一种磁靶向纳米钻石药物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及靶向纳米药物，具体涉及一种纳米钻石表面修饰后负载磁性四氧化三铁和化疗药物阿霉素的磁靶向纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]如今，癌症已成为人类健康的第二大杀手，其仅次于心血管疾病。恶性肿瘤的生存率很低，其中最主要的原因是肿瘤患者发现病情时已是中、晚期，错过了手术和放、化疗的最佳治愈时间。除此之外，传统的化疗药物缺乏药理单一性，对正常组织细胞毒副作用很大，这也是导致癌症治疗效率低的主要原因。由此可见，提高肿瘤治疗效果的有效途径是早期诊断，革G向治疗。
[0003]近年来大多关注都放在碳基纳米材料上，如碳纳米管，量子点等。但是，这些纳米材料生物相容性差和具有低毒性，严重影响了其作为载药载体。其纳米钻石因其优异的光化学性质、良好的生物相容性、低毒性和表面易被修饰等特点引起了公众的关注。此外磁性四氧化三铁纳米颗粒也由于其对人体的低毒性即可以通过正常的铁代谢生化途径被细胞再利用或循环和突出的磁性即可作为磁靶向，且易于修饰特点，成为新型材料研究的热点。
[0004]鉴于此，我们将纳米钻石作为载体，将其表面修饰后负载磁性Fe3O4纳米粒子和阿霉素后，形成一种磁靶向纳米钻石药物体系，并研究其在外加磁场作用下，在体外对肿瘤细胞活性、凋亡等的影响和在体内的磁靶向抑制肿瘤效果。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种磁靶向纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0006]本发明提供的一种纳米钻石表面修饰负载磁性Fe3O4纳米粒子和阿霉素的复合药物的制备方法，包括如下步骤:
[0007](I)按 n(Fe2+):n(Fe3+) = l:2 的 FeCl2.4出0 和 FeCl3.6H2O 混合溶液中，加入物质的量为0.1-1倍的!!(Fe2+)的二水合柠檬酸钠溶液;在剧烈搅拌下，用0.1M NaOH调节溶液pH =11，并持续搅拌30min ；然后将混合溶液在80 °C油浴中反应2h，沉淀用去离子水洗涤到中性，然后干燥得到羧基化的磁性Fe3O4纳米颗粒；
[0008](2)将干燥的羧基化的磁性Fe3O4颗粒，按每Img羧基化的磁性Fe3O4颗粒加入1-1.5mL浓度为0.1Μ、ρΗ5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每Img羧基化的磁性Fe3O4颗粒中加入8mg EDC与12mg NHS，室温搅拌反应6h，再加入420μ1 (lmg/ml)聚赖氨酸(PLL)溶液，剧烈搅拌反应6h，用去离子水洗涤若干次，至上清液无色为止，干燥得到磁性Fe3O4-PLL纳米颗粒；
[0009](3)称取干燥的羧基化的纳米钻石ND，按每Img羧基化的纳米钻石加入1-1.5mL浓度为0.1Μ、ρΗ5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每Img羧基化的纳米钻石中加入0.2mg EDC与0.3mg NHS，室温搅拌反应6h，然后以15000rpm离心5min，弃去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；
[0010](4)称取干燥的磁性Fe3O4-PLL纳米颗粒，按每Img磁性Fe3O4-PLL纳米颗粒，加入1-1.5mL的roS(pH 7.4)溶液，超声分散，接着按Fe3O4-PLL与ND质量比为1:1-9加入活化好的ND，剧烈搅拌反应6h;用去离子水洗涤3次，干燥，得到磁性Fe3O4-PLL-ND纳米颗粒；
[0011 ] (5)称取干燥的磁性Fe3O4-PLL-ND纳米颗粒，按每Img磁性Fe3O4-PLL-ND纳米颗粒加入l-1.5mL BBS (pH 8.0)溶液，超声分散，接着按每Img磁性Fe3OfPLL-ND加入10yg D0X,室温摇匀反应3h，然后以15000rpm离心5min，用BBS洗至上清液无色，得到磁靶向纳米钻石药物 Fe3O4-PLL-ND-DOX。
[0012]所述步骤(1)中恥3(^.2出0的加入量为11收2+)的0.1倍。
[0013]所述步骤⑷中Fe3O4-PLL与ND质量比为1:1。
