专利名称：由人参制备新型糖脂蛋白吉托宁的方法及由该方法制得的新型糖脂蛋白吉托宁的制作方法
技术领域：
本发明涉及存在于人参中的新型糖脂蛋白(glycolipoprotein)，具体涉及从人参中分离鉴定并制备新型糖脂蛋白的方法和根据上述方法从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白及上述新型糖脂蛋白的用途。
背景技术：
人参一般用作调理素(adaptogen)或为了延长寿命的强壮剂，对抗压力、疲劳、疾病、癌症、糖尿病，从而提高生命机能。数百年间，人参不仅在韩国，在中国和日本也一直被使用着。最近，世界范围内消费的草药中，人参就是最有名的草药中之一(泰勒，药物技术杂志，11,214-220,1995 (Tyler, J. Pharm. Technol, 11，214-220，1995))。
人参皂苷(Ginsenoside)是在1960年代初期分离而被特性化，因此在生理学、药理学方面的研究中作为代表性成分而被广泛利用(柴田，等人，四面体通讯1962， 1239-1245,1963 ；瓦格纳-若雷格和罗斯，药物学报光触媒37，352-357，1962 (Shibata, et al. Tetrahea dron Lettersl962,1239-1245,1963 ；Wagner-Jauregg and Roth, Pha rm Acta Helv37，352-357，1962))。此外，在最近的研究中确认了人参中含有多糖类 (polysaccharides)、聚乙炔类(polyacetylenes)、蛋白质(proteins)等未被公开过的其它成分(Nah, Kor. j. GinsengSci. 21，1-12,1997))。
人参的人参皂苷成分量少，而且分离过程复杂，由于纯人参皂苷昂贵，因此一直使用根据丁醇提取法从人参根部获得的粗制总皂苷流分(粗制人参总皂苷流分(crude ginseng total saponin fraction)，C GSF)(神崎，等人英国药理学杂志 125 (2)， 255-262,1998 ；崔，等人英国药理学杂志132，641-648，2001 ；崔，等人，生物学化学杂志 276，48797-48802，2001 ；崔，等人欧洲药理学杂志468，83-92，2003 ；李，等人，生物学化学杂志· 279，9912-9921，2004 Jeong,等人，英国药理学杂志 142，585-593，2004 ；雷伊，等人，J精神药理学杂志19，357-365，2005 ；李，等人，主要药物研究杂志观，413-420，2005 ； 魏，等人 Ethnopharmacol 杂志 111，613-618，2007 ；埃里克森，等人 Ethnopharmacol 杂志 119,17-23,2008(Kanzaki, et al. Br J Pharmacol. 125(2),255-262,1998 ；Choi, et al. Br J. Phar macol.132，641-648，2001 ；Choi, et al.，J. Biol.Chem. 276,48797-48802, 2001 ；Choi, et al. Eur J Pharmacol 468,83-92,2003 ；Lee, et al, J Biol Chem. 279, 9912-9921,2004 Jeong, et al, Br J Pha rmacol. 142,585-593,2004 ；Reay, et al, J Psychopharmaco1. 19，357-365，2005 ；Lee, et al, Arch Pharm Res28，413-420，2005 ；Wei, et al J Ethnopharmaco1. 111, 613-618, 2007 ；Eriksson, et al J Et hnopharmacol. 119, 17-23,2008))。
已知粗制总皂苷流分(CGSF)通过细胞膜信号通路(signal pathway)显示其活性，例如，崔等人用粗制总皂苷流分处理非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)时，确认了通过连接在PLC β -IP3上的PTX-insentive (诱导)G α q/11蛋白来使钙激活氯离子通道(Ca2+-activated Chloride Channel, CaCC)被活化(崔，等人，生物学化学杂志 276， 48797-48802，2001 (Choi，et al.，J. Biol. Chem. 276，48797-48802，2001))。并且，李等人报道了在非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)中用粗制总皂苷流分持续处理时，由粗制总皂苷流分活化的钙依赖性氯离子通道电流(CaCC电流)自发性地减小(李，等人，生物学化学杂志 279，9912-9921，2004 (Lee，et al, J Biol Chem. 279，9912-9921，2004))。
