双荧光报告系统在肿瘤干细胞靶向性药物筛选中的应用及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及双荧光报告系统在肿瘤干细胞靶向性药物筛 选中的应用及方法。
【背景技术】
[0002] 抗肿瘤新药的市场需求大、社会和经济效益大，国内外医药行业一直把抗肿瘤药 物作为新药研发的重中之重。目前全球共有至少860种抗肿瘤药物正处于临床试验阶段。 这一数字是处于临床试验阶段的心脏疾病和中风类药物总和的两倍，也是阿尔茨海默病和 其他神经系统疾病类药物总和的两倍。然而目前药物的筛选均是以肿瘤细胞群体作为考 察对象，而近年的研宄指向肿瘤中肿瘤干细胞（CancerStemCells，CSCs)的存在是肿瘤 恶性表现的内在支撑，体现在：CSCs形成于肿瘤早期甚至癌前病变，始动肿瘤发生和演进； CSCs具有多向分化潜能，是肿瘤成分多样性和分化异质性的原因；CSCs具有高侵袭性，是 上皮-间质转化的主要细胞，是转移的"源泉";CSCs抵抗化疗和放疗，是肿瘤复发的根源； CSCs还能始动和促进血管生成，通过分泌血管生成因子、转分化为内皮以及形成血管拟态 为肿瘤提供营养；通过免疫编辑，CSCs具有抑制免疫细胞（DC、T、NK细胞）并参与肿瘤免疫 逃逸机制的形成。因此筛选靶向CSCs的治疗药物已被认为是未来肿瘤综合治疗很有希望 的有效策略之一。
[0003] 目前CSCs药物筛选方面存在很多限制，主要体现在一方面CSCs难以获得，另一方 面CSCs获得以后，在药物筛选过程中会有部分细胞自发分化转变为非CSCs，因此如果此时 以细胞群体作为对象则评价结果不可靠，而再次使用抗体等方法对CSCs进行标记区分则 费事费力，不但无法大规模开展，也会增加系统误差，影响评价结果。
[0004] 本实验前期研宄表明Nanog可以作为肝癌干细胞的新标记物分子，也就 是说，Nanog阴性细胞转变为Nanog阳性细胞即意味着肝癌细胞转变为肝癌干细胞 Ofepatology. 2012, 56 (3) : 1004-14)，本发明拟在上述研宄的基础上，进一步建立肿瘤干细 胞的药物筛选方法，为研宄新型抗肿瘤药物提供新思路。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种双荧光报告系统，并提供了该报告系统在肿瘤干细胞 靶向性药物筛选中的应用，通过此双荧光报告系统能够对肿瘤干细胞进行靶向性药物筛 选；本发明同时还提供了药物筛选的具体方法。
[0006] 本发明采用的技术方案具体如下：
[0007] 1、用于肿瘤干细胞药物筛选的双荧光报告系统，所述双荧光报告系统包括荧光报 告系统I和焚光报告系统II;所述焚光报告系统I由肿瘤干细胞标记分子的基因启动子启 动表达。
[0008] 优选的，所述标记分子为Nanog。
[0009] 优选的，所述荧光报告系统II由组成型启动子启动表达。
[0010] 优选的，所述荧光报告系统II由持家基因的启动子启动表达。
[0011] 优选的，所述荧光报告系统II由细胞内持家基因磷酸甘油酸激酶的启动子启动表 达。
[0012] 优选的，所述双焚光报告系统为双焚光报告载体，其中，焚光报告系统I和焚光报 告系统II位于同一载体；所述荧光报告系统I为绿色荧光蛋白GFP基因的编码区，所述荧 光报告系统II为红色荧光蛋白FP635基因的编码区。
[0013] 优选的，所述肿瘤干细胞为肝癌干细胞。
[0014] 优选的，所述肝癌干细胞为Huh7细胞。
[0015] 2、上述双荧光报告系统在肿瘤干细胞药物筛选中的应用。
[0016] 3、采用上述双荧光报告系统进行肿瘤干细胞药物筛选的方法，先用包含双荧光报 告系统的病毒感染肿瘤细胞并进行细胞培养；待细胞生长汇合度达到40-80%后加入药物 继续培养；培养完毕后，加入细胞核染料对细胞核进行标记；根据单独分布的散在细胞确 定检测细胞的直径范围；用高内涵成像系统检测绿色荧光和红色荧光蛋白的表达情况，通 过统计单位面积内红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的表达情况评估药物对肿瘤干细胞的杀 伤效果。
[0017] 本发明的有益效果在于：通过使用红色和绿色荧光蛋白对群体肿瘤细胞和肿瘤干 细胞分别进行标记，利用高内涵成像系统即可评估药物分别对肿瘤细胞和肿瘤干细胞的靶 向性。由图3可知，本发明所述方法能够分别将肿瘤细胞和肿瘤干细胞标记为红色和绿色 荧光，提示本发明所述方法能够用于药物筛选，而实施例3所述实验证实本发明确实能够 用于肿瘤药物的筛选。由于目前还没有很好的靶向肿瘤干细胞的药物筛选方法，本发明建 立的肿瘤干细胞筛选方法可望用于针对肿瘤干细胞进行新型抗肿瘤药物的筛选，从而提高 抗肿瘤药物的筛选效果。
