包含靶向聚氨基酸与脂肪酸之缀合物的药物递送载剂的制作方法
【专利说明】包含靶向聚氨基酸与脂肪酸之缀合物的药物递送载剂
[0001] 本申请要求于2012年8月10日提交的标题为"DRUG DELIVERY VEHICLE"的美国 临时专利申请序列号61/682, 057的权益，其全部内容通过引用并入本文。
[0002] 关于联邦政府资助研宄的声明
[0003] 本发明部分地在内部心脏、肺和血液研宄所研宄基金（Intramural Heart，Lung， and Blood Institute Research Fund)的支持下完成。政府对本发明享有某些权利。
[0004] 背景
[0005] 本申请涉及用于使用天然亲和力向特定细胞、组织或器官类型定制药物递送 (tailored drug delivery)药剂的组合物。
[0006] 许多药物候选物因有害的副作用而不能通过药物开发渠道来推进。通常，这些问 题与被动药物递送的使用相关，这依赖于药物穿过所有细胞的生物膜时的吸收。当通过被 动药物递送向患者进行全身性施用时，许多药物将仅以低浓度到达靶细胞，而其余药物非 特异地聚集在身体其他部分中（例如在肝和血浆中的浓度较高）或者从身体中清除。这对 具有高细胞毒性潜能的药物（例如化学治疗剂）而言是特别要关注的，因为其可损害健康 细胞和患病细胞。药剂的靶向递送是高度期望的，原因是经由该机制可选择性地将精确剂 量的有效药物递送至患病细胞并完全避免或降低药物暴露于正常、健康细胞和组织的量。
[0007] 已开发出了不同类型的药物递送载剂，例如聚合物胶束、聚合物纳米载剂、脂质 体、聚合物囊泡（polymersome)、纳米球、纳米胶囊、树状聚合物、蛋白质、细胞血影（cell ghost)、无机/金属递送载剂和细菌递送载剂（Alexis等，2010 ;Matsumura和Kataoka 2009 ;Wang等，2009)。这样的方法中有许多都需要使用生产起来可能较昂贵的大蛋白质。 此外，许多目前所采用的药物递送载剂无法解决所使用药物同时影响健康细胞和组织的问 题。
[0008] 理想地，祀向药物递送载剂（targeted drug delivery vehicle)应特异性地作用 于目标患病细胞，同时避免对健康细胞的毒副作用。此外，递送剂应在很大程度上是非免疫 原性的，在血液中具有长期的残留时间并且是可生物降解的。此外，整个系统应适合于解决 范围广泛的疾病并且适合于按比例放大并在商业规模水平上制造。
[0009] 本发明提供了药物递送组合物、制造方法和用于治疗性应用的治疗方法，所述治 疗性应用可克服当前在药物开发中所出现的多个挑战。
[0010] 发明概述
[0011] 本申请涉及使用天然亲和力向特定细胞、组织或器官类型定制药物递送药剂的组 合物。
[0012] 在一些实施方案中，本发明提供了包含与生物相容性聚合物结合的靶向性氨基酸 链的组合物。在一些实施方案中，所述组合物可提高药物的溶解度。在一些实施方案中，所 述生物相容性聚合物是脂肪酸。在一些实施方案中，所述脂肪酸是饱和脂肪酸。在一些实 施方案中，所述脂肪酸是长度小于15个碳的脂肪酸链。在一些实施方案中，生物相容性聚 合物是肉豆蔻酸。在一些实施方案中，所述靶向性氨基酸链与所述生物相容性聚合物共价 连接。
[0013] 在一些实施方案中，所述靶向性氨基酸链的长度小于50个氨基酸。在一些实施方 案中，所述靶向性氨基酸链对跨膜分子具有亲和力。在一些实施方案中，所述靶向性氨基酸 链对受体具有亲和力。在一些实施方案中，所述靶向性氨基酸链对HDL受体具有亲和力。在 一些实施方案中，所述靶向性氨基酸链对迅速分裂的细胞具有亲和力。在一些实施方案中， 所述靶向性氨基酸链对癌细胞具有亲和力。在一些实施方案中，所述靶向性氨基酸链选自 SEQ ID NO :1 至 62。
