专利名称：靶向pax2用于治疗乳腺癌的制作方法
靶向PAX2用于治疗乳腺癌本申请要求于2010年2月18日提交的美国专利申请号12/708，294的优先权，以及于2009年8月M日提交的美国专利申请号12Λ46，292的优先权。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的癌症原因，并且在美国是女性第二大常见的癌症死亡原因。虽然多数初期乳腺癌是基于发现乳腺影像异常来诊断的，但是肿块或乳腺组织坚实度的变化也可能是疾病的警报信号。过去几十年内提高乳腺癌风险意识已致使进行乳腺摄影筛查的女性数量增加，导致更早期检测癌症并且由此提高存活率。尽管如此，乳腺癌是45 至阳岁女性最常见的死亡原因。已知许多类型的癌症是由遗传畸变即突变引起的。突变的积聚和细胞控制功能受损致使从正常组织到早期癌前的进行性表型变化，如上皮内瘤变(IEN)到日益严重的IEN 到浅表癌以及最终到浸润性疾病。该过程通常在几年甚至十几年内相对缓慢地发生，虽然在一些情况下可能相对迅速。癌基因依赖是，癌细胞对维持恶性表型的单一癌基因的连续活化或过表达的生理依赖。这种依赖发生于标志肿瘤进程的其它变化的环境中。浸润性癌症的长期进程为临床干预提供了时机。因此，重要的是鉴定指征癌前疾病的生物标志物，以便可以采取治疗措施预防或延缓浸润性癌症的发展。发明概述本发明一方面涉及预防或治疗个体中乳腺疾病的方法。所述方法包括向个体乳腺组织给予抑制PAX2表达或PAX2活性的组合物。在一实施方案中，所述乳腺疾病是乳腺癌或乳腺上皮内瘤变(MIN)。在另一实施方案中，所述抑制PAX2表达包括向个体的乳腺癌组织或MIN组织给予编码PAXkiRNA的核酸。在相关实施方案中，所述SiRNA包含选自以下的序列SEQ ID NO :3_6和11-15。在另一实施方案中，所述组合物包含抑制PAX2与DEFBl启动子结合的寡核苷酸。在相关实施方案中，所述寡核苷酸包含正向或反向的SEQ ID NO :1。在相关实施方案中，所述寡核苷酸包含X1GGAACX2序列，其中Xl和X2是与DEFBl 编码序列中SEQ ID NO 1的邻近核苷酸互补的0至30个核苷酸。在相关实施方案中，所述寡核苷酸包含选自以下的序列SEQ IDNO =18-21,25,26, 28 禾口 29。在另一实施方案中，所述组合物包含RAS信号通路的阻断剂。在另一实施方案中，所述组合物包含选自以下的拮抗剂血管紧张素II的拮抗齐U，血管紧张素II受体的拮抗剂，血管紧张素转化酶(ACE)的拮抗剂，丝裂原活化蛋白激酶 (MEK)的拮抗剂，ERK1，2(细胞外信号调节激酶)的拮抗剂，以及信号转导及转录活化因子 3 (STAT3)的拮抗剂。还公开了治疗个体中乳腺癌或MIN的方法，所述方法包括增强个体乳腺癌组织或 MIN组织中的DEFBl表达。在一实施方案中，增强DEFBl表达包括向个体的乳腺癌组织或MIN组织给予有效量的DEFBl。在另一实施方案中，增强DEFBl表达包括向个体的乳腺癌组织或MIN组织给予有效量的编码DEFBl的表达载体。还公开的是用于治疗个体乳腺疾病的方法，所述方法包括(a)测定来自所述个体的患病乳腺组织中PAX2-比-DEFBl的表达率；(b)测定来自所述个体的所述患病乳腺组织的ERA5R状态；以及(c)基于(a)和(b)的结果，向所述个体的乳腺组织给予组合物，所述组合物(1)抑制PAX2表达或PAX2活性，(2)表达DEFBl，或(3)抑制PAX2表达或PAX2活性并且表达DEFBl。附图简要说明附图与说明书一起阐述本发明的一个或多个实施方案，用于说明本发明的原理。 只要有可能，整个附图所使用的相同附图标记是指实施方案的相同或类似元件。图IA至ID给出β -防御素-1 (DEFBl)表达的定量RT-PCROlRT-PCR)分析。图2给出DEFBl诱导膜完整性和细胞形态改变的显微镜分析。