专利名称：一种基于凝血酶活性的双靶向作用的嵌合多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质多肽的制备及其用途，更具体地讲，本发明涉及一种包含 HMGBl (高迁移率族蛋白1) N端氨基酸序列和Exendin-4氨基酸序列的基于凝血酶活性的双靶向作用的嵌合多肽及其应用。
背景技术：
高迁移率族蛋白l(High mobility group box 1，HMGB1)广泛分布于淋巴组织以及脑、肝、肺、心、脾、肾等组织的有核细胞中。在肝、脑组织的细胞中，HMGBl主要存在于胞浆，但在大多数其它组织细胞中则主要存在于细胞核，在进化过程中其氨基酸序列高度保守。人类HMGBl基因位于13ql2染色体上，包括5个外显子和4个内含子，编码215个氨基酸序列(SEQ ID No :1，见基因库CAG33144. 1)。HMGBl蛋白由三个独特的结构域组成 (图1)。其中，“A-box”位于N-末端，进化高度保守；“C-tail”在羧基末端，包含30个重复的天冬氨酸和谷氨酸残基，可参与调节HMGBl与DNA结合的亲和力；“B-box”位于二者之间。A-box和B-box均由3个α螺旋组成，并带有强烈的正电荷，构成HMGBl的非特异性 DNA结合区。在生理条件下，HMGBl的表达稳定在一定的基础水平上，其主要功能是作为核因子在细胞核内调节相关基因的活性，例如促进白介素-6(IL-6)基因的转录。在组织损伤或发生炎症反应时，细胞(尤其是白细胞)内HMGBl表达显著增加，除在细胞核内发挥作用外， HMGBl还被释放至细胞外，它的B-box是引起炎症反应的功能结构域，作用缓慢而持久，因此HMGBl又被称为“慢性炎症因子”。细胞释放的HMGBl促进组织晚期炎症反应的机理之一， 是通过与细胞膜上的晚期糖基化终产物(AGEs)受体RAGE结合，激活细胞内NF-ΙΛ通路，从而刺激细胞因子的产生，包括TNF-、IL-I、IL-、IL-8、MIP-I以及粘附分子VCAM和ICAM的表达增加，进一步促进炎症反应。已有的研究发现， HMGBl与RAGE作用引发的这些反应可能与糖尿病患者的并发症发生和发展有关。但是，研究还发现，正常衰老或凋亡的细胞不能释放出HMGB1，因此，目前认为HMGBl只能在组织发生炎症或损伤后，由破裂的细胞释放到细胞外，是组织慢性炎症反应的主要因素之一。有趣的是，HMGBl中的A_box对B_box的促炎症活性具有很强的拮抗作用。A_box 的这种作用是通过与B-box竞争与受体结合(如RAGE、TLR2、TLR4)、从而减少B-box与细胞膜上受体的作用而减轻组织的炎症反应。最近的研究发现，当A-box与C-tail融合后， 它的抗炎活性明显增强，其作用机制不清楚，可能是由于C-tail的存在能促进A-box与受体结合从而增加后者对B-box的竞争性抑制作用。Exendin-4是从一种美洲大毒蜥蜴Gila monster lizard(Heloderma Suspectum) 的唾液腺毒素中分离出来的由39个氨基酸组成的多肽(SEQ ID No 2) 0它与GLP-I具有大约53%的结构同源性，能够与GLP-I的受体结合。进一步的研究表明，该多肽与GLP-I有同样的促进胰岛素分泌的功能，但稳定性却明显高于GLP-1。由美国Amylin和Lilly制药公司共同开发、人工合成的Exendin-4 (Exenatide，商品名为Byetta)于2005年4月获美国 FDA批准，成为首个获准上市的GLP-I拟似物，主要用于改善二甲双胍和磺酰脲类药物治疗不理想的2型糖尿病患者的血糖控制。临床应用表明，Exenatide注射后，空腹及餐后血糖均显著下降，且降糖作用与血糖水平有关。当血糖高于正常时，其促进β细胞释放胰岛素， 当血糖低于正常时，Exenatide不再显示进一步降糖作用。由此可见，Exenatide优于目前所用的磺脲类降糖药，不易发生低血糖反应。Exendin-4与二甲双胍、磺酰脲类药物、或噻唑烷二酮类药物联合应用时，能有效地控制2型糖尿病患者的血糖，而且对体重还有减轻作用。大量资料表明，Exendin-4在治疗糖尿病上具有显著降血糖、促进胰岛素分泌和保护胰岛细胞等作用，且副作用很小，是一种新型的生物制品。由于Exendin-4能增加胰岛素的分泌及提高β细胞质量的特性，(^hofaili等研究了 11名进行了胰岛移植的1型糖尿病患者在使用Exendin-4后的效果。