对非洲爪蟾卵母细胞直接注入钙调蛋白(Calmodulin)或使细胞内钙池枯竭时，依靠粗制总皂苷流分的钙激活氯离子通道的活性消失(李，等人，主要药物研究杂志 28，413-420，2005 (Lee，et al, Arch Pharm Res28，413-420，2005))。并且，已知在非洲爪蟾卵母细胞中用粗制总皂苷处理时，会诱发SOCE(钙池操纵的Ca2+通道进入 (stored-operated Ca2+entry))(郑，等人，英国药理学杂志 142, 585-593, 2004 (Jeong, et al, Br J Pharmacol. 142，585-593，2004))，从细胞外或在细胞内钙池中引起钙浓度增加， 由此非洲爪蟾卵母细胞内的CaCC被活化(达斯卡尔，CRC生物化学评论杂志22,317-387， 1987(Dascal，CRC Crit Rev Biochem22，317-387，1987))。
本发明人为了对人参皂苷活化CaCC进行确认，在从粗制总皂苷流分物(CGSF)中分离纯的人参皂苷的过程中发现，在较之CGSF，人参皂苷更为丰富的流分物的情况下，上述流分物对于CaCC活性的效果急剧消失或没有了。即，确认为，从CGSF中分离的纯人参皂苷在非洲爪蟾软母细胞中，没有CaCC活性效果，由此可知，CGSF中不仅存在人参皂苷，还有未知的某些物质，可知这些物质对存在于非洲爪蟾卵母细胞内的CaCC的活性有影响。
对此，为了分离CGSF中引起内在的CaCC活性的某些成分，经过深入努力研究的结果，分离鉴定了新的生理活性成分，从而完成了本发明。发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明最终的主要目的在于，提供将具有调理活性功能的新型生理活性物质从人参中分离并鉴定出来的方法和由上述方法分离并鉴定的生理活性物质及上述生理活性物质的用途。
解决技术问题的技术手段
为了实现上述目的，本发明提供将人参中存在的新型糖脂蛋白 (glycolipoprotein)从人参中分离鉴定出来并制备的方法。
具体地，本发明的由人参制备新型糖脂蛋白吉托宁(以下，称为‘吉托宁 (gintonin) ’)的方法包括(1)从人参中制备甲醇提取物的步骤；( 用水和正丁醇的混合溶剂分离上述甲醇提取物的步骤；C3)使用氯甲烷甲醇水的混合溶剂作为洗脱溶剂， 对上述水流分物和正丁醇流分物中的正丁醇流分物实施硅胶柱层析法，分离成8个流分的步骤；(4)使用乙醇乙酸乙酯水的混合溶剂作为洗脱溶剂，对上述8个流分物中相对于 CaCC (钙激活氯离子通道(Ca2+_ac tivated Chloride Channel))的活性最高的第7流分物实施硅胶柱层析法，分离成2个流分的步骤；及( 透析上述2个流分物中CaCC活性高的流分物II，获得最终产物的步骤。
此外，在上述步骤的基础上，本发明还可以包括
(6)将最终流分物溶解于含有NaCl的pH7. 2的磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffer saline ；PBS)溶液中，实施阴离子交换层析法及凝胶过滤层析法后，分离成2个流分的步骤；及(7)将上述2个流分物分别用含有NaCl的pH8. 2的Tris-HCl和含有NaCl的 PH7. 2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液实施阴离子交换层析法，分离单独的吉托宁的步骤。
本发明还提供根据上述方法从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白(吉托宁)。
本发明中，上述糖脂蛋白(吉托宁)的特征在于，其分子量约为67kDa，其是表观分子量为13kDa的五聚体(pentarmer)，含有作为氨基酸组成成分的半胱氨酸和胱氨酸(cysteine and cystine)、天冬酉先胺禾口天冬氨酸(asparagine and aspartic acid)、谷氨酰胺和谷氨酸(glutamine and glutamic acid)、丝氨酸(serine)、甘氨酸(glycine)、(arginine) > ^MSI threonine) >(alanine) > If M(proline) ,^MM(valine)、异亮氨酸(isoleucine)、亮氨酸(leucine)、苯基丙氨酸(phenylalanine)、色氨酸(tryptophan)及赖氨酸(lysine)和；作为碳水化合物组成成分的鼠李糖(rhamnose)、 阿拉伯糖(ara binose)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、木糖(xylose)、氨基葡萄糖(glucosamine)；及作为脂质组成成分的亚油酸(linoleic acid)、棕榈酸(palmitic acid)、油酸(oleic acid)及硬脂酸(stearic acid)等。