[0014]与现有技术相比本发明的有益效果:本发明制得的纳米复合药物体系集磁性与荧光于一体，既具有磁靶向性，在体内外又易于检测。在体外，通过与人宫颈癌细胞(HeLa)作用，表明磁性纳米钻石载体Fe3O4-PLL-ND具有生物相容性;在外加磁场作用下，将Fe3O4-PLL-ND-DOX经流式细胞仪检测细胞凋亡实验表明，其药效强于单独阿霉素D0X;在体内，通过活体成像仪检测，Fe3O4-PLL-ND-DOX药物具有磁靶向性。
【附图说明】
[0015]图1用X射线衍射仪测得磁靶向纳米钻石药物载体的XRD图
[0016]AiFe3O4 B:Fe3OrPLL CiFe3O4-PLL-ND D:ND
[0017]图2用磁共振强度计测得磁靶向纳米钻石药物载体的VSM图
[0018]AiFe3O4 B:Fe3OrPLL CiFe3O4-PLL-ND D:ND
[0019]图3不同pH环境下Fe3O4-PLL-ND-DOX的体外释药曲线
[0020]图4 Fe3O4-PLL-ND-DOX与对照作用于细胞48h的细胞形态图
[0021]A:空白对照组 B:Fe3O4-PLL-ND 组C:DOX组 D:Fe3OfPLL-ND-DOX组E:Fe3OfPLL-ND-DOX+Magnet组
[0022]图5各实验组不同处理时间对细胞凋亡影响的柱状图
[0023]图6 Fe3O4-PLL-ND-DOX体内实验图及注射药Oh、3h、7h、24h活体成像图
[0024]图7Fe3O4-PLL-ND-DOX对小鼠各器官及肿瘤的荧光强度对比图
[0025]图8Fe3O4-PLL-ND-DOX对小鼠各器官及肿瘤的平均荧光强度柱形图
【具体实施方式】
[0026]以下为实施例中使用的材料
[0027]FeCb.4H20(Mw= 198.71 ,Aladdin Chemistry C0.Ltd)
[0028]FeCb.6H20(Mw = 270.29,Aladdin Chemistry C0.Ltd)
[0029]纳米钻石(ND，元素六，直径大约140nm, Ireland)
[0030]阿霉素(DOX，分子量543.52，山西普德药业有限公司)
[0031]实施例1:
[0032](I)磁性Fe304纳米颗粒的制备
[0033]准确称取0.1987gFeCl2.4H20和0.5406g FeCl3.6H2O，溶于10ml去离子水中，加入1.0ml0.1M的柠檬酸钠溶液混合均匀，剧烈搅拌下用0.1M NaOH调节溶液，使其pH= 11，并持续搅拌30min，然后将混合溶液在80°C油浴中反应2h，得到沉淀，抽滤后，用去离子水洗涤5
次后，真空干燥备用。
[0034](2)磁性Fe3OfPLL纳米颗粒的制备
[0035]准确称取磁性3mg Fe3O4溶于3ml MES(0.1Μ)ρΗ5.8缓冲溶液中，超声分散；称1mgNHS，9mg EDC加入上述溶液中，超声分散30min，加入420ul (lyg/μ? )PLL，摇匀反应6h，用去离子水洗涤3次，真空干燥备用。
[0036](3)磁性Fe3OfPLL-ND纳米颗粒的制备
[0037]准确称取4mg表面羧基化的ND，用0.7668mg EDC和1.1509mg NHS活化30min;准确称取4mg磁性Fe3O4-PLL纳米颗粒，加入到4ml PBS(pH7.4)缓冲溶液中，超声分散。然后将活化好的ND离心后加入到含分散好的磁性Fe3O4-PLL的PBS溶液中，反应过夜。用去离子水洗涤3次，真空干燥备用。
[0038](4)磁靶向纳米钻石药物体系Fe3O4-PLL-ND-DOX的制备
[0039]准确称取Img Fe3OfPLL-ND纳米颗粒，加入Iml BBS (pH 8.0)的缓冲溶液，超声分散，然后加入50ml 2ygAU的DOX溶液，然后摇匀仪避光反应3h。离心，BBS(pH8.0)洗，直至上清液为无色，收集沉淀物，真空干燥即可。
[0040]实施例2:
[0041 ] ⑴磁性Fe304纳米颗粒的制备
[0042]准确称取0.1987gFeCl2.4H20和0.5406g FeCl3.6H2O，溶于10ml去离子水中，加入5.0ml0.1M的柠檬酸钠溶液混合均匀，剧烈搅拌下用0.1M NaOH调节溶液，使其pH= 11，并持续搅拌30min，然后将混合溶液在80°C油浴中反应2h，得到沉淀，抽滤后，用去离子水洗涤5次后，真空干燥备用。
[0043](2)-(4)的步骤，同实施案例I。
[0044]实施例3
[0045](I)磁性Fe3O4纳米颗粒的制备
