br>[0032] 实施例2
[0033] 基于光诱导电子转移（PIET)筛选芹菜素的方法由以下步骤组成：
[0034] (1)将发夹型DNA(F-hpDNA，F-hpDNA的序列为 5'-FAM(羧基荧光素）-TAGCCCTTAG GGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCTA-3'）用20mmol/LpH= 7. 4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶 液配制浓度为100umol/L的发夹型DNA溶液，放于-20°C冰箱中保存；
[0035] (2)用20mmol/LpH=7. 4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液将步骤⑴的发 夹型DNA溶液浓度从100ymol/L稀释成50nmol/L，取200yL浓度为50nmol/L的发夹型 DNA溶液加入96孔板的8个孔中，用荧光分光光度计测定各个孔内的初始荧光强度值
[0036] (3)向步骤⑵的8个孔中再加入1yL4mmol/L芹菜素溶液，使其在反应体系中 的最终浓度为10Umol/L，测定加入芹菜素溶液后的荧光强度值，结果，添加了芹菜 素溶液之后的荧光强度降低，由此说明芹菜素能够诱导单链的发夹型DNA形成G-四链体结 构，属于G-四链体配体。
[0037] 上述实施例1、2中在步骤（1)所配制的浓度为100ymol/L的发夹型DNA溶液可 以在4°C以下、-80°C以上的任意温度保存，不仅限于上述实施例的温度条件，在步骤（3)中 还可以加芦荟大黄素、木犀草素、山奈酚、黄连素、槲皮素、大黄酚、白杨素、大豆苷元或大黄 酸来作为中药单体按照实施例1的方法进行筛选试验。
[0038] 现按照上述实施例1的方法通过检测不同的药物（即大黄素、苦参碱、秋水仙碱、 芹菜素、芦荟大黄素、木犀草素、山奈酚、黄连素、槲皮素、大黄酚、白杨素、大豆苷元和大黄 酸）加入前后，发夹型DNA(F-hpDNA)的PIET(光诱导电子转移）效率变化，来识别G-四链 体配体。PIET效率用F/匕来表示，其中F和F。分别表示存在和不存在药物的情况下FAM荧 光素的荧光强度，实验结果见图3。
[0039] 从图3中可以看出，在此实验条件下，苦参碱和秋水仙碱的信号变化幅度在5% 以内，不属于G-四链体配体，其它11种中药单体都可引起信号的明显变化，变化幅度均在 10%以上为G-四链体配体，也由此表明该方法可以用于抗肿瘤药物的有效筛选。
[0040] 为了进一步验证本发明的筛选方法的可靠性，发明人通过下述方法对体系的波动 性进行了考察验证，具体如下：
[0041] (1)同一孔板的孔与孔之间的波动性
[0042] 在96孔板中选取30个孔分别加入400yL50nmol/L的发夹型DNA溶液，用荧光 分光光度计分别测定其初始荧光强度值，然后分别加入10Umol/L的大黄素溶液，再次测 定各个孔添加大黄素之后相应的荧光强度值，考察体系波动性，结果如图4所示。
[0043] 由图4可以看出，单独的发夹型DNA(F-hpDNA)以及加入大黄素后荧光信号的变 异系数即标准差为2. 5%，平均值之比为2. 8%，由此说明同一孔板的孔与孔之间的波动较 小，可以用来相互比较。
[0044] (2) Z因子考察
[0045] 将4个96孔板分别同上述（1)中操作，分别考察Z因子，实验结果见图5。
[0046] 由图5可以看出，4个孔板的Z因子均大于0.5,并且得到其平均值为0.75,由此可 以判断每个孔板均具有较好的稳定性，可以得到有效的数据，说明体系可以用于高通量的 筛选G-四链体配体。
[0047] 为了验证本发明发夹型DNA(简称F-hpDNA)的有益效果，发明人用实施例1的发 夹型DNA进行了大量研宄实验，各种试验情况如下：
[0048] (1)圆二色谱（CD)实验
[0049]取 4yLlOOymol?rV-hpDNA于离心管中，分别取0?5yL、2. 5yL、5yL4mmol/ L的大黄素（Emodin)溶液，用20mmol/LpH= 7. 4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液 稀释至200yL，使F-hpDNA的最终浓度为2ymol/L，大黄素的最终浓度分别为10ymol/ L、50ymol/L、100ymol/L。以苦参碱做负对照实验，其最终浓度同样分别为10ymol/L、 50ymol/L、100ymol/L。用宽度为1mm的石英比色皿，以100nm/min的扫描速度，在200? 320nm的范围内扫描圆二色光谱，平行测量三次取平均值。实验结果见图6和图7,曲线a 代表单独的F-hpDNA，曲线b-d代表加入不同浓度药物的结果。
[0050] 从图6可以看出，当加入大黄素时峰位置发生了偏移，当其浓度为100 yM时，可以 看到在260nM左右有一个负峰，在290nM左右有一个正峰，说明大黄素可以诱导F-hpDNA形 成反平行四链体，从图7可以看出，苦参碱则对F-hpDNA的峰基本没有影响，说明苦参碱不 是G-四链体配体。