结果表明，Exendin-4能刺激胰岛移植受者的胰岛素分泌，在一些患者可减少外源性胰岛素的用量，在其他患者则延缓再次需要使用胰岛素的时间，提示Exendin-4未来的适应症可扩展到1型糖尿病患者胰岛移植后的辅助治疗。更有研究认为其对神经系统有保护作用，随着研究的不断深入，其临床适应症可能进一步扩大。多肽药物是近年来生物医药研究的成果之一，多肽药物的生产主要有化学合成法和基因工程生产法。化学合成法主要是固相或液相合成法。固相合成技术目前已较为成熟，但成本较高，随着基因工程技术的成熟，国内外都尝试用基因工程技术生产多肽以提高产量，降低成本。用基因工程方法生产中等长度O0-60个氨基酸残基)多肽时，由于表达水平低，且容易降解，因此常与其它载体蛋白融合表达。但由于目的多肽在融合蛋白中所占比例很小，裂解后分离纯化困难，影响了基因工程生产多肽药物的发展。另一解决途经就是把目的多肽的基因串联，可以提高产量。但串联体切割时需要大量的酶，间接增加了生产成本。近年来，随着基因工程技术的发展，构建各种融合蛋白或单体、串联体多肽的报道迅速增加。同时，鉴于很多疾病对于单一药物的治疗效果不佳，国际上已开始研究利用不同药物或单抗进行“鸡尾酒”疗法，这种给药方法目前已成为一种新的发展趋势。然而，利用人体自身存在的酶，在体内对多肽药物进行裂解并连续释放其有效成分，使之成为可在体内产生两种(或多种)多肽而发挥不同效应并达到治疗同一种疾病的多肽药物，即所谓“多靶向” 治疗药物尚未见报道。凝血酶是体内存在的一种促进血液凝固的重要凝血因子，正常情况下凝血酶主要以酶原形式存在，少量被激活的凝血酶对于维持血管的正常状态具有重要的生理意义。因此，血液中凝血与抗凝血因子必须达到一定的平衡，以维持正常的血液循环。若凝血活性太低则导致毛细血管脆性增加和皮下出血等症状；若凝血活性太高，则容易导致血流淤滞甚至发生血管内凝塞。当组织或血管发生损伤或炎症时，大量的凝血酶原被激活，局部的血液凝固活性增加，有利于减少出血和促进组织修复。然而，某些疾病如糖尿病和肿瘤，因某些不明机制造成患者体内的凝血酶活性显著升高，这种病理变化可能直接与这些疾病的并发症发生和发展有关。已有研究表明，糖尿病患者体内的凝血酶活性比正常人的高3-10倍， 而实验糖尿病大鼠的凝血酶活性则比正常大鼠的高达30倍之多！这种病理变化对于原发疾病有何意义尚不清楚。综上所述，HMGBl的Α-box多肽通过竞争性抑制B_box序列与受体结合，能有效地发挥抗炎作用，减少细胞的炎症因子产生和减轻炎症对组织造成的损伤和症状，从而可以减缓原发疾病(如糖尿病)并发症的发生与发展。Exendin-4是一种此GLP-I更有效、作用时间更长的降糖物质，主要通过促进胰岛素合成和分泌以及促进β细胞增殖等机制而改善高血糖问题，具有治疗糖尿病的功效。这些具有药用功能的蛋白质多肽可以通过人工合成，也可以通过基因工程技术，用原核或真核表达的办法大量生产。相比之下，人工合成技术成本较高，而基因工程技术生产多肽的成本较低，且能大规模生产。因此，将A-box和 Exendin-4两种多肽以一种含有凝血酶切割位点的序列连接成为嵌合多肽，使之能在凝血酶活性增高的患者体内迅速被分解成A-box和Exendin-4两种多肽，分别发挥抗炎和降低血糖的功能，达到双靶向治疗效果，这种嵌合多肽在国内外尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种既能抗炎又能改善高血糖或对高血糖引起的疾病具有防治作用的一种双靶向作用的嵌合多肽及其应用。为了实现本发明的发明目的，本发明提供了一种具有双靶向作用的嵌合多肽，该嵌合多肽包括三段片段片段1、片段2和片段3，其中，片段1是HMGBl从N端计起的前 20-90个氨基酸序列，也即从人HMGBl多肽的N端第一个氨基酸残基算起的20-90个氨基酸序列；片段2是Exendin-4的氨基酸序列；片段3是片段1和片段2的连接片段，其包含凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点。优选地，在本发明的嵌合多肽中，片段1是HMGBl从N端计起的前50_90个氨基酸序列；更优选地，在本发明的嵌合多肽中，片段1是HMGBl从N端计起的前60-88个氨基酸序列。在本发明的嵌合多肽中，所采用的HMGBl蛋白的氨基酸序列可以使已发表的各种人源性HMGBl肽链的氨基酸序列，例如，HMGBl蛋白的氨基酸序列优选为SEQ ID No:l所示的序列。如图1所示，HMGBl蛋白的A-box氨基酸片段优选为SEQ ID No 1的N端1_88序列所示的片段。