黑色箭头指示膜波动，白色箭头指示凋亡小体。图3给出前列腺癌细胞中DEFBl的细胞毒性分析。用PonA处理前列腺细胞系 DU145、PC3和LNCaP来诱导DEFBl表达1_3天，之后进行MTT测定以确定细胞活力。结果表示为平均值士标准偏差，η = 9。图4Α和4Β给出由DEFBl诱导DU145和PC3细胞的细胞死亡。图5给出DEFBl诱导之后的泛半胱天冬酶(pan-caspase)分析。图6给出PAX2 siRNA处理之后配对盒同源基因2 (PAX2)蛋白表达的沉默。图7给出对用PAX2 siRNA处理之后的前列腺癌细胞生长的分析。图8给出对siRNA沉默PAX2之后的细胞死亡的分析。结果表示为平均值士标准偏差，η = 9。图9给出对半胱天冬酶活性的分析。
图10给出对ΡΑΧ2 siRNA处理之后的凋亡因子的分析。图11给出PAX2与DNA识别序列结合的模型。图12示出DEFBl报告子构建体。图13给出抑制PAX2导致DEFBl表达。图14给出抑制PAX2导致DEFBl启动子活性增强。图15给出DEFBl表达致使膜完整性受损。图16给出PAX2抑制导致膜完整性受损。图17A和17B给出PAX2与DEFBl启动子结合的ChIP分析。图17A中，泳道1包含IOObp的分子量标志物。泳道2是阳性对照，代表交联和免疫沉淀反应之前从DU145扩增的DEFBl启动子的160bp区。泳道3是阴性对照，代表无DNA进行的PCR。泳道4和5 是阴性对照，分别代表用IgG从交联的DU145和PC3进行免疫沉淀反应的PCR。交联之后用抗-PAX2抗体免疫沉淀的25pg DNA (泳道6和8)和50pg DNA (泳道7和9)的PCR扩增分别显示DU145和PC3中160bp的启动子片段。图17B中，泳道1包含IOObp分子量标志物。泳道2是阳性对照，代表交联和免疫沉淀反应之前从DU145扩增的DEFBl启动子的 160bp区。泳道3是阴性对照，代表无DNA进行的PCR。泳道4和5是阴性对照，分别代表用IgG从交联的DU145和PC3进行免疫沉淀反应的PCR。交联之后用抗-PAX2抗体免疫沉淀的25pgDNA (泳道6和8)和50pg DNA (泳道7和9)的PCR扩增分别显示DU145和PC3 中160bp的启动子片段。图18给出PrdPD和PrdHD与DNA的预测结构。图19给出不同配对结构域共有序列的比较。在图顶部示出ftxl-配对-结构域士 DNA复合物晶体学分析中所描述的蛋白士 DNA接触的示意图。空框指示α-螺旋，阴影框指示折叠，以及粗线指示转角。接触的氨基酸由单字母代码给出。仅给出直接接触的氨基酸士碱基。空圈指示大沟接触，而红箭头指示小沟接触。该示意图是配对结构域蛋白所有已知共有序列的比对(仅给出正义链)。共有序列之间的垂直线指示保守的碱基对。位置编号在图底部给出。图20给出靶向ΡΑΧ2作为化学预防性策略。图21给出血管紧张素II (Ang II)对DU145细胞中ΡΑΧ2表达的影响。图22Α给出洛沙坦(Losartan，Los)对DU145细胞中PAX2表达的影响。图23给出Los阻断AngII对DU145中PAX2表达的影响。图M给出AngII增加DU145细胞增殖。图25A，图25B和图25C给出Los和MAP激酶抑制剂对DU145细胞中PAX2表达的影响。图25A给出用洛沙坦处理DU145细胞阻抑磷酸化-ERK1/2和PAX2表达；图25B给出 MEK激酶抑制剂和AICAR阻抑PAX2蛋白表达；图25C给出MEK激酶抑制剂和洛沙坦阻抑磷酸化-STAT3蛋白表达。图26A和26B给出Los和MEK激酶抑制剂对DU145细胞中PAX2活化的影响。图27给出AngII在UrEC细胞中增加PAX2表达而降低DEFBl表达。图28给出AngII信号转导和PAX2前列腺癌的示意图。图四给出阻断PAX2表达作为前列腺癌疗法的示意图。图30给出用Gleason评分对DEFBl和PAX2表达的比较。