一种基于光诱导电子转移筛选g-四链体配体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种体外基于光诱导电子转移均相筛选G-四链体配体的方法，属于 抗肿瘤药物筛选的技术领域。
【背景技术】
[0002] 端粒酶以自身的RNA作为模板，在染色体末端合成端粒序列，以保持染色体末端 端粒长度稳定，从而使细胞永生化。研宄发现，端粒酶在85%以上的癌症细胞中呈阳性表 达，而在正常体细胞中几乎没有表达，并且，肿瘤细胞分化程度与端粒酶的活性直接相关， 这表明端粒酶与肿瘤细胞的恶性转化及快速增殖可能存在密切的关系（ShayJ.W.，Wright ff.E.Telomerasetherapeuticsforcancer:challengesandnewdirections[J].Nat. Rev.DrugDiscov. 2006, 5:577 - 584.)，因此恶性肿瘤与端粒酶的活性之间具有高度的相 关性。
[0003] 富含G的端粒DNA单链在K+、Na+等离子以及一些药物分子的存在下可以通过G碱 基之间的Hoogsteen环状氢键形成稳定的G-四链体结构（HupperJ.L.，Balasubramanian S.Prevalenceofquadruplexesinthehumangenome[J].Nucleic.Acids.Res. 2005, 33(9) : 2908 - 2916.)。G-四链体的形成可以阻止端粒酶对端粒DNA序列的识别， 从而抑制端粒酶的活性。端粒酶活性的抑制可使肿瘤细胞端粒缩短直至细胞停止增殖，转 入细胞凋亡过程，从而抑制肿瘤的发展。因此这一发现使G-四链体成为端粒酶抑制剂作用 的新靶点，对于能够诱导形成或增强G-四链体稳定性的小分子化合物则很有可能对癌症 的治疗具有潜在的意义。
[0004] 在已报道的研宄工作中，X-射线衍射、表面等离子体子共振（SPR)、核磁共振 (NMR)、圆二色性（CD)、凝胶电泳等多种分析方法被用来研宄G-四链体。但是它们存在操 作复杂，费时，成本较高等不足而使其较难实现高通量的筛选。为了克服这些缺点，不少研 宄工作者试图发展不同的检测途径，其中荧光光谱，特别是荧光共振能力转移途径，由于 其优越的灵敏度以及信号转化的多元化而成为有利的检测途径。虽然取得的一定的研宄 成果，但是时常需要双标记，成本较高并且对染料有特殊的要求。鸟苷可以与多种荧光染 料例如焚光素，香豆素，花，罗丹明等，发生光诱导电子转移（photoinducedelectron transfer，PIET)过程，结果表现为染料的荧光被猝灭。在此过程中，这些染料以它们的电 子激发态作为电子受体，而鸟苷则扮演电子给体的作用。相对于FRET途径，其不需要标记 特异性的染料，成本低廉，操作过程简单。目前为止，利用G碱基作为猝灭剂的分析已广泛 应用于检测特定蛋白、DNA/RNA、金属离子和小分子、以及发生在寡核苷酸中点突变的检测， 但是还没有报道将其应用于高通量的药物筛选方面。
[0005] 每一个筛选模型由于自身分析技术的局限性和操作影响，都会造成数据波动误 差。一般而言，系统越稳定，数据的波动性越小可靠性也越高。相反，则系统的可靠性低，不 适用高通量药物筛选。Z因子是一个用于判断筛选模型稳定性的统计学参数，其公式为：
[0006]
[0007] 如果Z因子小于0. 5,则说明分析条件还需要进一步优化，或者该检测形式无法得 到有效的数据。如果Z因子大于等于0. 5,说明系统有良好的稳定性，适用于高通量筛选。
[0008] 此本发明基于PIET用G碱基代替荧光猝灭基团，利用探针分子与药物直接作用后 发生构型转换所引起的信号变化，设计了响应快速、低成本的高通量筛选G-四链体配体的 方法，可以简单、快速并有效的来筛选抗肿瘤药物。
【发明内容】
[0009] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种普适性强、成本低、易于推广能够 实现高通量快速筛选的基于光诱导电子转移筛选G-四链体配体的方法。
[0010] 本发明实现上述目的所采用的技术方案是由以下步骤组成：
[0011] ⑴将发夹型DNA用20mmol/LpH= 7. 4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液配 制浓度为100ymol/L的发夹型DNA溶液，放于4°C以下保存；
[0012] (2)用20mmol/LpH = 7. 4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液将步骤⑴的发 夹型DNA溶液浓度从100ymol/L稀释成50nmol/L，取浓度为50nmol/L的发夹型DNA溶液 加入96孔板中，测定初始荧光强度值；
