示检测结果为阴性，即不含有平头炭疽菌，或所含平头炭疽菌未达检测限。
[0024] 本发明详述：
[0025] 1、引物的设计
[0026] 新型靶标基因的选取和引物的筛选是LAMP检测的关键因素。首先查找相关文献 选取了CHS(几丁质合成酶）、S0D2 (锰氧化物歧化酶）、GS(谷氨酰胺合成酶）、ITS(核糖体 基因转录间隔区）、EF1a(翻译延伸因子）、RPB1 (RNA聚合酶II大亚基）等可用性靶标。 以靶标CHS为例，在NCBI网站查找并下载平头炭疽菌及其相近种所含的CHS序列，然后使 用BI0EDIT软件进行序列比对，在平头炭疽菌的CHS序列中选取一段其特有的的序列作为 目标序列（200?400bp)，用Primer4在线设计引物。根据引物长度、引物自由能及GC含量 等选取合适的引物进行实验，从中筛选种内通用性好，种间特异性强，属间特异性强，灵敏 度高的引物。依次筛选其他靶标，我们经序列比对时分析发现Rpbl基因在种内不同菌株间 高度保守，种间具明显差异，最终选择Rpbl作为检测平头炭疽菌的靶标基因。再对以该靶 标基设计的多套引物进行多次试验和验证，选出一套通用性好，特异性强，灵敏度高，能快 速，准确检测出平头炭疽菌引物。
[0027] 2、引物筛选及验证过程
[0028] (1)通过通用性试验筛选检测平头炭疽菌LAMP引物
[0029] 1)以筛选能检测平头炭疽菌的LAMP引物为目的，进行以下实验：选择平头炭疽菌 标准菌株，以及来自不同地区、不同寄主的平头炭疽菌的DNA作为模板，取4y1DNA溶液， 加入18yL不同靶标设计出的LAMP引物所配制反应液进行LAMP反应，和3yL灭菌去离子 水进行LAMP反应，反应程序为：62°C70min;反应后观察反应管颜色变化，在常光下检测，含 有平头炭疽菌的样品在常光下应变为黄绿色，阴性对照在常光下为橙色。若反应结束后能 使所有含有平头炭疽菌的样品变为黄绿色，则该引物符合通用性实验要求，可继续进行下 一步筛选实验；若不能使所有含有平头炭疽菌的样品变为黄绿色，则该引物不符合实验要 求，废弃。
[0030] (2)通过特异性试验筛选检测平头炭疽菌LAMP引物
[0031] 1)以筛选能特异地检测平头炭疽菌的LAMP引物为目的，进行以下实验：选择平头 炭疽菌标准菌株，与其相近种胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌，以及其他病原真菌（大豆紫斑病 菌，米曲霉菌，链格孢菌，大豆炭腐病菌，黑附球菌，大豆南方茎溃疡病菌，大豆北方茎溃疡 病菌，大豆拟茎点种腐病菌，大豆茎褐腐病菌，大豆疫霉病菌，尖孢镰刀病菌，玉蜀黍平脐蠕 孢）的DNA作为模板，取4y1DNA溶液，加入18yL经1)筛选出的不同靶标设计出的LAMP 引物所配制反应液和3yL灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：62°C70min;反应后 观察反应管颜色变化，在常光下检测，含有平头炭疽菌的样品在常光下应变为黄绿色，而含 其他种的样品和阴性对照在常光下为橙色。若反应结束后，除平头炭疽菌为黄绿色，其他样 本为橙色，则该引物符合特异性的实验要求，可进行下一步筛选实验；否则，该引物不符合 实验要求，废弃。
[0032] (3)通过灵敏度试验筛选检测平头炭疽菌LAMP引物
[0033] 以筛选能灵敏地检测出平头炭疽菌的LAMP引物为目的，进行以下实验：选择平头 炭疽菌标准菌株，将标准平头炭疽菌菌株DNA用分光光度计测定浓度（lng/yl)后用DEPC 水进行10倍比稀释，_70°C保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液4y1 作为模板，加入18yL经2)筛选出的不同祀标设计出的LAMP引物所配制反应液和3yL灭 菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：62°C70min;反应后观察反应管颜色变化，在常光 下检测，阴性对照在常光下为橙色，记录变为黄绿色的样品的浓度，选取检测灵敏度最高的 引物。