【附图说明】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0019] 图1为Lv-PhrcK-FP635载体的结构及关键限制性酶切位点的分布示意图，该载体中 hPGK启动子以及红色荧光蛋白FP635基因开放阅读框顺序相连，可将病毒感染的细胞标记 上红色焚光。
[0020] 图2为Lv-PN_g-GFP-PhrcK-FP635载体的结构及关键限制性酶切位点的分布示意 图，该载体中Nanog启动子、绿色荧光蛋白GFP基因开放阅读框、hPGK启动子以及红色荧光 蛋白FP635基因开放阅读框顺序相连。
[0021] 图3为将Lv-PN_g-GFP-PhrcK-FP635载体包装成慢病毒，并感染人肝癌细胞Huh7， 感染后72h拍摄的荧光照片；其中A图表示细胞中红色荧光的表达情况；B图表示绿色荧光 蛋白的表达情况；C图表示相应明场的图片；D图红色荧光、绿色荧光以及明场的叠合图。图 片放大倍数为100倍。
[0022] 图4为感染有Lv-PN_g-GFP慢病毒的人肝癌细胞Huh7,分别用不同浓度的药物 Sorafinib和Verapamil，以及两种联合处理的情况下，用MD的高内涵成像系统对每个处理 组拍摄3X3总计9个视野，图片为系统自动拼合的图片。其中A图表示不同处理情况下 GFP的表达情况；B图表示用DAPI染色的细胞核情况；C图为A和B的叠合图。
[0023] 图5为MD的高内涵成像系统依据细胞GFP的荧光强度自动分析处理结果。其中 A图为拍摄的原始图片；B图为细胞核着色情况；C图为系统依据设定的GFP表达阈值将处 在阈值以上的细胞核标记出来；D图为系统自动处理后，能准确识别出GFP阳性细胞。
[0024] 图6为依据高内涵系统分析结果，分别得到的Sorafinib和Verapamil药物处理 情况下，细胞中GFP平均荧光强度的时间变化曲线，可以据此判断药物对细胞GFP表达的改 变情况，从而评估药物对GFP所表示的肿瘤干细胞特性的影响能力。
【具体实施方式】
[0025] 本发明以肝癌细胞为例，进一步阐述发明的【具体实施方式】，然而需要指出的是，本 发明所述技术方案不仅仅局限于肝癌细胞，亦可稍加改变而用于其它肿瘤细胞。
[0026] 本实验前期通过感染Lv-PN_g-GFP慢病毒的方式对肝癌细胞进行标记，从而 可以用感染Lv-PN_g-GFP慢病毒后表现为GFP(绿色荧光蛋白）不表达的肝癌细胞表 示Nanog阴性细胞，而用GFP表达的肝癌细胞表示Nanog阳性细胞（Hepatology. 2012， 56(3) : 1004-14)。
[0027] 本发明所用肝癌细胞系为Huh7细胞，Huh7细胞来源于本课题组库存。
[0028] 本发明所用分选型和分析型流式细胞仪均购自BD公司；光学显微镜、倒置显微镜 和倒置焚光显微镜均购自Olympus公司；高内涵成像系统购自MD公司。
[0029] 本发明所用Hoechst33342购自碧云天公司；B27Supplement购自Gibco公 司；pTurboFP635-N质粒购自Evrogen公司（CAT:FP722);rTaq酶购自TaKaRa公司； pMD-19-T-Simple载体购自TaKaRa公司（CAT:D104A) ;pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE质粒 购自八(1(^6116公司化41':12252，完整序列见5￡〇10此.4)$1'-(3(^6??质粒为南京金斯瑞 公司合成后本研宄室保存，该克隆载体含有GFP编码基因，合成后即连接在克隆载体T载体 上；CutSmart?Buffer为NEB公司生产；Sorafinib购自SantaCruz公司；Verapamil购自 SantaCruz公司。
[0030] 本发明主要细胞培养试剂及溶液配制如下：
[0031] (l).DMEM培养基：将DMEM粉末溶于超纯水中，每升加入青霉素0.0625g、链霉素 0?llg、NaHC033. 73g和HEPES5. 96g，搅拌至完全溶解，用 10mol/LNaOH将pH调至7. 2-7. 4， 0. 22ym滤膜过滤除菌，4°C保存备用。使用时每瓶按10%体积加入FBS，即为完全培养基。
[0032](2).磷酸盐缓冲液（0. 01mol/LPBS):取PBS袋装粉剂（2L装），用约1L超纯水 溶解，充分搅拌至