[0046]准确称取0.1987gFeCl2.4H20和0.5406g FeCl3.6H2O，溶于10ml去离子水中，加入
10.0ml0.1M的柠檬酸钠溶液混合均匀，剧烈搅拌下用0.1M NaOH调节溶液，使其pH= 11，并持续搅拌30min，然后将混合溶液在80 V油浴中反应2h，得到沉淀，抽滤后，用去离子水洗涤5次后，真空干燥备用。
[0047](2)-(4)的步骤，同实施案例I。
[0048]实施例4
[0049]细胞形态法检测磁性纳米材料的细胞毒性
[0050]为了观察纳米载体Fe3O4-PLL-ND和纳米药物Fe3O4-PLL-ND-DOX未加磁场Fe3O4-PLL-ND-DOX+Magnet(加磁场)对HeLa细胞的影响，本实验采用倒置显微镜对不同处理组的细胞形态进行观察，并拍照记录。在五个35mm培养皿中接种生长状态良好的细胞，密度为
1.5 X 15/盘，待细胞完全贴壁后，依次向培养皿中加入Fe3O4-PLL-ND、Fe304-PLL-ND-D0X、Fe304-PLL-ND-D0X+Magnet 和 DOX，使药物 DOX 的终浓度为 5yg/mL，取 Fe3O4-PLL-ND 的量与含相应DOX的Fe3O4-PLL-ND-DOX的量一致，以未做任何处理的细胞作为对照。培养48h后，弃除旧培养液后用PBS清洗两次，最后悬于Iml PBS缓冲溶液中，观察各组细胞形态和数量变化，拍照记录。
[0051 ]图4A为正常细胞，可以看出未经处理的HeLa细胞大小均一、状态饱满透亮、排列紧密，生长状态良好；图4B为纳米载体，其HeLa细胞与A相比，基本无明显差异，由此可看出纳米载体对细胞无毒副作用。与此相比，药物处理组C，D，E三组的细胞生长明显受到影响，其中单独DOX处理后的细胞轮廓模糊、数量大幅减少，这与DOX可直接作用于DNA，插入DNA的双螺旋链，使其解开，改变DNA的模板性质，抑制DNA聚合酶，从而既可以抑ffjijDNA，又可以抑制RNA的合成的药理作用一致；
[0052]实施例5
[0053]纳米药物Fe3O4-PLL-ND-DOX诱导细胞凋亡实验
[0054]为了研究有无外加磁场作用下，Fe3O4-PLL-ND-DOX对细胞凋亡的诱导情况，本文设计了三个不同培养时间对其诱导HeLa细胞凋亡的情况进行定量检测。同样，将对数生长期的HeLa细胞以2.0 XlOVdish的密度接种于35mm培养皿中，细胞贴壁后分别用D0X、Fe304_PLL-ND、Fe304-PLL-M)-D0X、Fe304-PLL-ND-D0X+Magnet 进行处理(各组药物剂量同3.2.6.1),平行设置三组，分别培养24h、36h、48h后，弃去旧液，PBS洗涤3次，用无EDTA的胰蛋白酶将贴壁细胞解离后收集于新鲜培养液中，上机前用PBS洗涤，然后加入含Ca2+的缓冲溶液(Binding buffer)，再向其中加入新鲜配制的双染料(PI+Annexin-V)染色20min，上机测试。
[0055]图5表示不同处理时间的各实验组细胞凋亡的情况，均以未做任何处理的HeLa细胞作为对照。由图可发现，随着时间的延长，纳米载体Fe3O4-PLL-ND处理组的细胞凋亡与对照组相差不大，说明材料具有良好的生物相容性；而纳米药物Fe3O4-PLL-ND-DOX和Fe3O4-PLL-ND-DOX+Magnet和游离DOX与细胞作用均能诱导细胞凋亡，SAMtFe3OfPLL-ND-DOX+Magnet组对细胞的杀伤力已经超过游离DOX的效果，这一现象表明我们所制备的磁靶向纳米钻石药物在24h内对肿瘤细胞的抑制作用很强，时间延长后，与单独DOX效果差不多，无明显的优越性。
[0056]实施例6
[0057]磁靶向纳米钻石药物体内靶向效应
[0058]所有的动物实验，按照中国辐射防护研究院药物安全评价中心(生产许可证号:SYXK(晋)2013-0002)的协议进行的。取8_9周龄雄性裸鼠，体重约20克，由军事医学科学院动物实验室提供(北京)。
[0059](I)裸鼠移植性人宫颈癌(HeLa)细胞的接种
[0060](a)接种量:细胞悬液调整为1.0XlOVmL人宫颈癌(HeLa)细胞，接种量为0.1mL/鼠，接种于右腋部皮下(每只动物的接种量为1.0X 15)