图31A和31B给出PAX2-DEFB1比值作为前列腺癌发展的预测因子。图32给出Donald预测因子(DPF)是基于相对的PAX2-DEFB1表达率。图33A和3 给出对人前列腺组织中hBD_l表达的分析。图34A和34B给出对前列腺细胞系中hBD_l表达的分析。图34A给出与hPrEC细胞相比，hBD-Ι诱导之前和之后前列腺癌细胞系中hBD-Ι的表达水平。一个星号代表相比 hPrEC统计学更高的表达水平。两个星号代表相比hBD-Ι诱导之前的细胞系统计学显著的表达水平(学生t-检验，ρ < 0. 05)。图34B给出通过免疫细胞化学验证前列腺癌细胞系 DU145中的异常hBD-Ι表达。将UrEC细胞对hBD_l进行染色作为阳性对照(A =DIC和B 荧光)。用hBD-Ι转染DU145细胞并诱导18小时(C =DIC和D 荧光)。比例尺=20 μ Μ。图35给出前列腺癌细胞中hBD-Ι的细胞毒性分析。各柱子代表一式三份进行三个独立试验的平均值士标准误。图36A和图36B给出正常、PIN和肿瘤的LCM人前列腺组织切片中hBD_l和cMYC 表达的QRT-PCR分析。每种基因的表达表示为与β-肌动蛋白相比的表达率。图36Α给出正常、PIN和肿瘤切片中hBD-Ι表达水平的比较。图36B给出正常、PIN和肿瘤切片中cMYC 表达水平的比较。
图37给出用siRNA敲低PAX2之后的hBDl表达的QRT-PCR分析。hBD_l表达水平表示为与β-肌动蛋白相比的表达率。星号代表与PAXkiRNA处理之前的细胞系相比统计学更高的表达水平(学生t-检验，ρ < 0. 05)。图38A和38B给出PAX2 siRNA处理之后PAX2蛋白表达的沉默。图38A给出通过 Western印迹分析检测HPrEC前列腺原代细胞(泳道1)以及DU145 (泳道2)，PC3 (泳道3) 和LNCaP(泳道4)前列腺癌细胞中的PAX2表达。将印迹清除并重新探测作为内参的β-肌动蛋白，以确保等量上样。图38Β给出对用ΡΑΧ2 siRNA双螺旋转染之后证实ΡΑΧ2表达敲低的全部DU145，PC3和LNCaP的Wfestern印迹分析。同样地，将印迹清除并重新探测作为内参的β-肌动蛋白。图39给出对用ΡΑΧ2 siRNA处理之后的前列腺癌细胞生长的分析。比例尺= 20 μ m0图40给出对siRNA沉默PAX2之后的细胞死亡的分析。结果表示为平均值士标准偏差，η = 9。图41给出对半胱天冬酶活性的分析。比例尺=20 μ m.图42A至42C给出对PAX2 siRNA处理之后的凋亡因子的分析。结果表示为平均值士标准偏差，η = 9。星号代表统计学差异(ρ < 0. 05)。发明详述本发明一方面提供预防或治疗个体中乳腺癌的方法。所述方法包括给予个体组合物，所述组合物包含ΡΑΧ2表达或ΡΑΧ2活性的抑制剂，或者DEFB-I表达或DEFB-I活性的增强剂。在一实施方案中，所述个体被诊断患有乳腺上皮内瘤变(MIN)。在某些方面，乳腺组织的ΡΑΧ2在MIN之前被上调。因而，本申请还提供了治疗或预防个体中MIN的方法。所述方法包括给予个体组合物，所述组合物包含ΡΑΧ2表达或ΡΑΧ2 活性的抑制剂，或者DEFB-I表达或DEFB-I活性的增强剂。蛋白“活性”包括，例如转录、翻译、细胞内转位、分泌、通过激酶的磷酸化、通过蛋白酶的剪切、与其它蛋白的嗜同和嗜异结合、泛素化作用。在某些方面，“ΡΑΧ2活性”具体是指ΡΑΧ2与DEFB-I启动子的结合。乳腺癌普遍用于乳腺癌筛选的方法包括自我和临床乳腺检查，X-射线乳腺摄影以及乳腺磁共振成像(MRI)。乳腺癌筛查的最新技术是超声计算机断层成像术，其利用声波形成三维图像并且乳腺癌在不用χ-射线乳腺摄影中所用的危险放射线的情况下检测乳腺癌。还可以使用基因测试。用于乳腺癌的基因测试一般包括测试BRCA基因中的突变。