在本发明的嵌合多肽中，片段3是一种连接片段，只要其包括凝血酶酶切位点和二肽基肽酶、以便水解出具有生理活性的片段1和片段2即可，其本身长度本发明嵌合多肽的生理活性基本没有影响，所以，连接片段的长度是可以没有限制的；但从制备方便等角度考虑，优选地，片段3是是包括凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点的、长度为5-50个氨基酸的片段；更优选地，片段3是是包括凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点的、长度为5-25个氨基酸的片段。优选地，在本发明的嵌合多肽中，片段3中的二肽基肽酶的酶切位点位于与 Exendin-4蛋白的氨基酸序列相接的一侧。在本发明的嵌合多肽中，片段2的Exendin-4蛋白的氨基酸序列已在NCBI网站登记，序列号为AAB22006，具体序列如SEQ ID No 2所示。作为本发明的某些具体实施方式
，在本发明的嵌合多肽中，片段1可以具有如SEQ ID No :9-SEQ ID No 12之一所示的序列，相应地，本发明的嵌合多肽可以具有如SEQ ID No :3-SEQ ID No :8之一所示的序列。本发明的嵌合多肽的结构示意图见图2。另一方面，为了实现本发明的发明目的，本发明还提供了制备上述具有双靶向作
5用的嵌合多肽的方法，该嵌合多肽可以通过本领域公知多肽合成技术合成；或者通过公知的基因工程技术来实现，具体包括包含编码该嵌合多肽的核苷酸序列(此序列可通过PCR 和或人工合成的技术得到)的表达载体，在基因工程菌株中表达并纯化得到。上述方法中还可包括任何本领域公知的对多肽进行化学修饰的步骤。通过对本发明嵌合多肽进行体内和体外的活性实验，证明其具有显著的抗炎和降血糖的活性，完全可以应用于制备抗炎和/或降低高血糖的药物。本发明的基本原理如下由于这种嵌合多肽含有凝血酶的切点和二肽基肽酶 (DPP-4)的切点，当这种嵌合多肽直接用于人体后，在血液中的凝血酶和DPP-4作用下，将其裂解并产生两种具有药用活性的多肽，即人HMGBl的N端序列(A-box)和Exendin-4，发挥不同的治疗效果。所产生的人HMGBl的N端序列的多肽发挥其竞争性抑制HMGBl与受体结合，从而减轻细胞的炎症反应，包括抑制1顺-、11^-1、11^-、11^-8、10 -1以及粘附分子VCAM 和ICAM的产生，达到防治由于慢性炎症而产生的并发症，例如糖尿病的并发症等；而所产生的Exendin-4则发挥调节血糖的功能，达到改善高血糖的问题，可防治由于高血糖而产生的疾病，包括1型和2型糖尿病等。因此，这种嵌合多肽在体内能够被凝血酶切割而释放出HMGBl的N端序列(或A-box)和Exendin-4两种各具药效功用的多肽，因而具有抗炎和降血糖的双靶向作用。本发明的嵌合多肽在体内和体外实验具有图3所示的作用机制。相此于现有技术，本发明的嵌合多肽具有以下的有益效果1、在应用基因工程技术生产本发明的嵌合多肽时，将不存在生产其他融合蛋白所需的裂解纯化的缺点，同时又可提高该多肽的表达量。2、这种嵌合蛋白在患者体内的连续性水解能延长该两种多肽药物的半衰期，从而减少用药次数。3、这种嵌合蛋白在体内产生的HMGBl蛋白N端序列和Exendin-4多肽分别发挥两种不同的作用，形成一种双靶向叠加效应，具有“鸡尾酒”设计效果。4、由于糖尿病患者血中的凝血酶活性比正常人高3-10倍，本发明的嵌合多肽尤其适用于糖尿病及其并发症，因而针对性强。
图1为HMGBl的分子结构，显示A_box、C_tail和B_box三个结构域。图2为本发明的双靶向作用嵌合多肽的结构示意图，包括HMGBl的N端序列、连接片段和Exendiin-4序列。图3为本发明的双靶向作用嵌合多肽在体内的作用机制示意图。本示意图列出的本发明的双靶向嵌合多肽在体内的作用机制所涉及的酶包括DPP-4、凝血酶、凝血因子X。 在酶的作用下，该嵌合蛋白释放出HMGBl的N端序列和Exendin-4两种多肽，分别具有抗炎和刺激胰岛素分泌的作用。图4为嵌合多肽(SEQ ID No 3)的凝血酶水解产物对胰岛细胞株NIT-I细胞的活性影响。NIT-I细胞与不同浓度(0，5，10，20，40微克/毫升)的嵌合多肽水解产物(含 HMGBl的N端序列和Exendin-4)共同保温72小时后，用MTT法测定的细胞活性随水解产物浓度而增加，提示水解产物对NIT-I细胞的增值具有促进作用。
