一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，涉及一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合 物及其应用。
【背景技术】
[0002] 大豆炭疽病是世界各大豆产区的重要病害，普遍发生于我国东北、华北、华东、西 北、华南等重要大豆产区，据报导，黑龙江、吉林、辽宁等 16个省均有发生W。大豆炭疽病从 苗期至收获期均可发生，子叶、子茎、叶片、叶柄、茎杆、荚果及种子皆可受害。病菌在子叶上 病斑呈圆形，红褐色至黑褐色、凹陷。茎上病斑为褐色或红锈色，细条形，凹陷和龟裂。成株 期叶片上病斑主要发生于叶脉，呈多角形，红褐色至黑褐色。茎上病斑与苗期相似。荚上病 斑呈椭圆形或近圆形，边缘常隆起，中央部凹陷，潮湿时各患部斑面上出现朱红色小点或小 里占[2,3]。
[0003] 近年来，随着大豆种植面积不断扩大，大豆炭疽病的发生呈扩大蔓延、加重危害的 趋势，全国各大豆产区均有炭疽病的发生，对大豆生产造成很大威胁。为了阻止大豆炭疽病 传播范围的不断扩大，使大豆炭疽病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。
[0004] 大豆炭疽病可由多种炭疽菌侵染引起，迄今中国已报道引起大豆炭疽病的炭 疽菌有平头炭疽菌（C.truncatum)、胶孢炭疽菌（C.gloeosporioide)、辣椒炭疽病菌 (C.capsici)、黑线炭疽菌（C.dematium)和毁灭炭疽菌（C.destructivum)等[4'5]。其中，平 头炭疽菌是最为常见的病原菌之一。因此针对平头炭疽菌的分子检测我们进行了一系列的 研宄。
[0005] 平头炭疽菌（C.truncatum)是一类重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范围 均很广泛。该菌无性态分类地位是半知菌亚门、腔孢纲、黑盘孢目、黑盘孢科、炭疽菌属， 有性态则隶属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳目、球壳科、小丛壳属。该菌在PDA培养基上， 病原菌落圆形，边缘整齐，菌丝较稀疏，紧贴培养基生长，初为白色，后为浅灰色，培养过程 中菌落有扇变现象，扇变部分菌丝较发达，绒毛状。分生孢子盘黑色堆状突起，单生至丛 生，近圆形，大小变化很大，有时许多分生孢子盘连成一片；刚毛黑褐色，1?3个分隔，长 41. 76?194. 12ym;分生孢子梗无色至淡褐色；分生孢子无色，新月形，无分隔，两头钝尖， 大小（18. 82 ?26. 47)X(3. 53 ?5. 29)ym;附着胞（6. 60 ?10. 63 (8. 21))X(4. 31 ? 8. 00 (6. 47))ym，椭圆形，偶见姜瓣形[5]。
[0006] 传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特性、致病性测定等，操作繁琐，耗时长、 灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰 [6]，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断，很 难对病害发生进行及时的监测和有效控制。
[0007] 随着分子生物学的发展，分子生物学技术已逐步应用到平头炭疽菌的研宄中。上 世纪八十年代发展起来的普通PCR的方法已经成功用于检测平头炭疽菌[7]，但普通PCR是 腐故陈旧的技术且具若干缺陷，例如检测时间仍然比较长，大概6?8h，对靶基因区段的识 别位点少，检测特异性与灵敏度偏低；检测过程较繁琐等，难以满足需求。
[0008] 环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本 的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术[8]，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低 等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4 种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60?65°C范围60? 70min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀产生[9]。由于 LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是 在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大 降低。
[0009] 靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有核糖 体基因转录间隔区（Internaltranscribedspace，ITS) [1°]，然而许多学者认为该革E标不能 够在种的水平上准确的区分炭疽菌属真菌。
[0010] 本发明选用的新型革E标RNA聚合酶II大亚基（largesubunitofRNApolymerase II，Rpbl)是决定真核生物信使RNA(mRNA)转录起始和延伸的最主要的功能亚基，存在多种 翻译后修饰，如磷酸化、糖基化和泛素化。以往的研宄发现，Rpbl的泛素化修饰除参与其正 常生理状态下的蛋白质代谢外，还可促进转录过程中停滞在DNA上的Rpbl的降解，以及促 进大规模DNA损伤时的转录親联修复（TranscriptionCoupledRepair,TCR)。因此，Rpbl 的泛素化修饰通过严密调控Rpbl的活性蛋白水平，保证了转录的正常进行，并对DNA损伤 修复和保证遗传物质的稳定性、保真性有重要意义[11]。
[0011] 已知的平头炭疽菌分子检测靶标ITS不能满足LAMP引物设计的需要，现有基于普 通PCR对该病菌的分子检测技术已较落后，且具有检测耗时偏长，对靶基因区段识别位点 少，误检率偏高，检测特异性与灵敏度偏低，检测过程较繁琐等缺陷。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种检测平头炭疽菌的环介导等 温扩增引物组合物。
[0013] 本发明的另一目的是提供该引物组合物的应用。
[0014] 本发明的又一目的是提供一种检测平头炭疽菌的LAMP试剂盒。
[0015] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0016] SEQIDNO. 1所示的Rpbl基因序列作为检测靶标在检测平头炭疽菌中的应用，优 选在LAMP检测平头炭疽菌中的应用。
[0017] -种用于LAMP检测平头炭疽菌的引物组合物，由SEQIDNO. 2所示的正向外引 物Rpbl-F3，SEQIDN0.3所示的反向外引物Rpbl-B3，SEQIDN0.4所示的正向内引物 1^13141?，5￡〇10勵.5所示的反向内引物1^131-81?，5￡〇10勵.6所示的环引物1^131-1^ 组成。
[0018] 本发明所述的引物组合物在检测平头炭疽菌中的应用。
[0019] 本发明所述的引物组合物在制备平头炭疽菌检测试剂中的应用。
[0020] 一种用于检测平头炭疽菌的LAMP试剂盒，包含本发明所述的引物组合物。
[0021] 所述的LAMP试剂盒优选包含检测溶液，每毫升所述的检测溶液通过以下方法 制备得到：〇. 8yM正向内引物Rpbl-FIP、0. 8yM反向内引物Rpbl-BIP、0. 1yM正向外引 物Rpbl-F3、0. 1yM反向外引物Rpbl-B3、0. 1yM环引物Rpbl-LF、1. 4mMdNTPs、8mMMgS04、 0.8M甜菜碱、0.8MTris-HCl(pH8.8)、0.4mMKCl、0.4mM(NH4)2S04、4 %TritonX-100、 8U. DNApolymerase，加入超纯水制备成lmL检测溶液。
[0022] 所述的试剂盒还含有染料SYBRGreenI。
[0023] 一种LAMP检测平头炭疽菌的方法，包括取18yL所述的检测溶液，3yL灭菌去离 子水，加入4yL待检DNA溶液，总体积为25yL进行LAMP反应；反应程序为：62°C，70min; 扩增后加入染料SYBRGreenI作为反应指示剂，肉眼观察，以SYBRGreenI的颜色变化和 荧光强弱做为结果判定标准：在常光下，黄绿色表示检测为阳性，即有平头炭疽菌存在，橙 色表