[0014] 通过引用并入
[0015] 本说明书中所提及的所有公开、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度如 同具体地且单独地指明每个单独的公开、专利或专利申请通过引用并入。
[0016] 附图简述
[0017] 所附权利要求书中特别地陈述本发明的一些新颖特征。通过参照以下陈述示例性 实施方案的详细描述将获得对本发明特征和优点的更好理解，其中使用了本发明的原理， 并且其附图为：
[0018] 图1示出了拉马钱德兰（Ramachandran)图（Ιφ,ψΙ ),其举例说明了用于定义α 螺旋确认的φ和φ骨架二面角的定义。
[0019] 图2示出了说明基本为球形的包含化疗剂紫杉醇的药物递送载剂的透射电子显 微镜图像，其平均直径为约20nm。
[0020] 图3示出了载药（drug-loaded)载剂相较于常规被动药物递送的比较性体外溶出 研宄，其使用动态透析技术在37°C下于PBS中来确定体外释放。载剂中装载的药物在72 小时孵育后维持初始浓度的92%。对于被动药物递送，在孵育8小时中释放了初始浓度的 70%〇
[0021] 图4示出了载药载剂相较于常规被动药物递送的剂量响应比较研宄，该研宄确定 卵巢细胞癌模型SK0V-3(HTB-77)中戊柔比星（N-三氟乙酰阿霉素-14-戊酸酯）的半数最 大抑制（IC 5tl)浓度值。载剂递送药物的IC5tl小于6 μ g而被动药物递送的IC 5(|大于12 μ g， 这说明载剂递送的细胞毒性相比于被动药物递送提高了 2倍。
[0022] 图5不出了在癌细胞系（PC-3前列腺癌细胞系和SK0V-3卵巢癌细胞系）和非恶 性肿瘤细胞系（PZ-HPV和Hi0180)上，载药载剂相较于常规被动药物递送的比较性细胞毒 性研宄。在将药物戊柔比星并入rHDL纳米颗粒中时，体外治疗指数由此提高了至少80倍。
[0023] 图6(A)示出了药物装载能力研宄，（B)示出了药物装载效率研宄，其均采用包含 提高浓度的SEQ ID NO :20-myr组分的载剂。
[0024] 图7示出了药物递送载剂与被动药物递送的比较药代动力学特征研宄。
[0025] 图8示出了基于3H-紫杉醇测量的紫杉醇包封入肉豆蔻肽纳米颗粒中的包封效 率。
[0026] 图9示出了药物递送载剂和被动药物递送的治疗指数研宄。
[0027] 图10示出了通过药物递送载剂和提高量的HDL进行的HDL受体的竞争性研宄。
[0028] 定义
[0029] 术语"治疗（treat、treating或treatment) "是指成功治疗或缓解损伤、病理状 况、病症或症状（例如疼痛）的任意指标，其包括任意的客观或主观参数，例如减退；缓解； 减少症状或使得症状、损伤、病理状况或病症对于患者更加可耐受；降低症状或病症的频率 或持续时间；或者，在一些情况下，防止症状或病症的发作。症状的治疗或缓解可基于任意 客观或主观参数，包括例如体检结果。
[0030] 术语"施用"是指向对象经口施用，作为栓剂施用，表面接触，肠胃外、静脉内、腹膜 内、肌内、病灶内、鼻内或皮下施用，鞘内施用、淋巴内、微滴吸入或缓释装置（例如微型渗 透泵）植入。
[0031] 术语"治疗有效量或剂量"或者"治疗足够量或剂量"或者"有效或足够量或剂量" 是指对所施用对象产生治疗效果的剂量。在致敏细胞中，治疗有效剂量通常可低于对于非 致敏细胞的常规治疗有效剂量。
[0032] 术语"试剂"或"生物活性剂"是指生物、药物或化合物。非限制性实例包括简单 或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生 物、碳水化合物、毒素或化学治疗化合物。可合成多种化合物如小分子和寡聚体（例如寡肽 和寡核苷酸），以及基于多种核心结构的合成有机化合物。此外，多种天然来源可提供用于 筛选的化合物，例如植物或动物提取物等。本领域技术人员可容易地认识到对于本发明试 剂的结构性质没有限制。