这除了对那些有提高乳腺癌风险的患者，通常是不推荐的技术。女性死亡的主要原因，乳腺癌的发生率，在美国过去这三十年逐渐增加。虽然乳腺癌的发病机理尚不清楚，但是正常乳腺上皮细胞转化成恶性表型可能是遗传因素的结果， 尤其是30岁以下的女性。最近，BRCAl和BRCA2的发现和表征已扩大了我们对能促进家族乳腺癌的遗传因素的理解。这两个基因座内的生殖细胞系突变与50-85%的乳腺癌和/或卵巢癌的终身风险相关。然而，其它非遗传因素很可能对该疾病的病因也具有重大影响。无论其起因是什么，如果在其进程早期未被检测到，那么乳腺癌发病率和死亡率会显著增加。 因而，大量工作已集中于乳腺组织的细胞转化和肿瘤形成的早期检测上。
目前，鉴定乳腺癌的主要方式是通过检测致密肿瘤组织的存在。这可以通过直接检查乳腺外部或通过乳腺摄影或其它X-射线成像方法来实现不同程度的效力。然而，后面的方法有相当大的代价。每当进行乳腺摄影时，患者承受测试过程中所使用的放射线的电离特性所诱导的较小的患有乳腺肿瘤的风险。此外，该方法昂贵并且技术员的主观解释可能导致不精确，例如，一项研究表明，对于由所调查的一组放射科医生单独解释的一组乳腺影像，大约三分之一存在主要临床分歧。此外，许多女性感到进行乳腺摄影是痛苦的经历。 因此，国家癌症研究所并不推荐50岁以下的女性进行乳腺摄影，因为与年纪较大的女性相比，该群体发展成乳腺癌的可能性较低。然而，引人注意的是，虽然50岁以下的女性仅有约 22%发生乳腺癌，但数据显示绝经前女性的乳腺癌更具侵袭性。PAX2PAX基因是编码核转录因子的九个发育调控基因家族。它们在胚胎发生中起重要作用，并且以非常有序的时空模式表达。它们全部包含编码DNA结合结构域的384个碱基对的“配对盒”区，所述“配对盒”区在整个进化过程中是高度保守的(Stuart，ET, et al. 1994)。通过许多可直接归因于PAX基因的杂合不足的天然鼠和人类综合症已证实PAX 基因对发育过程的影响。Dressier等(1990)已给出PAX2序列。人PAX2蛋白及其变体的氨基酸序列，以及编码这些蛋白的DNA序列列于SEQ ID NO :39-59 (SEQ ID N0:39，由人PAX2 基因的外显子1编码的氨基酸序列；SEQ ID N0:40，人PAX2基因启动子和外显子1 ;SEQ ID NO :41，人PAX2的氨基酸序列；SEQ ID NO :42，人PAX2基因；SEQ ID NO :43，人PAX2基因变体b的氨基酸序列；SEQ ID NO :44，人PAX2基因变体b ;SEQ IDNO :45，人PAX2基因变体c的氨基酸序列；SEQ ID NO :46，人PAX2基因变体c ；SEQ ID NO :47，人PAX2基因变体d的氨基酸序列；SEQ IDNO 48,人PAX2基因变体d ；SEQ ID NO :49，人PAX2基因变体e的氨基酸序列；SEQ ID NO :50，人PAX2基因变体e)。据报道，PAX2通过与DEFB-1启动子(Bose SK et al. ,MoI Immunol. 2009，46 :1140-8.)在紧邻 DEFBl TATA盒的 5，-CCTTG_3，(SEQ ID NO 1) 识别位点处相结合而阻抑DEFB-I表达。在一些文献中，结合位点还称为3’-GTTCC-5’ (SEQ IDNO 1)或 5，-CAAGG-3，(SEQ ID NO :2)识别位点，5，-CAAGG-3，(SEQ IDNO :2)是相对链上的序列。两个序列都涉及DEFBl启动子上的PAX2结合位点。已检测PAX2表达的癌症的例子列于表1。表1 表达PAX2的癌症
表达PAX2美国估计的美国估计的全球估计的全球估计的
的癌症__新病例__死亡数__新病例__死亡数
前列腺__234,460 27,350__679,023 221,002
乳腺__214,600 41,430__1,151,298 410,712