[0034] 经过一系列实验，本发明最终采用以Rpbl为靶标基因设计的引物中的一套通用 性好，特异性强，灵敏度高，能快速，准确检测出平头炭疽菌的弓丨物，由nvitrogen(上海）公 司合成，其序列信息如下：
[0035] 表 1
[0036]
【主权项】
1. SEQ ID NO. 1所示的Rpbl基因序列作为检测靶标在检测平头炭疽菌中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于SEQ ID NO. 1所示的Rpbl基因序列作为检 测靶标在LAMP检测平头炭疽菌中的应用。
3. -种用于LAMP检测平头炭疽菌的引物组合物，其特征在于由SEQ ID N0.2所示的 正向外引物1^13143,5￡〇10勵.3所示的反向外引物1^131-83,5￡〇10勵.4所示的正向 内引物1^13141?，5￡〇10勵.5所示的反向内引物1^131-81?，5￡〇10勵.6所示的环引物 Rpbl-LF 组成。
4. 权利要求3所述的引物组合物在检测平头炭疽菌中的应用。
5. 权利要求3所述的引物组合物在制备平头炭疽菌检测试剂中的应用。
6. -种用于检测平头炭疽菌的LAMP试剂盒，其特征在于包含权利要求3所述的引物组 合物。
7.根据权利要求6所述的LAMP试剂盒，其特征在于包含检测溶液，每毫升所述的检测 溶液通过以下方法制备得到：〇. 8 yM正向内引物Rpbl-FIP、0. 8 yM反向内引物Rpbl-BIP、 0? 1 yM正向夕卜弓|物Rpbl-F3、0. 1 yM反向夕卜弓|物Rpbl-B3、0. 1 yM环弓|物Rpbl-LF、 1. 4mMdNTPs、8mMMgS04、0. 8M甜菜碱、0? 8M Tris-HCl (pH8. 8)、0? 4mM KC1、0. 4mM(NH4)2S04、 4% Triton X_100、8U. yL^Bst DNA polymerase，加入超纯水制备成lmL检测溶液。
8. 根据权利要求6或7所述的LAMP试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还含有染料SYBR Green I〇
9. 一种LAMP检测平头炭疽菌的方法，其特征在于包括取18 y L权利要求7所述的检 测溶液，3 y L灭菌去离子水，加入4 y L待检DNA溶液，总体积为25 y L进行LAMP反应；反 应程序为：62°C，70min ;扩增后加入染料SYBR Green I作为反应指示剂，肉眼观察，以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定标准：在常光下，黄绿色表示检测为阳性，即 有平头炭疽菌存在，橙色表示检测结果为阴性，即不含有平头炭疽菌，或所含平头炭疽菌未 达检测限。
【专利摘要】本发明公开了一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用。所述的引物组合物由SEQ ID NO.2所示的正向外引物Rpb1-F3，SEQ ID NO.3所示的反向外引物Rpb1-B3，SEQ ID NO.4所示的正向内引物Rpb1-FIP，SEQ ID NO.5所示的反向内引物Rpb1-BIP，SEQ ID NO.6所示的环引物Rpb1-LF组成。本发明解决了现有技术中平头炭疽菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测平头炭疽菌的问题，检测周期短(仅需70min)、特异性强、灵敏性高、可肉眼观察检测结果。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68, C12R1-645, C12Q1-04
【公开号】CN104593502
【申请号】CN201510031690
【发明人】郑小波, 田擎, 陆辰晨, 王帅帅, 张海峰, 王源超
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月21日