人参作为五加科药用植物，根据加工方法有未加工的水参、将水参干燥了的白参、将水参蒸煮后干燥的红参等；根据栽培方法有在人参地里人工栽培的栽培参、将人参种子撒在山里自然状态下栽培的长脑参、在自然状态下自然生长的山参等；本发明的人参包括上述所有的人参种类。此外，本发明的人参包括高丽人参(Panax ginseng C. A. Meyer)、西洋参及中国人参等。
下面，详细说明本发明。
通过下述方法可获得本发明的存在于人参中的新型糖脂蛋白吉托宁。
首先，将经过干燥的人参粉用极性溶剂或它们的混合溶剂进行提取；极性溶剂为按照试样重量的约1至20倍，优选约1至10倍量的水、甲醇、乙醇、丁醇等Cl至C4的低级醇的极性溶剂；混合溶剂为，混合比约为1 0. 1至1 10，优选为具有1 0. 2至1 5 的混合比(v/v)的水和甲醇的混合溶剂；提取过程在70至120°C下进行约0. 1至48小时， 优选为5至12小时；提取方法为搅拌提取、热水提取、冷浸提取、加温提取、回流冷凝提取或超声波提取等提取方法，优选为回流冷凝提取后过滤回收上清液，将上述过程反复进行数次，优选为2至5次，然后收集上清液并进行减压浓缩，然后用水和正丁醇等量混合的混合溶剂进行溶剂分离，从而获得水和正丁醇的流分物。
使用氯甲烷甲醇水(CHCl3 MeOH H2O)的混合溶剂作为洗脱溶剂，对上述流分物中相当于粗制总皂苷流分(CGSF)的正丁醇流分物实施硅胶柱层析法，分离成8个流分后，对分离了的流分物实施非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)中的钙依赖性氯离子通道(CaCC)活性确认实验，检索流分物的活性，然后对活性最高的流分再使用乙醇乙酸乙酯水^tOH EtOAc H2O)的混合溶剂，实施硅胶柱层析法，分离成2个流分，然后利用过量的蒸馏水和透析膜(dialysismembrane)对其中活性高的流分进行透析，从而能够获得本发明的粗制吉托宁。
这样获得的粗制吉托宁可通过根据电泳(SDS-PAGE)的分子量分析、蛋白质及氨基酸组成分析、碳水化合物组成分析、根据GC-MS的脂质组成分析等进行确认。
此外，本发明的单独的吉托宁可通过下述方法获得将由上述工序获得的粗制吉托宁溶于含有NaCl的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline ；PBS)中实施阴离子交换层析法及凝胶过滤层析法，从而获得2个吉托宁流分物，将各个吉托宁流分物分别用含有NaCl的Tris-HCl (pH8. 2)和含有NaCl的PBS (pH7. 2)实施阴离子交换层析法而获得。
本发明中为了制备吉托宁可以使用山参、长脑参、栽培参、西洋参及中国人参等人参，可利用上述人参的水参、白参、红参等形态，优选用4至6年根的高丽人参(Panax ginseng C. A. Meyer)制备的红参，但不限于此。
本发明还提供将糖脂蛋白(吉托宁)用作因钙浓度降低引起的疾病的预防及治疗剂。
具体地，本发明提供含有上述方法制备的糖脂蛋白吉托宁作为有效成分的药物组合物，其用于预防及治疗因钙浓度降低引起的疾病。
本发明的上述吉托宁暂时诱发细胞质内游离Ca2+(Free Ca2+)的增加，由于细胞内钙浓度暂时增加，使得非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)内在的钙依赖性氯离子通道 (CaCC)活化，从而增加细胞内钙浓度，其结果为在因钙浓度降低引起的疾病的预防及治疗方面显示出优异的效果，特别是通过改善因钙浓度降低引起的神经系统疾病的异常，而进行治疗及预防。
因钙浓度降低引起的神经系统疾病包括精神分裂(Schizophrenia)、阿尔兹海默症(Alzheimer ‘ s Disease)、亨廷顿病(Hungtington ‘ s Disease)、遗传性偏瘫型偏头痛(Familial hemiplegic migraine)、癫痫(Eil 印 sy)、发作性共济失调(episodic ataxia)、脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxias)等，但不限于这些疾病。
此外，本发明的组合物对因钙不足引起的成长阻碍等也有效果，例如在强壮作用、 免疫力增加、性功能强化、神经系统保护及活性、血管的新生、抗糖尿作用等细胞内钙依赖性的各种生理活性方面也显示出了效果。
此外，由于人参长期被用作生药，因此从人参中分离出的本发明的吉托宁同样完全没有毒性及副作用等问题。
