培养基进行肿瘤细胞的贴壁培养，肿瘤干细胞可以逐渐形成集落，而非肿瘤干细胞逐渐凋亡。所形成的集落具有肿瘤干细胞的特征。本领域的技术人员应该理解，本发明所述的DMEM/F12，胚胎干细胞培养基是肿瘤干细胞集落培养的主要成分，其中胚胎干细胞培养基不局限于HE&GR0 ，还包括利用胚胎干细胞培养基为基础，添加某些细胞增殖相关的成分，如细胞因子的培养基。第二方面，本发明提供了能有效筛选肿瘤干细胞的干细胞培养改性剂。该改性加剂通过抑制GSK信号通路和酪氨酸激酶抑制剂达到有效抑制干细胞分化，提高血液肿瘤干细胞筛选的效率。第三方面，本发明提供了本发明所述的培养基的用途，其可以用于制备实体肿瘤细胞的干细胞。这些肿瘤细胞可以是已经建株的血液肿瘤细胞株，也可以是原代肿瘤细胞。第四方面，本发明提供了包含本发明所述的核心培养基的实体肿瘤干细胞培养试剂盒。第五方面，本发明提供了包括使用本发明所述的实体肿瘤干细胞用于肿瘤治疗的细胞模型。以下将通过实施例对本发明作进一步的阐述，但实施例并不限制本发明的保护范围。本领域的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，进行不背离本发明的精神和范围的修改和变动，这也在本发明的保护范围之内。
图1人乳腺癌细胞MCF-7在含有本发明阐述的改性的DMEM/F12培养基中形成的克隆集落。图2人前列腺癌细胞Du-145在含有本发明阐述的改性的胚胎干细胞培养基中形成的克隆集落。图3人前列腺癌细胞Du-145的干细胞克隆的磷酸酶染色性质图4人乳腺癌细胞Du-145经干细胞克隆培养后相关的干细胞特征基因的表达
具体实施例方式以下将通过实施例对本发明作进一步详细的阐述。但是，本领域的普通技术人员应该理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，并不限制本发明的保护范围，本发明的精神和范围由后附的权利要求所限定。本领域有关的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，进行不背离本发明的精神和范围的修改和变动，这也在本发明的保护范围之内。实施例1.人乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞的克隆培养与扩增人乳腺癌MCF-7购自美国细胞库ATCC，细胞培养使用含10%胎牛血清(PAA， FCS500)的DMEM培养基(北京钮因华信科技有限公司，DMlO 140021)，在Coring公司生产的 T-25细胞培养瓶中培养，培养条件为37°C，5%C02。细胞每两天传代一次。在进行MCF-7 的干细胞克隆培养时，首先将在细胞培养皿中培养至90%的交汇度的细胞用胰酶消化，经生理盐水洗涤后，更换干细胞培养基(见配方1)重新悬浮MCF-7细胞，并以每孔5-10万个接种到M孔板的一个培养孔中，细胞继续培养，培养1天后发现有少量细胞增殖，其中的某些细胞呈不完整的球形结构生长，长方式类似的悬浮生长球体.培养至第3天，细胞进一步增殖，呈球形的细胞图进一步增大，至14天时能呈球形生长的细胞进一步增殖，而不能呈球形增殖的细胞逐渐死亡，见图1。该细胞克隆经胰酶消化后，能够在所用的干细胞培养基配方1中继续生长，并形成球型的细胞克隆。该细胞克隆具有肿瘤干细胞的特征，是MCF-7 的一种干细胞亚型。配方1 乳腺癌肿瘤干细胞的筛选、扩增用培养基配方
权利要求
1.一种能够大量传代的实体肿瘤干细胞的培养新方法及新培养基配方。
2.权利1要求所述的快速富集和培养实体肿瘤干细胞的方法由下述几个关键环节组成A)制备相互分离的肿瘤细胞悬液，B)无血清的实体肿瘤干细胞培养基的配制，C)抑制干细胞分化成份的添加，D)加快干细胞增殖成份的补给，E)肿瘤干细胞与干细胞培养基的混合、培养和换液。
3.权利1和2要求所述的培养实体肿瘤干细胞的方法及培养基配方，必须在胚胎干细胞培养基或具有类似功能的胚胎干细胞培养基中添加适量的Delta-like4(D114)，Jagged 1 (Jagl)和 FGF2 成分。
4.权利1和2要求所述的培养实体肿瘤干细胞的方法及培养基配方，必须在培养基中加入抑制GSK信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂，这些抑制剂包括但不局限于 CHIR99021, PD173074, PD184352, PD0325901 等。
5.权利1中所要求的培养基配方可包含添加的基础培养基，如DMEM，RPMI1640；添加的浓度范围为0-30% (体积/体积)。
6.权利1要求所述的悬浮肿瘤干细胞培养基配方可制造成不同的培养试剂盒，其中包括不同实体肿瘤干细胞增殖所需要的细胞增殖因子、细胞分化抑制剂。
7.权利1要求的通过使用本发明的方法和/或培养基获得的实体肿瘤干细胞标志物， 可用于肿瘤的诊断和治疗效果的评估。
8.权利1要求的通过使用本发明的方法和/或培养基获得的实体肿瘤干细胞可用于化疗药物的筛选、评估和使用。
全文摘要
本发明提供了一种新型的实体肿瘤干细胞快速筛选/培养扩增的新方法和培养基配方。利用含GSK信号通路抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂的新型实体瘤干细胞培养基，实体肿瘤细胞通过SP侧群细胞筛选或直接通过肿瘤干细胞筛选/扩增培养基能够选择性的增殖具有肿瘤干细胞特征的细胞克隆，并伴随着胚胎干细胞特征基因Oct4，Nanog以及肿瘤干细胞表面特征抗原基因的高表达。利用本发明所制备的肿瘤干细胞在抗肿瘤新药筛选方面和肿瘤的高效治疗方面具有潜在的应用前景。
文档编号C12N5/095GK102409025SQ20101028927
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月25日 优先权日2010年9月25日
发明者张洪杰, 张颖娱, 殷勤伟, 黄兵 申请人:张洪杰, 殷勤伟, 黄兵