[0061 ] (b)给药方法及剂量:接种后1天通过腹腔注射给药，取实施例1制得的Fe3O4-PLL-ND-DOX给予小鼠注射2mg含150yg DOX。此后，将永磁铁置于小鼠肿瘤部位，Oh、3h、7h、24h，进行活体成像(图6)，直到24h后，对小鼠进行安乐死。然后进行解剖，取肾、脾、心脏、肝、肺和肿瘤，观察肿瘤及各器官的荧光差异(图7)，由图7可见小鼠的肾、心和脾并无荧光，而肝、肺和肿瘤均发荧光，从图8各器官和肿瘤的平均荧光强度可知，肾、心和脾平均荧光强度值为0，而肝、肺和肿瘤平均荧光强度值分别为16、85、408，可见肿瘤荧光强度明显强于肝和脾，说明我们的药物体系在外加磁场作用下具有靶向性，这与前期凋亡实验的结果也相吻入口 O
【主权项】
1.一种磁靶向纳米钻石药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)按n(Fe2+):n(Fe3+)= l:2的FeCl2.4H20和FeCl3.6H20混合溶液中，加入物质的量为0.1-1倍的!!(Fe2+)的二水合柠檬酸钠溶液;在剧烈搅拌下，用0.1M NaOH调节溶液pH= 11，并持续搅拌30min ；然后将混合溶液在80 °C油浴中反应2h，沉淀用去离子水洗涤到中性，然后干燥得到羧基化的磁性Fe304纳米颗粒； (2)将干燥的羧基化的磁性Fe3O4颗粒，按每Img羧基化的磁性Fe3O4颗粒加入I_1.5mL浓度为0.1Μ、ρΗ5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每Img羧基化的磁性Fe3O4颗粒中加入8mg EDC与12mg NHS，室温搅拌反应6h，再加入420μ1浓度为lmg/ml的聚赖氨酸溶液，剧烈搅拌反应6h，用去离子水洗涤若干次，至上清液无色为止，干燥得到磁性Fe304_PLL纳米颗粒； (3)称取干燥的羧基化的纳米钻石ND，按每Img羧基化的纳米钻石加入1-1.5mL浓度为0.1Μ、ρΗ5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每Img羧基化的纳米钻石中加入0.2mg EDC与0.3mg NHS，室温搅拌反应6h，然后以15000rpm离心5min，弃去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物； ⑷称取干燥的磁性Fe304_PLL纳米颗粒，按每Img磁性Fe304_PLL纳米颗粒，加入1-1.5mL的pH 7.4的PBS溶液，超声分散，接着按Fe3O4-PLL与ND质量比为1:卜9加入活化好的ND，剧烈搅拌反应6h;用去离子水洗涤3次，干燥，得到磁性Fe3O4-PLL-ND纳米颗粒； (5)称取干燥的磁性Fe3O4-PLL-ND纳米颗粒，按每Img磁性Fe3O4-PLL-ND纳米颗粒加入1-1.5mL的pH 8.0的BBS溶液，超声分散，接着按每Img磁性Fe3O4-PLL-ND加入10yg DOX，室温摇勾反应3h，然后以15000rpm离心5min，用BBS洗至上清液无色，得到磁革El向纳米钻石药物Fe3OfPLL-ND-DOX。2.如权利要求1所述的一种磁性纳米复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中恥3以12出0的加入量为11(卩62+)的0.1倍。3.如权利要求1所述的一种磁性纳米复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中Fe3O4-PLL与ND质量比为1:1。4.如权利要求1、2或3所述方法制备的磁靶向纳米钻石药物。5.如权利要求4所述的磁靶向纳米钻石药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种磁靶向纳米钻石药物及其制备方法和应用。即将羧基化的磁性Fe3O4和纳米钻石(ND)在偶联剂聚赖氨酸(PLL)的作用下，形成磁纳米钻石复合材料(Fe3O4?PLL?ND)；然后物理吸附抗癌药物阿霉素(DOX)，得到磁靶向纳米钻石药物(Fe3O4?PLL?ND?DOX)；在外加磁场作用下，将该磁靶向药物与人宫颈癌(HeLa)细胞作用，表明其能靶向抑制肿瘤增长，以荷瘤小鼠为模型，研究其在体内的磁靶向效应，表明其能靶向定位到肿瘤部位。该磁靶向纳米钻石药物可在制备磁靶向抗肿瘤药物中应用。
【IPC分类】A61K31/704, A61P35/00, A61K47/04, A61K47/34, A61K41/00
【公开号】CN105709233
【申请号】CN201610067837
【发明人】李英奇, 赵文静, 王志琴
【申请人】山西大学