本发明的用于因钙浓度降低引起的疾病的预防及治疗的药物组合物中，相对于组合物总重量，含有0. 0001至10重量％的上述吉托宁，优选0. 001至1重量％。
此外，含有本发明的吉托宁的组合物还可以包括在药物组合物的制备中通常使用的适当的载体、赋形剂及稀释剂，本发明的吉托宁的药学给药方式可以为单独给药或与其它药理活化合物结合使用，不仅如此还可以适当地组合使用。
本发明的含有吉托宁的组合物分别可通过常用的方法制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液剂、糖浆剂、悬浮颗粒(aerosol)等经口型剂型或剂型化成外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态进行使用。上述组合物中可以含有的载体、赋形剂及稀释剂例如有 乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等。在制成制剂时，使用一般使用的填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂进行制备。经口给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这样的固体制剂在上述吉托宁或流分物中至少混合一种以上的赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等而制得。此外，除了单纯的赋形剂之外也使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。经口给药的液状制剂相当于悬浮剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了通常使用的作为单纯稀释剂的水、液体石蜡之外，还可以含有各种赋形剂，例如有湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。非经口给药的制剂包括灭菌水溶液、 非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂、栓剂。非水性溶剂、悬浮剂可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物性油，油酸乙酯等可以注射的酯等，栓剂的基质可以使用脂肪酸甘油三酯(wit印sol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween) 61、可可脂、水石梓(Iaurinum)、甘油明胶等。
本发明组合物的优选给药量根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及时间有所不同，但本领域技术人员可适当地选择。但是为了获得好的效果，本发明的组合物优选1日给药0. 0001至100mg/kg。可以1天给药一次，也可以分几次给药。上述给药量从任何方面都不能限制本发明的范围。
本发明的药物组合物可对大鼠、小鼠、家畜、人等哺乳动物以各种方式进行给药。 可预想到所有的给药方式，例如可以通过经口、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内硬膜或脑血管内(intracerebroventricular)注身寸进tj给药0
本发明的含有吉托宁的组合物可以以上述剂型的方式被用于预防及治疗因钙浓度降低引起的疾病的药剂、食品及饮料等多方面。可添加上述吉托宁的食品例如有，各种食品类、饮料、口香糖、茶、维生素复合剂、健康功能性食品类等。
本发明的吉托宁几乎没有毒性及副作用，因此可以以预防为目的长期放心使用。
本发明的吉托宁可以以预防因钙浓度降低引起的疾病为目的，加入到食品或饮料中，此时，上述吉托宁加入到食品或饮料中的量可以占食品重量的0. 01至15重量％，健康饮料组合物以100ml为基准加入0. 02至5g，优选可以以0. 3至Ig的比例添加。
本发明的健康功能性饮料组合物除了按规定比例含有吉托宁作为必要成分外，对于其他成分没有特别的限制，通常用的饮料一样还可以加入各种增香剂或天然碳水化合物等。此时，上述天然碳水化合物例如有葡萄糖、果糖等单糖；麦芽糖、蔗糖等多糖；及糊精、 环糊精等多聚糖等通常的糖以及木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等糖醇等。此外，作为调味剂可以有利地使用天然增香剂(奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物，例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)及合成增香剂(糖精、阿斯巴甜等)。上述天然碳水化合物的添加比例为在每100ml本发明组合物中一般加入1至20g，优选约为5至12g。