图5为化学发光法测定嵌合多肽(SEQ ID No 3)的凝血酶水解物对NIT-I细胞的胰岛素分泌的影响。“对照组”为未加水解产物，“未水解组”为未经凝血酶水解的嵌合多肽 (20微克/毫升)，“水解组”为经过凝血酶水解的嵌合多肽水解产物(20微克/毫升)，与 NIT-I细胞保温72小时后测定上清液的胰岛素含量(毫微克/毫升)。本图显示只有经过凝血酶水解的嵌合多肽才能刺激NIT-I细胞分泌胰岛素。图6为RT-PCR法测定嵌合多肽(SEQ ID No 3)的凝血酶水解物对K562细胞株 IL-6的mRNA表达水平的影响。M为DNA长度梯度，从下至上的条带为100，200，300，400， 500，600bp ；1为对照组，2为重组人HMGBl(rhHMGBl) +嵌合多肽水解产物，3为rhHMGBl。本图显示rhHMGBl能显著刺激K562细胞表达炎症因子IL-6的mRNA (3)，而当嵌合多肽水解物和rhHMGBl同时存在时，IL-6的mRNA表达显著降低O)，提示嵌合多肽水解物对rhHMGBl 的活性具有拮抗作用。
具体实施例方式实施例11、本发明嵌合多肽的制备按照图2的排列设计，采用基因工程技术生成由人HMGBl的N端83个氨基酸、5个氨基酸连接片段、Exendin-4组成的嵌合肽序列，序列如下MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKA RYEREMKTYIPPKGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 3)上述序列中，下划线所示的部分为连接片段，连接片段中G后面的P还可以是A、 S、V、L0具体制备上述序列的步骤如下(1)利用PCR方法或化学合成法得到人HMGBl的N端83个氨基酸和含凝血酶和二肽肽酶酶切位点5个氨基酸的DNA序列；(2)利用PCR方法或化学合成法得到含凝血酶和二肽肽酶酶切位点的连接片段和 Exendin-4 的 DNA 序列；(3)将上述两段序列混合，94°C变性，52°C退火，互为模板延伸，得到嵌合肽的全 DNA序列；(4)用上述嵌合肽的全DNA序列构建表达质粒，转导受体菌，通过筛选获得阳性工程菌。以发酵罐扩大培养得到嵌合肽的基因工程表达产物，按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽。2、生理活性实验部分在PBS溶液中，将凝血酶、二肽基肽酶与本发明的嵌合多肽共同保温，37°C，1小时模拟体内水解该嵌合肽，所获得的酶水解产物进行初步的活性测定或经过凝胶层析分离得到HMGBl的N端肽段和Exenden-4多肽，分别开展活性实验。(1)用MTT法测定嵌合多肽产生的Exenden-4对胰岛-细胞株NIT-I细胞的增值活性影响。取对数生长期的NIT-I细胞与最终浓度为0，5，10，20，40 μ g/ml的嵌合肽水解产物共同保温72小时，除去上清，用MTT测定细胞活性，可以观察到NIT-I细胞的活性(A 值)随嵌合肽水解产物的浓度增加而明显提高，显示Exenden-4多肽对NIT-I细胞的增值具有显著的促进作用(如图4所示)。(2)用化学发光法测定嵌合多肽产生的Exenden-4对胰岛-细胞株NIT-I细胞的胰岛素分泌的影响。取对数生长期的NIT-I细胞，分三组，对照组加生理盐水，实验1组(未水解组)加最终浓度为20 μ g/ml嵌合肽，实验2组(水解组)加最终浓度为20 μ g/ml嵌合肽水解产物，在37°C保温72小时，取上清液用化学发光法测定胰岛素含量，可以观察到实验1组对NIT-I细胞分泌胰岛素无明显的影响，但实验2组的胰岛素含量明显升高，显示嵌合肽水解产物中的Exenden-4能显著增加NIT-I细胞的胰岛素分泌(如图5所示)。(3)用RT-PCR法测定嵌合多肽产生的HMGBl的N端序列对K562细胞内IL-6的 mRNA表达水平的影响。取对数生长期的K562细胞，分三组，对照组加生理盐水，实验1组同时加嵌合肽水解物(20 μ g/ml)和 hrHMGBl (10 μ g/ml)，实验 2 组加 hrHMGBl (10 μ g/ml)，在 37°C保温72小时，收集细胞并提取总RNA，用逆转录酶制备cDNA。用IL-6引物(forward AAAGAGGCACTGGCAGAAAA, reverse :AACAACAATCTGAGGTGCCC， size :416bp)和-actin 弓丨物 (forward TGGGTCAGAAGGATTCCTATGT, reverse CAGCCTGGATAGCAACGTACA, size :276bp)分析IL-6的mRNA表达水平。