[0033] 术语"前药"意指无活性或活性低于初始结构的施用于患者（例如人）的任何形 式的药物（或化合物）。前药可通过新陈代谢转化为活性形式。前药向活性形式的所述转 化并不特别限于施用后发生的前药的任何化学和/或物理改变，例如前药的活性部分（特 别是细胞生长抑制剂）在作用部位释放。
[0034] 术语"亲和结合"是指在这样的成对物质（例如酶/底物、受体/激动剂、抗体/抗 原和凝集素/碳水化合物）之间发生的结合，其可通过共价或非共价相互作用或共价和非 共价相互作用的组合来介导。当两个物质的相互作用产生非共价结合的复合物时，所发生 的结合通常为静电、氢键或亲脂相互作用的结果。
[0035] 术语"两亲性化合物"是指具有疏水部分和亲水部分二者的化合物。例如，本发明 的两亲性化合物可具有化合物的一个亲水面和化合物的一个疏水面。两亲性分子具有亲水 头基和疏水尾基，其中疏水基和亲水基通过共价键或通过不同长度的接头基团而连接。
[0036] 术语"对象"、"个体"或"患者"在本文中可互换使用，其是指脊椎动物，优选哺乳 动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于：鼠、猿、人、畜养动物、竞技动物和宠物。在体外获 得或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代也涵盖其中。
[0037] 术语"体内"是指在对象或动物体内发生的事件。
[0038] 术语"体外"是指在对象或动物体外发生的事件。例如，体外测定涵盖在对象测定 之外进行的任何测定。体外测定涵盖其中采用活细胞或死亡细胞的基于细胞的测定。体外 测定还涵盖了其中未采用完整细胞的无细胞测定。
[0039] 术语"靶向分子"是指能够特异性地与特定靶标结合并形成结合复合物的所有分 子。例如，配体及其相应的靶分子抗体构成特异性结合对，在通过其相应的亲和结合位点结 合在一起时形成复合物。
[0040] 术语"cmax "是指施用后药物的峰值血浆浓度。
[0041] 术语"Tmax "是指施用后达到药物的峰值血浆浓度所花费的时间长度。
[0042] 术语"AUC"是指曲线下面积，并且指示在单次剂量后或在施用药物后的稳态时浓 度-时间曲线的积分。
[0043] 发明详述
[0044] 本文中，提供了利用天然亲和力向特定细胞、组织或器官类型定制药物递送药剂 的组合物，用于商业规模制造的高效方法以及在广泛范围的治疗学和疾病中用于治疗的方 法。
[0045] 靶向性氨基酸链
[0046] 本发明提供了靶向药物递送载剂，其包含由靶向性氨基酸链构成的聚氨基酸组合 物。靶向性氨基酸链一般对靶标或靶标相关分子具有亲和力，进而将有助于靶向药物递送 载剂找到靶标、与其结合或以其他方式与其相互作用。这样的靶向可用于将药物递送至靶 标。
[0047] 靶向性氨基酸链可与天然全长蛋白质具有同源性。例如，靶向性氨基酸链可以是 肽，即较大的天然蛋白质的一部分。在一些实施方案中，靶向性氨基酸链是与天然蛋白质的 一部分相同的肽。在另一些实施方案中，对肽的一部分进行的序列修饰，使序列由天然发现 的序列改变例如1%、5%、10%、20%或30%。在一些实施方案中，非天然分子包含在氨基 酸链中。
[0048] 靶向性氨基酸链可由少于50个氨基酸构成。或者，靶向性氨基酸链可由长度为约 50至40个氨基酸、约40至30个氨基酸、约30至20个氨基酸、约20至10个氨基酸或约 10至5个氨基酸构成。在一些情况下，靶向性氨基酸链大于50个氨基酸或由多个重复的靶 向性氨基酸链构成。在一些实施方案中，重复的靶向性氨基酸链具有相似或相同的组成。