除了上述之外，本发明的提取物还可以含有各种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、合成增味剂及天然增味剂等增味剂、着色剂及增强剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶质增稠剂、PH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。除此之外，本发明的提取物还可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉，这样的成分可以独自或组合使用。此外，上述添加剂的比例不是那么重要，但是对于每100重量份的本发明提取物，一般在0至20重量份的范围内选择。
发明的效果
本发明具有如下效果，本发明提供对存在于人参中的新型糖脂蛋白吉托宁进行分离鉴定并制备的方法，以及由上述方法制备的新型糖脂蛋白吉托宁，以及上述新型糖脂蛋白吉托宁作为预防及治疗因钙浓度降低引起的疾病药物的用途。
本发明的吉托宁暂时地诱发细胞质内游离Ca2+(Free Ca2+)的增加，由于细胞内钙浓度暂时增加，使得非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)内在的钙依赖性氯离子通道(CaCC)活化，从而增加细胞内钙浓度，因此能够有效地用于因钙浓度降低导致的疾病的预防及治疗。
此外，本发明的吉托宁在强壮作用、免疫力增加、性功能强化、神经系统保护及活性、血管的新生、抗糖尿作用等细胞内钙依赖性的各种生理活性等方面也显示出了优异的效果。
图1的A为从人参中分离并鉴定新型糖脂蛋白吉托宁的方法的示意图，图1的B 为在含有吉托宁流分物的非洲爪蟾卵母细胞中确认了 CaCC活性的层析谱图，图1的C为粗制吉托宁的SDS-PAGE结果。
图2为示出了从粗制吉托宁中分离鉴定单独的吉托宁的方法的图。
图3为单独的吉托宁的阴离子交换及凝胶层析谱图，A为从粗制吉托宁中分离的吉托宁E和吉托宁L流分的阴离子交换层析谱图，B为从上述(A)中获得的吉托宁L流分的凝胶过滤层析谱图，C为吉托宁E流分的阴离子交换层析谱图，D为吉托宁L流分的阴离子交换层析谱图。
图4示出了根据凝胶或连续阴离子交换层析法的单独的吉托宁的洗脱形式，A和C 为纯化的吉托宁El E3及吉托宁Ll L3的凝胶过滤层析谱图，B和D为纯化的吉托宁 El E3及吉托宁Ll L3的阴离子交换层析谱图。
图5为通过凝胶过滤层析法确定吉托宁分子量的校正曲线，各个点为使用的标准蛋白质(IgG :160kDa ；BSA :67kDa ； β -乳球蛋白35kDa ；细胞色素C :12kDa ；抑肽酶 6. 5kDa)，箭头为吉托宁。
图6的A为单独的吉托宁的SDS-PAGE，B为上述单独的吉托宁的碳水化合物成分的凝胶染色SDS-PAGE结果。
图7为根据HPAED-PAD层析谱图对单独的吉托宁的碳水化合物成分分析的结果，A 为中性糖(Neutral sugar)的成分分析(标准物质1. L-果糖；2. L-鼠李糖；3. D-阿拉伯糖；4. D-半乳糖；5. D-葡萄糖；6. D-甘露糖；7. D-木糖)，B为氨基糖(Amino sugar)的成分分析(标准物质1. D-半乳糖胺；2. D-葡萄糖胺)。
图8为单独的吉托宁El E3及Ll L3的脂质成分的GC-MS光谱分析结果。
图9示出了处理吉托宁时，在小鼠EAT细胞中的内在的内向性CaCC电流的流动， A示出了在-SOmV支持电位下的吉托宁和人参皂苷的电流流动，B和C分别示出了粗制吉托宁和浓度不同的单独的吉托宁的电流流动。
图10为确认了在处理吉托宁时小鼠EAT细胞中细胞内钙的增加的图表，A确认了在Ca2+缓冲液中培养的混合于Fura-2的EAT细胞中的细胞内的钙随时间增加，B确认了在 Ca2+缓冲液或Ca2+游离缓冲液中培养的混合在Fura-2的EAT细胞中的细胞内的钙随吉托宁浓度增加。
图11示出了根据吉托宁的CaCC活性以及小鼠EAT细胞中与对细胞内钙增加有关的PLC抑制剂、IP3受体拮抗剂及Ca2+螯合剂的效果，A为确认了 CaCC活性根据PLC抑制剂 (U-73343/U-73122)而减少了的电流流动柱状图，B和C分别为确认了 CaCC活性根据1&受体拮抗剂O-APB)及Ca2+螯合剂(BAPTA-AM)而减少了的电流流动柱状图。
图12为在小鼠EAT细胞中，因吉托宁而增加的细胞内钙浓度所相关的活性型或非活性型PLC抑制剂的效果，A为确认了在Ca2+缓冲液中培养的混合在Fura-2的EAT细胞中，细胞内钙的增加被抑制的图表，B为确认了在Ca2+游离缓冲液中培养的混合于Fura-2 的EAT细胞中，根据吉托宁的浓度的不同，细胞内钙的增加被抑制的图表。
具体实施方式
