完全溶解，定容至2L，调PH值至7. 4,分装，高压灭菌后4°C保存备用。
[0033] (3) ? 2XHEPES溶液：281mMNaCl，lOOmMHEPES，1. 5mM似2册04用pH计精确调至 PH7. 05,过滤灭菌，少量分装后，-20°C保存，一年内有效。
[0034] 实施例lLv-PhrcK-FP635载体的构建
[0035] 为了实现对所有实验细胞进行标记，首先构建持家基因PGK(磷酸甘油酸激酶）的 启动子表达红色荧光FP635的慢病毒载体Lv-P^fFPeSS，结构图见图1。构建过程如下：
[0036] 1.中间载体pMD-19-T-pTurboFP635的构建：分别设计引物以pTurboFP635-N质 粒为模板，扩增其中所示红色荧光蛋白FP635的编码区（SEQIDNo. 1)。引物如下：
[0037]5' 上游引物：5'-ccaccggtcgccaccatggtgggtgaggatagcgtgctgatc_3'，（SEQ IDNo.2)；
[0038] 3'下游弓丨物d'-ttgtcgacgcggccgctttacttgtacgtcagctgtgccccagtttgc-3'， (SEQIDNo. 3) 〇
[0039] 在5'上游引物引入Agel酶切位点，在3'下游引物加入Sail酶切位点，用PCR进 行扩增，扩增体系为：pTurboFP635-N质粒0. 5yL，5'上游引物0. 5yL，3'下游引物0. 5yL， dNTPmix2yL，2XK0Dbuffer2.5yL，去离子水 14yL;扩增条件如下：95°C，30s;95°C， 5s，60°C，30s，68°C，lmin，共 30 个循环。
[0040] 扩增产物中继续补加rTaq酶1yL，72°C孵育lOmin，进行加A处理；最终产物进行 胶回收，并与克隆载体pMD-19-T-Simple载体进行连接，连接体系如下：PCR扩增产物3yL， pMD-19-T-Simple载体0.5yL，2X连接Buffer5yL，去离子水1.5yL;将以上混合连接 体系于16°C孵育30min，随后转化ToplO感受态细菌，培养物涂平板37°C培养过夜，挑选4 个单克隆，继续转接至5mL含100yg/mL氨苄西林的LB培养基中37°C震荡培养10h。对培 养物进行SDS碱裂解法质粒小量抽提，产物经琼脂糖凝胶电泳，取质粒大小合适的克隆，进 一步进行PCR鉴定，鉴定所用引物和条件同上述扩增方法；鉴定正确的克隆，经南京金斯瑞 公司测序正确，得到中间载体pMD-19-T-pTurboFP635。
[0041] 2.Lv-PhpGK-FPeSS载体的构建：分别将pMD-19-T-pTurboFP635 和pRRLSIN. cPPT.PGK-GFP.WPRE质粒用Agel-HF和Sall-HF进行双酶切，酶切反应体系为： pMD-19-T-pTurboFP635 或pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE3yL，AgeI-HFlyL，SalI-HF lyL，CutSmart?Buffer2yL，去离子水14yL。经37°C酶切lh后，进行琼脂糖凝胶电 泳并分别胶回收包含pTurb〇FP635基因的751bp片段以及6642bp左右载体片段，然后 将两个片段分别按照下列比例配制〇嫩连接体系印1\1也(^?635(75化口)3 1^，载体片段 (6642bp) 1yL，T4连接酶Buffer1yL，T4连接酶1yL，去离子水4yL;以上混合连接体 系于16°C孵育3h，随后转化ToplO感受态细菌，培养物涂平板30°C培养20h后，分别挑选 6个分散的单克隆，接入含100yg/mL氨苄西林的LB培养基中继续30°C震荡培养过夜；对 培养物进行SDS碱裂解法质粒小量抽提，产物经琼脂糖凝胶电泳，取质粒大小合适的克隆， 进一步进行Hindlll和BsrGI双酶切鉴定，鉴定体系如下：质粒2yL，HindIIIlyL，BsrGI 0. 5yL，NEBuffer2. 12yL，去离子水14. 5yL;将上述酶切反应体系置于37°C水浴2h后， 继续进行琼脂糖凝胶电泳。
[0042]经酶切得到正确片段（条带分别为 313bp;499bp;553bp;584bp;603bp;1490bp 和3341bp)的克隆-20°C保存，载体命名为Lv-P^fFPeSS。该载体使用细胞内持家基因 PGK(磷酸甘油酸激酶）的启动子表达红色荧光蛋白FP635,从而可以将所有感染该病毒的 细胞标记上红色荧光。
[0043] 3.病毒包装、纯化及感染：