[0049] 本发明的靶向性氨基酸链或任意酸在某些应用中可由天然或非天然氨基酸残基 构成。此外，靶向性氨基酸链可来源于天然或非天然氨基酸残基的组合。例如，靶向性氨基 酸链可具有本质上部分或完全为天然非氨基酸的骨架，但是可包含与该靶向性氨基酸链所 模拟的氨基酸链上存在的氨基酸残基侧基相同的侧基。多种类型的化学键（例如酯、硫酯、 硫代酰胺、逆酰胺（retroamide)、经还原羰基、二亚甲基和酮亚甲基键）一般是可用于抗蛋 白酶靶向分子的构建中氨基酸链键的替代物。
[0050] 靶向性氨基酸链可包含一个或更多个α螺旋（a-helix)，例如靶向性氨基酸链 可包含两个α -螺旋。α螺旋以右转卷曲或螺旋构象为特征而确认，其中每一骨架N-H基 团向在前的氨基酸四个残基的骨架C=O基团提供氢键。在蛋白质中观察到的螺旋可以是 四个至大于四十个氨基酸残基长。
[0051] 包含α-螺旋的氨基酸残基通常采用约（-60°，-45° )的骨架（φ, Ψ)二面角。 可使用几种计算方法来鉴定α-螺旋结构，一种方法是蛋白质二级结构字典（Dictionary of Protein Secondary Structure)。α -螺旋采用二面角使得一个残基的Φ二面角和下 一个残基的Φ二面角总和为约-105°。因此，一般来说，α-螺旋二面角落在拉马钱德兰 (Ramachandran)图或（ [φ,ψ】图）图表（斜率为-1)的对角线上，范围为（-90°，-15° ) 至（-37°，-70° )。作为比较，310螺旋的二面角总和为约-75°，而JT-螺旋为约-130°。 具有反式异构体的任意氨基酸链螺旋每个残基的旋转角D(Omega)的通式由以下公式来 确定：3 cos0=l-4 cos2 [(φ+ ψ)/2|。
[0052] 存在多种技术可用于构建这样的靶向性氨基酸链，其与相应的天然肽具有相同 的、相似的或提高的生物亲和力。可构建氨基酸链以表现出与相应天然肽不同或得到改善 的一种或更多种期望活性。例如，可将氨基酸链开发为具有改善的溶解度、稳定性、脂质相 互作用和/或对水解或蛋白质水解的敏感性（Morgan和Gainor，Ann. Rep. Med. Chem. 24 : 243-252,1989)的特征或者增强其治疗性应用的另一些特征，例如提高的细胞渗透性、对结 合配偶体更大的亲和力和/或亲合力、和/或在细胞内延长的半衰期。
[0053] 氨基酸根据其侧链大体分为以下几类：极性的、疏水的、酸性的、碱性的和芳香族 的。极性氨基酸包括但不限于天冬酰胺、细胞因子、谷氨酰胺、组胺、硒代半胱氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、色氨酸和酪氨酸。疏水氨基酸或非极性氨基酸的实例包括但不限于亮氨酸、异亮氨 酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸。碱性氨基酸残基的实例包括但 不限于精氨酸、高赖氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸残基的实例包括但不限于天冬氨酸和谷氨 酸。芳香族氨基酸包括但不限于联苯丙氨酸、组氨酸、2-萘基丙氨酸、五氟苯丙氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸和酪氨酸。一些氨基酸被归类在多于一个组中，例如组氨酸、色氨酸和酪氨酸被 归类为极性和芳香族氨基酸二者。这些类别中另外的氨基酸是已知的。