[0013] (3)在步骤⑵的基础上加入中药单体溶液使其在反应体系的最终浓度为 10ymol/L，测定加入中药单体溶液后的荧光强度值，若荧光强度值降低，说明该中药单体 诱导单链的发夹型DNA形成G-四链体结构；若否，则说明该中药单体不能诱导单链的发夹 型DNA形成G-四链体结构，根据荧光信号的变化即完成G-四链体配体的筛选。
[0014] 上述中药单体中大黄素、芦荟大黄素、木犀草素、山奈酚、黄连素、槲皮素、大黄酚、 白杨素、大豆苷元、芹菜素以及大黄酸是G-四链体配体。
[0015] 本发明的基于光诱导电子转移筛选G-四链体配体的方法，其是利用G-四链体的 配体可以诱导包含人端粒DNA片段的发夹探针形成G-四链体，使得发夹探针上标记的羧基 荧光素（FAM)堆积在由四个G碱基组成的G四分体平面上，与G碱基靠近而发生光诱导电子 转移，荧光强度降低，通过检测体系荧光强度的变化，即可实现G-四链体配体的筛选。目前 报道较多的是已经成功合成或发现的一些能够与G-四链体作用的化合物，然而关于天然 化合物与G-四链体作用的报道却较少。中药单体是天然化合物的提取物，具有来源广泛易 得、生物活性强、毒副作用低和很多都具有平面芳环结构等特点。基于上述途径，本发明对 部分中药单体进行了筛选，并且所筛选出的是G-四链体配体的中药单体的确可以抑制癌 细胞的生长。本发明具有操作简单、响应快速、普适性强、易于推广的优点，能够实现G-四 链体配体的高通量筛选，而且其成本较低，方法可靠，所用试剂廉价，为筛选以G-四链体为 靶点的抗肿瘤药物提供了一种简单、有效的途径。
【附图说明】
[0016] 图1为发夹型DNA与10ym〇l/L的大黄素（Emodin)作用前后的荧光光谱对比图。
[0017] 图2为发夹型DNA与10ym〇l/L的苦参碱（Matrine)作用前后的荧光光谱对比图。
[0018]图3为不同中药单体作用于发夹型DNA后荧光信号变化的柱状图，匕代表单独发 夹型DNA的信号，F代表加入中药单体后的荧光信号。
[0019]图4为96孔板的体系波动性对比图，实线和虚线分别代表荧光信号的平均值以及 平均值±3标准偏差SD。
[0020] 图5为四个96孔板的Z因子分析图。
[0021] 图6为发夹型DNA与大黄素（Emodin)作用的圆二色光谱图。
[0022] 图7为发夹型DNA与和苦参碱（Matrine)作用的圆二色光谱图。
[0023] 图8为利用MTT细胞凋亡实验考察不同浓度大黄素对细胞的抑制率；
[0024] 图9对应（A)结果的利用MTT细胞凋亡实验得到的颜色变化照片。
[0025] 图10用相同浓度的大黄素、白杨素、槲皮素、大豆苷元、大黄酚以及苦参碱分别对 细胞的抑制情况的柱状图。
【具体实施方式】
[0026] 现以实施例并结合实验数据和附图对本发明的技术方案进行进一步说明，但是本 发明不仅限于下述的实施情形。
[0027] 实施例1
[0028] 以大黄素、苦参碱为中药单体，基于光诱导电子转移（PIET)筛选G-四链体配体的 方法由以下步骤组成：
[0029] (1)将发夹型DNA(F-hpDNA，F-hpDNA的序列为 5'-FAM(羧基荧光素）-TAGCCCTTAG GGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCTA-3'）用20mmol/LpH= 7. 4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶 液配制浓度为100umol/L的发夹型DNA溶液，放于4°C冰箱中过夜；
[0030] (2)用20mmol/LpH= 7. 4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液将步骤⑴的发 夹型DNA溶液浓度从100ymol/L稀释成50nmol/L，取400yL浓度为50nmol/L的发夹型 DNA溶液加入96孔板的16个孔中，用荧光分光光度计测定各个孔内的初始荧光强度值
[0031] (3)向步骤⑵的8个孔中再加入1yL4mmol/L大黄素溶液，使其在反应体系中 的最终浓度为10umol/L，测定加入大黄素溶液后的荧光强度值，向另外的8个孔中加入 1yL4mmol/L苦参碱溶液，使其在反应体系中的最终浓度为10ymol/L，测定加入苦参碱 溶液后的荧光强度值12，结果参见图1和图2,ipip 12，添加了大黄素溶液之后的荧光 强度降低，添加苦参碱溶液后的荧光强度基本没有变化，由此说明大黄素能够诱导单链的 发夹型DNA形成G-四链体结构，属于G-四链体配体，而苦参碱对体系信号基本没影响，不 属于G-四链体配体，同时也说明本发明的筛选方法结果可靠、准确。<