卵巢__20,180__15,310__204,500124,860
_ 38,89012,840208,479101,895
8J __12,820__18,820__189,485141,650
权利要求
1.用于治疗个体中乳腺疾病的方法，所述方法包括向所述个体的乳腺组织给予抑制 PAX2表达和/或PAX2活性的组合物，其中所述组合物包含一种或多种选自以下的成分编码PAXkiRNA的多核苷酸，抑制 PAX2与DEFBl启动子结合的多核苷酸，血管紧张素II的拮抗剂，血管紧张素II受体的拮抗齐U，血管紧张素转化酶(ACE)的拮抗剂，丝裂原活化蛋白激酶(MEK)的拮抗剂，细胞外信号调节激酶1，2(ERK1，2)的拮抗剂，信号转导及转录活化因子3 (STAT3)的拮抗剂，以及RAS 信号通路的阻断剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述乳腺疾病是乳腺癌或乳腺上皮内瘤变(MIN)。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含编码siRNA的多核苷酸，所述siRNA 包含选自以下的序列:SEQ ID NO :3-6和11-15。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含多核苷酸，所述多核苷酸包含正向或反向的SEQ ID NO :1。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述多核苷酸包含V-CCTTG-W序列及其互补序列，其中V和W是在DEFBl启动子的PAX2结合位点侧翼的1至35个核苷酸的连续核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述多核苷酸包含选自以下的序列SEQID NO 18-21，25，26，28 和 29。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含依那普利。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含缬沙坦、奥美沙坦或替米沙坦。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含U0U6或PD98059。
10.治疗个体中乳腺癌或MIN的方法，所述方法包括增强所述个体乳腺癌组织或MIN组织中的DEFBl表达。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述增强DEFBl表达包括向所述个体的乳腺癌组织或MIN组织给予有效量的DEFBl。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述增强DEFBl表达包括向所述个体的乳腺癌组织或MIN组织给予有效量的编码DEFBl的表达载体。
13.如权利要求1所述的方法，其还包括向所述个体给予有效量的抗激素剂的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述抗激素剂是他莫昔芬。
15.如权利要求1所述的方法，其还包括向所述个体给予有效量的抗-ERBB-2剂的步马聚ο
16.如权利要求15所述的方法，其中所述抗-ERBB-2剂是赫赛汀。
17.如权利要求1所述的方法，其还包括向所述个体给予有效量的抗-Her-2剂的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述抗-Her-2剂是曲妥珠单抗。
19.如权利要求1所述的方法，其还包括向所述个体给予有效量的抗-AIB-1/SRC-3剂的步骤。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含一种或多种选自以下的试剂抗激素剂、抗-ERBB-2剂、抗-Her-2剂以及抗-AIB-1/SRC-3剂。