可以观察到对照组的IL-6表达水平较低，而实验2组显示IL-6 的mRNA水平显著增高，表明细胞受hrHMGBl刺激而增加IL-6的合成，而实验1组的IL-6 的mRNA水平比实验2组显著降低，显示嵌合肽水解产物中的HMGBl的N端序列能显著抑制 hrHMGBl对K562细胞的刺激作用(如图6所示)。(4)体内法鉴定嵌合多肽的降血糖和抗炎作用利用链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型，随机分为不同浓度给药组和对照组，每组10只，分别于腹腔给药(对照组注射生理盐水)，于30min后取尾静脉血用血糖仪测定血糖，Ih后用尿糖试纸测定尿糖，观察嵌合多肽对糖尿病大鼠的降血糖效果。另外，采用 ELISA法定量测定尾静脉血浆中TNF-、IL-1和IL-6的水平，分析大鼠炎症因子的产生情况。 该实验将可观察到糖尿病大鼠的血糖和尿糖下降，炎症细胞因子水平下降。下述实施例2-6是本发明实现的另外几种实现方式，其制备方法均为现有基因工程及核苷酸或氨基酸化学合成的公知技术，它们得到的嵌合多肽在与实施例1中所述的生理活性实验中均体现了不同程度的抗炎活性以及降低血糖的作用。实施例2按照图2的排列设计，用化学合成的方法合成由人HMGBl的N端60个氨基酸、6个氨基酸连接片段、Exendin-4组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。本例嵌合多肽的序列为MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFLVPRGPHGE GTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 4)上述序列中，下划线所示的部分为连接片段，连接片段中的L、V还可以是A、I、M、 F、P、W等，连接片段中G后一位的P还可以是A、S、V、L0实施例3按照图2的排列设计，用化学合成的方法合成由人HMGBl的N端40个氨基酸、12 个氨基酸连接片段、Exendin-4组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。
本例嵌合多肽的序列为MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSELVPRGPGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEE AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 5)上述序列中，下划线所示的部分为连接片段，连接片段中的L、V还可以是A、I、M、 F、P、W等，连接片段中G后一位的P还可以是A、S、V、L0实施例4按照图2的排列设计，用化学合成的方法合成由人HMGBl的N端20个氨基酸、18 个氨基酸连接片段、Exendin-4组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。本例嵌合多肽的序列为MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVLVPRGPGVPRGPGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGP SSGAPPPS(SEQ ID No 6)上述序列中，下划线所示的部分为连接片段，连接片段中的L、V还可以是A、I、M、 F、P、W等，连接片段中G后一位的P还可以是A、S、V、L0实施例5按照图2的排列设计，用化学合成的方法合成由人HMGBl的N端20个氨基酸、M 个氨基酸连接片段、Exendin-4组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。本例嵌合多肽的序列为MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVLVPRGPGVPRGPGVPRGPGVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEW LKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 7)上述序列中，下划线所示的部分为连接片段，连接片段中的L、V还可以是A、I、M、 F、P、W等，连接片段中G后一位的P还可以是A、S、V、L0实施例6按照图2的排列设计，用化学合成的方法合成由人HMGBl的N端20个氨基酸、6个氨基酸连接片段、Exendin-4组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。