下面，通过实施例更加详细地说明本发明。这些实施例仅是为了例示本发明，本发明的范围不受这些实施例的限制，没有做出解释的部分是本领域技术人员显而易见的。
实施例1从人参中分离粗制吉托宁(crude gintonin)
将购自韩国人参公社(大田，韩国)的20kg的6年根红参(Panax ginseng C. A. Meyer)粉碎成细粉(> 3mm)，加入30L的80%甲醇，在80°C下回流冷凝提取8小时， 然后真空过滤回收上清液。重复3次该过程，收集上清液后进行减压浓缩(总共获得6. 2kg 的甲醇提取物)，用水和正丁醇的混合溶剂(1 1)进行溶剂分离，从而获得水和正丁醇的流分物。(总共获得908g正丁醇流分物)。
浓缩上述正丁醇流分物(粗制总皂苷流分，CGSF)，使用氯甲烷甲醇水 (CHCl3 MeOH H2O = 13 7 2)的混合溶剂洗脱，实施硅胶柱层析法，分离成8个流分后，对各个流分物实施非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)内在的钙依赖性氯离子通道(Ca2+-activated Chloride Channel ；CaCC)的活性实验，对显示出CaCC活性最高的第7 流分(参照图1的B)再使用乙酸乙酯乙醇水^tOAc EtOH H2O = 1 3 0. 5) 的混合溶剂洗脱，实施硅胶柱层析法，获得2个流分。
然后利用过量的蒸馏水(distilled water, Dff)和Spectra/Por透析膜(分子量减少 6，000 8，000)(光谱实验室，公司.，加利福尼亚，USA (Spectrum Laboratories, Inc.， Califoinia，USA))对上述2个流分物中的在EAT(埃利希腹水瘤，Ehrlich Ascites Tumor) 细胞中的细胞内钙释放实验评价和在非洲爪蟾卵母细胞中显示出强的CaCC活性的流分物 II在4°C下实施透析8小时，然后去除人参皂苷及其它低分子物质，最终获得流分物。
对上述获得的流分物实施电泳(SDS-PAGE)的结果，染成考马斯亮蓝，确认了其表观(apparent)分子量约为13kDa。这暗示了在EAT细胞中的细胞内钙释放实验评价和在非洲爪蟾卵母细胞中引起CaCC活性的新型物质为一种并非人参皂苷的蛋白质，将上述蛋白质命名为吉托宁(gintonins)，将由此获得的最终流分物称为粗制吉托宁(crude gintonis)0
但是含有人参的蛋白质或多糖类的水流分物和含有脂质(lipid)成分的石油醚流分物，在EAT细胞中的细胞内钙释放实验和非洲爪蟾卵母细胞中完全没有CaCC活性效果 (未图示)。
实施例2.分离单独的吉托宁(gintonin)
为了从粗制吉托宁(crude gintonin)中分离出单独的吉托宁(gintonins)，将上述实施例1中获得的粗制吉托宁溶解于磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline,PBS) (pH7. 2)中，实施装有DEAE琼脂糖CL-6B柱的阴离子交换树脂层析法(GE医疗保健，乌普萨拉，瑞典(GE Healthcare，Uppsala，Sweden))，获得 2 个主要的峰(major peak)。此时，溶剂使用溶解有0至2M的NaCl的PBS，以Iml/分钟的流速在280nm处边监测边采用线性梯度(linear gradient)方式进行分离，获得2个峰，将上述2个峰分别命名为吉托宁E(初期的洗脱吉托宁(early eluted gintonin))和吉托宁L (后期的洗脱吉托宁(late eluted gintonin))。
用CentriVap DNA 真空浓缩仪(Labconco，密苏里(Missouri)，USA)浓缩上述吉托宁E和吉托宁L流分物，然后将PBS (pH7. 2)作为洗脱液，利用休珀代克斯(Superdex) 75 凝胶过滤柱以0. 5ml/分钟的流速在280nm处边监测边实施层析法，获得分子量大的主峰 (major peak)和副峰(minor peak)(参照图 3 的 B)。
在确认了这样获得的吉托宁E和L在非洲爪蟾卵母细胞中显示CaCC活性后，再使用 20mM 的 Tris-HCl (pH8. 2)，其含有 100、150、200、250mM 的 NaCl，以不连续梯度(step gradient)DEAE 阴离子交换柱(anion exchange columm ；HiTrap DEAE FF，lml)，并以 lml/分钟的流速进行装载，从而获得4个峰(参照图3的C)。其中，对100、150及200nM 的NaCl洗脱液的流分物进行大量透析(extensive dialysis)和浓缩，然后再使用20mM的 Tris-HCl (pH8. 2)，其含有0至IM的NaCl，实施不连续梯度DEAE阴离子交换柱，最后实施休珀代克斯75凝胶过滤层析法，分别获得3. 7,26. 7及13. 5mg的最终流分物，将它们分别命名为吉托宁E1、E2及E3。