[0051] (2)MTT细胞增殖实验的测定
[0052]MTT分析法以活细胞代谢物还原剂 3_(4, 5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)_3, 5_di -phenytetrazoliumromide,MTT噻挫蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染 料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，生成蓝色 (或蓝紫色）不溶于水的甲臜结晶，甲臜结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥 珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的甲臜结晶可使用二甲基亚砜（DMS0)溶剂 溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度0D值，以反映出活细胞数目。首先将Hela细胞以 每孔10000的细胞个数接种在96孔板的每个孔中，当加入不同浓度的药物作用36h后，使 用磷酸盐缓冲液（PBS)清洗，加入20yLMTT(5mg/mL)作用4h后使用二甲基亚砜（DMS0) 溶解即可进行测定，实验结果见图8和9 ;当加入浓度均为50ymol/L的白杨素、大豆苷元、 大黄酚、大黄素以及苦参碱分别对HeLa细胞抑制效率进行比较，结果如图10所示。
[0053] 由图8可知，随着大黄素浓度的增加可以看到细胞的生长明显得到抑制，当其浓 度为35. 8yM时，HeLa细胞仅有50 %的存活率，当其浓度进一步增加，细胞的存活率进一 步降低；图9对应的甲臜结晶颜色的变化，由于随着药物浓度的增大，细胞的存活率逐渐降 低，细胞产生的琥珀酸脱氢酶量也逐渐减少，对应甲臜结晶颜色就越浅，从图9可以看出， 甲臜结晶颜色逐渐变浅，结果基本和图8相一致。
[0054] 由图10可知，除了苦参碱对HeLa细胞的生长基本无影响，不是G-四链体配体，而 其它药物均可不同程度的抑制HeLa细胞的生长，这些结果和荧光结果是一致的，说明了该 方法的可靠性，并且表明所筛选出来的G-四链体配体可以作为端粒酶抑制剂，抑制肿瘤细 胞增殖，杀死癌细胞，达到治愈的效果。
【主权项】
1. 一种基于光诱导电子转移筛选G-四链体配体的方法，其特征在于由以下步骤组成： (1)将发夹型DNA用20mmol/LpH =7. 4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液配制浓 度为100 y mol/L的发夹型DNA溶液，放于4°C以下保存； (2)用20mmol/LpH = 7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液将步骤（1)的发夹型 DNA溶液浓度从100ymol/L稀释成50nmol/L，取浓度为50nmol/L的发夹型DNA溶液加入 96孔板中，测定初始荧光强度值； (3) 在步骤（2)的基础上加入中药单体溶液使其在反应体系的最终浓度为10 ymol/L， 测定加入中药单体溶液后的荧光强度值，若荧光强度值降低，说明该中药单体诱导单链的 发夹型DNA形成G-四链体结构；若否，则说明该中药单体不能诱导单链的发夹型DNA形成 G-四链体结构，根据荧光信号的变化即完成G-四链体配体的筛选。
2. 根据权利要求1所述的基于光诱导电子转移筛选G-四链体配体的方法，其特征在 于：所述中药单体中大黄素、芦荟大黄素、木犀草素、山奈酚、黄连素、槲皮素、大黄酚、白杨 素、大豆苷元、芹菜素以及大黄酸是G-四链体配体。
【专利摘要】本发明涉及一种基于光诱导电子转移筛选G-四链体配体的方法，其是通过向发夹型DNA稀释液中加入一定量的中药单体溶液，检测发夹型DNA溶液在加入中药单体溶液前后的荧光强度变化，即可实现G-四链体配体的筛选，本发明充分利用G-四链体的配体可以诱导包含人端粒DNA片段的发夹探针形成G-四链体，使得发夹探针上标记的羧基荧光素(FAM)堆积在由四个G碱基组成的G四分体平面上，与G碱基靠近而发生光诱导电子转移，荧光强度降低的机理，具有操作简单、响应快速、普适性强、易于推广的优点，能够实现G-四链体配体的高通量筛选，为筛选以G-四链体为靶点的抗肿瘤药物提供了一种简单、有效的途径。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104593506
【申请号】CN201510035616
【发明人】金燕, 时志路, 张琦
【申请人】陕西师范大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月23日