MGK⑶PKKPRGKMSSYAFFVLVPRGPHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID No 8)上述序列中，下划线所示的部分为连接片段，连接片段中的L、V还可以是A、I、M、 F、P、W等，连接片段中G后一位的P还可以是A、S、V、L0实施例7按照图2的排列设计，用化学合成的方法合成人HMGBl的N端20_90个氨基酸序列、由3-M个氨基酸组成的连接片段、Exendin-4序列组成的嵌合多肽，再按常规方法纯化和制备适用于人体的本嵌合多肽药物成分。实施例8利用常规工艺制成含本发明的嵌合多肽(SEQ ID No :3)250微克/毫升、500微克 /毫升、750微克/毫升、1000微克/毫升、1500微克/毫升和2000微克/毫升的皮下注射药物。该药物在临床实验中均体现了拮抗HMGBl和降血糖的功能。
实施例9利用常规工艺制成含本发明的嵌合多肽(SEQ ID No :3)0. 1微克/毫升、0. 2微克 /毫升、0. 5微克/毫升、1微克/毫升和2微克/毫升的静脉注射药物。该药物临床实验中均体现了拮抗HMGBl和降血糖的功能。
权利要求
1.一种具有双靶向作用的嵌合多肽，该嵌合多肽由三段片段构成片段1、片段2和片段3 ；其中，片段1是HMGBl从N端计起的前20-90个氨基酸序列；片段2是Exendin-4的氨基酸序列；片段3是片段1和片段2的连接片段，其包含凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点。
2.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的二肽基肽酶的酶切位点位于与 Exendin-4蛋白的氨基酸序列相接的一侧。
3.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的片段1是来自如SEQID No:l所示的 HMGBl蛋白的从N端计起的前20-90个氨基酸序列，所述的片段3是来自如SEQ ID No:2所示的Exendin-4蛋白的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的嵌合多肽具有如SEQID No:3-SEQ ID No :8之一所示的序列。
5.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中，所述的片段1具有如SEQID No :9_SEQ ID No 12之一所示的序列。
6.一种制备如权利要求1-5之一所述的嵌合多肽的方法，其中，所述的嵌合多肽是通过多肽合成技术合成的。
7.一种制备如权利要求1-5之一所述的嵌合多肽的方法，其中，所述的嵌合多肽是通过构建包含编码所述嵌合多肽的核苷酸序列的表达载体，在基因工程菌株中表达并纯化得到。
8.如权利要求7所述的制备嵌合多肽的方法，其中，所述的核苷酸序列通过PCR和/或人工合成的手段得到。
9.如权利要求6或7所述的制备嵌合多肽的方法，其进一步包括对多肽进行化学修饰。
10.如权利要求1-5之一所述的嵌合多肽在制备抗炎和/或降低高血糖的药物方面的用途。
全文摘要
本发明提供了一种基于凝血酶活性的双靶向作用的嵌合多肽及其制备方法和应用。本发明的嵌合多肽包括三段片段片段1是HMGB1蛋白从N端计起的20-90个氨基酸序列；片段2是Exendin-4蛋白的氨基酸序列；片段3是片段1和片段2的连接片段，包含凝血酶酶切位点和二肽基肽酶的酶切位点。本发明的制备方法可以是通过多肽合成技术合成或者通过构建包含编码所述嵌合多肽的核苷酸序列的表达载体，在基因工程菌株中表达并纯化得到。本发明的嵌合多肽具有抑制炎症反应和降低血糖的双靶向作用，可以应用于制备抗炎和/或降低高血糖的药物。
文档编号A61P29/00GK102443064SQ20111034275
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者刘誉 申请人:刘誉