此外，对于吉托宁L流分，采用同上述相同的方法，使用含有150、200、250、300、 400mM的NaCl的PBS (pH7. 2)获得5个峰(参照图3的D)。对于上述5个峰中的150、200 及250mM的NaCl洗脱液的流分物，分别获得7. 4、17. 6及6. 6mg的最终流分物，分别将它们命名为吉托宁L1、L2及L3。
此外，由908g粗制总皂苷流分(CGSF)获得它们的收率分别如下吉托宁El为 0. 0004% (3. 7mg)、吉托宁 E2 为 0. 00 % ( . 7mg)、吉托宁 E3 为 0. 0015 % (13.5mg)、吉托宁 Ll 为 0. 0008% (7. 4mg)、吉托宁 L2 为 0. 0019% (17. 6mg)及吉托宁 L3 为 0. 007%(6. 6mg) ο
实施例3.确定吉托宁的分子量
以山本等的方法(山本，Y.，布目，T.，雅谋之，R.，加藤，K.，和宋，Y. (1995)碳水化合物石if 究杂志 275, 319-332 (Yamamoto, Y. , Nunome, T. , Yamauchi, R. , Kato, K. , and Sone, Y. (1995) Car bohydr Res. 275，319-332))为准，对上述方法获得的各自不同的6个吉托宁实施凝胶过滤层析法来确定它们的分子量，使用装有用PBS(pH7. 2)维持了平衡的休珀代克斯(Superdex) 75 柱(10 X 300mm)的生物 DuoFIowTM 层析法系统(BioLogic DuoFIowTM Chrom atograpgy ；BI0-RAD,加利福尼亚洲，USA))，在280nm处边监测边以0. 5ml/分钟的的流速收集流分物之后，利用由免疫球蛋白G(IgG ;160，OOODa)、牛血清白蛋白(BSA ； 67，OOODa)、β-乳球蛋白(β-Iactoglobulin ;35，OOODa)、细胞色素 C (cytochrome C ； 12, 327Da)及抑肽酶(aprotinin ；6, 512Da)等标准蛋白质组成的校正曲线(cali bration curve)确定分子量。
其结果为，吉托宁所带的电荷不同，因此随NaCl梯度的洗脱，显示出不同的洗脱形式，在凝胶过滤层析法中几乎同时洗脱，且分子量几乎相同(参照图4的B及D)。
此外，利用标准蛋白质确定吉托宁L2的天然(native)分子量仍然是约67kDa(参照图5)，其它吉托宁的分子量也确认是约67kDa(未图示)。
此外，SDS-PAGE的结果，6个吉托宁虽然宽(broad)，但是显示出了单一的主带(single major band)，已石角认其表观分子量(apparent molecular weight)约为 13kDa。
上述结果暗示了本发明的吉托宁为五聚体(pentamer)(参照图6的A)。
实施例4.确定吉托宁的纯度
此外，为了确定上述粗制吉托宁及单独的吉托宁的纯度，使用了 12.0%的分离凝胶(s印arating gel)实施了电泳(SDS-PAGE)(蛋白分离，U. K. (1970)自然227， 680-685 (Laemmli, U. K. (1970)Na ture227，680-685))。
具体地，分别取100 μ g的粗制吉托宁和单独的吉托宁El E3，Ll L3，加载到各个泳道(lane)上实施电泳后，将吉托宁条带进行考马斯亮蓝R-250染色，使其可见。此外， 为了检测出糖蛋白(glycoprotein)将凝胶采用PAS染色(过碘酸-雪夫染色(periodic acid-schiff based staining))法染色，在40%的乙醇-7%醋酸水溶液中培养30分钟，然后在过碘酸-3%醋酸中培养1小时，然后去除过碘酸添加雪夫(SchifT)试剂培养1小时。被染色的糖蛋白条带呈粉红色，用7. 5%的醋酸将PAS染色的凝胶进行浸湿(soaking) 后保存。
实施例5.分析吉托宁的氨基酸组成
为了分析基本氨基酸(general amino acid)，将30 μ g的吉托宁在真空下(in vacuo)用6N的HCl于110°C水解M小时。此外，为了分析半胱氨酸(cysteine)，使吉托宁进行过氧化反应(peroxidation)，然后用6N的HCl于110°C下水解M小时，然后用甲酸过氧化氢(10 1)溶液进行处理，为了分析色氨酸(trypophan)，将试样用4M的甲磺酸(methanesulfonic acid)溶液处理进行水解，然后加入4M的Κ0Η。
此外，委托大田的韩国基础科学支援研究院，使用装有沃特世Nova-PakClS柱 (Waters Nova-Pak C18 column ；3. 9 X 300mm)的 HPLC (休利特帕卡德 1100 系列(Hewlett Packard 1100 series))，对隐藏在异硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate，PIT0C)衍生物中的氨基酸进行分析。