21.用于治疗个体中乳腺疾病的方法，所述方法包括(a)测定来自所述个体的患病乳腺组织中PAX2-比-DEFBl的表达率；(b)测定来自所述个体的所述患病乳腺组织的ERA5R状态；以及(c)基于(a)和(b)的结果，向所述个体的乳腺组织给予第一组合物，所述第一组合物 (1)抑制PAX2表达或PAX2活性，(2)表达DEFBl，或(3)抑制PAX2表达或PAX2活性并且表达DEFB1。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述乳腺疾病是乳腺癌或MIN。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述第一组合物包含编码siRNA的多核苷酸，所述 siRNA包含选自以下的序列=SEQ ID NO 3-6禾口 11-15。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述第一组合物包含多核苷酸，所述多核苷酸包含正向或反向的SEQ ID NO :1。
25.如权利要求对所述的方法，其中所述多核苷酸包含V-CCTTG-W序列及其互补序列， 其中V和W是在DEFBl启动子的PAX2结合位点侧翼的1至35个核苷酸的连续核苷酸序列。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述多核苷酸包含选自以下的序列SEQID NO 18-21，25，26，28 和 29。
27.如权利要求21所述的方法，其中所述第一组合物包含选自以下的拮抗剂血管紧张素II的拮抗剂，血管紧张素II受体的拮抗剂，血管紧张素转化酶(ACE)的拮抗剂，丝裂原活化蛋白激酶(MEK)的拮抗剂，细胞外信号调节激酶1，2 (ERK1，2)的拮抗剂，信号转导及转录活化因子3(STAT3)的拮抗剂。
28.如权利要求21所述的方法，其中所述第一组合物包含RAS信号通路的阻断剂。
29.如权利要求21所述的方法，其中所述第一组合物是与抗体、受体或配体缀合以靶向所述个体肿瘤组织的抗-PAX2剂。
30.如权利要求21所述的方法，其中所述第一组合物是含有干扰或抑制PAX2与DEFBl 启动子结合的小分子抗-PAX2剂。
31.如权利要求21所述的方法，其中所述步骤(c)还包括给予包含抗激素剂的第二组合物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述抗激素剂是他莫昔芬。
33.如权利要求21所述的方法，其中所述步骤(c)还包括给予包含抗-ERBB-2剂的第二组合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述抗-ERBB-2剂是赫赛汀。
35.如权利要求21所述的方法，其中所述步骤(c)还包括给予包含抗-Her-2剂的第二组合物。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述抗-Her-2剂是曲妥珠单抗。
37.如权利要求21所述的方法，其中所述步骤(c)还包括给予包含抗-AIB-1/SRC-3剂的第二组合物。
全文摘要
本申请提供了通过抑制PAX2的表达来预防和/或治疗个体中乳腺癌的方法。在某些实施方案中，抑制PAX2表达的方法是给予个体编码PAX2siRNA的核酸。还提供了通过给予DEFB1或通过提高DEFB1的表达来治疗个体中癌症的方法。
文档编号A61P35/00GK102481379SQ201080037397
公开日2012年5月30日 申请日期2010年2月19日 优先权日2009年8月24日
发明者卡尔顿·D·唐纳德 申请人:菲吉尼克斯公司