[0044] 病毒包装实验：用含10%FBS的DMEM培养基培养293FT细胞，然后取状态较佳的 细胞于转染前24h铺于10cm2培养板中，细胞铺板浓度保证转染时细胞汇合度为70-80% ; 转染前2小时用2%FBS的DMEM培养基换液；每个培养板转染15yg1^卞_4?635载体质 粒、4ygpMDLg/pRRE、3ygpRSV-Rev和 6ygpMD2.G包装质粒，总计 28yg质粒DNA;转染 时先将上述4个质粒混匀，加入50mL，2. 5MCaCl2，并用水补齐至500mL，再逐滴加到500mL 2XHEPES中，充分混匀后，室温静置20min，逐滴加入培养板并培养12-16h，然后用含10% FBS的DMEM培养基更换培液，继续培养，最后在转染48h和72h后分别收集细胞上清用于病 毒纯化。
[0045] 病毒纯化实验：将收集的病毒上清3000rpm离心5-10min后用0.45ym过滤器过 滤，然后根据病毒上清量，按每204mL病毒上清加入21. 7mL，4mol/LNaCl，51mLPEG6000和 23. 3mLPBS;4°C，4700rpm离心30min后弃上清，沉淀用适量的PBS重悬，最后进行病毒滴度 测定，分装，_80°C保存。
[0046] 慢病毒的感染及滴定实验：感染前24h铺5X104个293FT细胞于24孔板中，细 胞计数后，换成新鲜培养基，加入终浓度为8yg/mL的Polybrene;以表达EGFP的慢病毒 pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE作为对照病毒，按梯度加1yL、2yL和5yL纯化的对照病毒， 培养10-16h后换成新鲜培养基；感染后72h，用流式细胞仪检测EGFP阳性的细胞比例。用 下列公式计算病毒的滴度（单位TU/mL):
[0047]
【主权项】
1. 用于肿瘤干细胞药物筛选的双荧光报告系统，其特征在于，所述双荧光报告系统包 括焚光报告系统I和焚光报告系统II;所述焚光报告系统I由肿瘤干细胞标记分子的基因 启动子启动表达。
2. 根据权利要求1所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述标记分子为Nanog。
3. 根据权利要求1所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述荧光报告系统II由组成 型启动子启动表达。
4. 根据权利要求1所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述荧光报告系统II由持家 基因的启动子启动表达。
5. 根据权利要求2所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述荧光报告系统II由细胞 内持家基因磷酸甘油酸激酶的启动子启动表达。
6. 根据权利要求5所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述双荧光报告系统为双荧 光报告载体，其中，焚光报告系统I和焚光报告系统II位于同一载体；所述焚光报告系统I 为绿色荧光蛋白GFP基因的编码区，所述荧光报告系统II为红色荧光蛋白FP635基因的编 码区。
7. 根据权利要求1所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述肿瘤干细胞为肝癌干细 胞。
8. 根据权利要求7所述的双荧光报告系统，其特征在于，所述肝癌干细胞为Huh7细胞。
9. 权利要求1-8任一项所述双荧光报告系统在肿瘤干细胞药物筛选中的应用。
10. 采用权利要求1所述双荧光报告系统进行肿瘤干细胞药物筛选的方法，其特征在 于，先用包含双荧光报告系统的病毒感染肿瘤细胞并进行细胞培养；待细胞生长汇合度达 到40-80%后加入药物继续培养；培养完毕后，加入细胞核染料对细胞核进行标记；根据单 独分布的散在细胞确定检测细胞的直径范围；用高内涵成像系统检测绿色荧光和红色荧光 蛋白的表达情况，通过统计单位面积内红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的表达情况评估药物 对肿瘤干细胞的杀伤效果。
【专利摘要】本发明公开了一种双荧光报告系统在肿瘤干细胞靶向性药物筛选中的应用及方法。通过使用红色和绿色荧光蛋白对群体肿瘤细胞和肿瘤干细胞分别进行标记，利用高内涵成像系统即可评估药物分别对肿瘤细胞和肿瘤干细胞的靶向性。由于目前还没有很好的靶向肿瘤干细胞的药物筛选方法，本发明建立的肿瘤干细胞筛选方法可望用于针对肿瘤干细胞进行新型抗肿瘤药物的筛选，从而提高抗肿瘤药物的筛选效果。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-02
【公开号】CN104593512
【申请号】CN201510059177
【发明人】钱程, 沈俊杰, 单娟娟
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月4日