[0054] 不同的氨基酸序列具有形成α -螺旋结构的不同倾向。氨基酸甲硫氨酸、丙氨酸、 亮氨酸、不带电的谷氨酸和赖氨酸具有尤其高的螺旋形成倾向，而脯氨酸和甘氨酸具有较 差的螺旋形成倾向。氨基酸脯氨酸可破坏螺旋结构，原因在于其侧链在空间上干扰前一回 转的骨架，迫使螺旋轴弯曲。然而，脯氨酸通常被视为螺旋的第一残基，这可能是由于其结 构刚性。在另一个极端下，几乎不含侧链的甘氨酸也倾向于破坏螺旋结构，原因是其较高的 构象灵活性使其在采取相对受限的α-螺旋结构时具有较大的熵代价。
[0055] 例如，氨基酸链的螺旋构象可受靶标位置处分子的电荷和疏水性以及其中已被取 代的侧链体积（或大小）二者影响。预期在氨基酸链的物理性质和构象中产生最大变化的 氨基酸替换可以是，例如，如果用亲水残基（例如丝氨酰基或苏氨酰基）替换疏水残基（例 如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基基、缬氨酰基或丙氨酰基）。另一个实例是用具有较大 侧链的氨基酸（例如苯丙氨酸）替换缺少侧链的氨基酸（例如甘氨酸）。
[0056] 靶向性氨基酸链的合适替换包括但不限于：β -丙氨酸和另一些ω-氨基酸（例 如3-氨基丙酸、2, 3-二氨基丙酸、4-氨基丁酸等）、α -氨基异丁酸、ε -氨基己酸、δ -氨 基戊酸、N-甲基甘氨酸或肌氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基 异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨 酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1，2, 3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、β -2-噻吩丙氨 酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2,4_二氨基丁酸、2, 3-二氨基丁酸、对氨基 苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高苯丙氨酸、高丝氨酸、羟脯氨酸、高脯氨酸、N-甲 基化氨基酸和类肽（Ν取代的甘氨酸）。
[0057] 靶向性氨基酸链可具有两亲性质。靶向性氨基酸链可在α螺旋（a -helix)的一 侧上具有亲水性质并且在α螺旋的相对侧上具有疏水性质。
[0058] α螺旋的两亲性程度可通过计算每个两亲性α-螺旋结构域的疏水矩（μΗ)来 量化。Eisenberg 等，Faraday Symp. Chem. Soc. 17 :109_120,1982 ;Eisenberg 等，PNAS 81 : 140-144,1984 ;以及 Eisenberg 等，J. Mol. Biol. 179 :125-142,1984 中描述了用于计算 μ H 的方法。不同长度的多种氨基酸链的两亲性可直接通过平均疏水矩来比较。平均疏水矩/ 残基可通过用μΗ除以氨基酸链中残基的数目来获得。
[0059] 靶向性氨基酸链允许定制制造用于靶向特定靶标（例如与疾病相关的特定细胞 组织或器官）的序列。一般地，其使用蛋白质化学方法来实现，以改变或设计靶向性氨基酸 链，使得其对靶标具有亲和力。
[0060] 靶向性氨基酸链可通过自动引导（homing)至与其具有亲和力的靶标而向身体内 的特定细胞、组织或器官类型行进并与之结合。靶向性氨基酸链可例如通过使用组织特异 性细胞表面分子作为模型模板来创建合成靶向性氨基酸链而进行设计。可用作靶向性氨基 酸链分子模型的合适分子的实例包括但不限于抗体、抗体片段、肽、淋巴因子、细胞因子、受 体蛋白、激素、生长因子、配体、糖、碳水化合物、跨膜蛋白或其等同物。