按照标准采用使用了牛血清白蛋白(BSA)的布拉德福德法(布拉德福德，M, M. (1976)分析生物化学杂志 72, 248-254 (Bradford, Μ. Μ. (1976). Anal. Biochem. 72， 248-254))确定了蛋白质成分。
实施例6.吉托宁的部分氨基酸序列
吉托宁的N-末端氨基酸序列使用自动化埃德曼分解应用生物系统模型477A 气象蛋白序列(automated Edman degration on an App lied Biosystem model 477A gas-phase protein sequence)及密里根 6600 固相序列(MilliGen 6600solid_phase sequence)来实施。
使用12%的分离凝胶对100 μ g的吉托宁实施SDS-PAGE，蛋白条带用考马斯亮蓝 R-250进行染色，使其可见。切断上述条带，从胰蛋白酶(trypsin)中蒸解(digesting)出来，将上述蒸解产品(digestion product)进行脱盐(desalt)及浓缩。
这样诱导出的所有肽的MS/MS在韩国基础科学支援研究所中使用装有纳米-ESI 的质谱仪(Mass spectrometer ；QTOF II，Micromass，UK)来实施。此时，使用反射器 (reflector)、微通道板检测器(microchannel plate detector)及固定有时间-数字转换(time-to-digital converter)TOF 7Mir^ (orthogonal TOF analyzer) X^zfe^的离子(product ion)进行分析。，在WindowsNT环境下，使用能够驱动Mass Lynx软件的电脑对数据进行处理，使用BLAST (www. ncbi. nln. nih. gov/BLAST. cgi)对序列同族体进行了检索。
表1显示出了吉托宁重新合成(de novo)氨基酸序列和组成，已确认纯分离的吉托宁是由经自动埃德曼降解的N-末端氨基酸序列组成。但是，吉托宁的N-末端阻塞 (blocking)，不能够获得全部序列，因此采用MALDI-T0F-MS/MS，由使用胰蛋白酶处理的吉托宁推定出18个内部肽序列(internal peptide sequence)的结果为6个单独的吉托宁一般含有几个肽，氨基酸序列与人类葡糖激酶(human glucokinase)及葡糖激酶同工酶 2(glucokinase isoform 2)显示出了部分的相同性(未图示)。
此外，根据Braford法(考马斯亮蓝法)测定的吉托宁总蛋白质的含量在E1、E2、 E3、L1、L2 及 L3 中分别显示为 9. 4,24. 1,20. 5,35. 8,37. 1 及 39. 6%0 吉托宁 Ll L3 的蛋白质含量比吉托宁El约高3倍。
此外，吉托宁中的疏水性氨基酸(hydrophobic amino acid)比亲水性氨基酸 (hydrophilic amino acid)更多，未检测出组氨酸(His)和酪氨酸(Tyr)及蛋氨酸(Met)。 其中认为未检测出蛋氨酸是因为吉托宁的N-末端阻塞。
此外，El E3及Ll L3中共同地显示出苯丙氨酸(Phe)的含量最高。此外，显示出吉托宁Ll L3中的赖氨酸(Lys)比El E3要高(参照表1)。
表1本发明吉托宁的氨基酸组成(％ )
氨基酸ElE2E3LlL2L3CYA2.903.871.290.971.140.94ASX8.278.606.111.893.713.98GLX6.677.224.572.434.894.25Ser4.574.293.292.295.003.59Gly12.4013.6711.5512.8811.5710.56His0.000.000.000.000.000.00Arg1.681.851.190.631.691.10Thr3.113.292.201.371.461.79Ala5.626.983.594.524.074.67Pro4.524.903.303.183.094.86Tyr0.000.000.000.000.000.00Val3.133.893.743.994.686.00Met0.000.000.000.000.000.00lie6.035.167.5410.368.837.76Lue3.965.093.434.266.8310.09Phe26.4018.6635.1028.8921.3722.47Trp3.597.103.624.888.136.10Lys7.145.429.7817.4813.5611.85但，上述CYA是半胱氨酸和胱氨酸的总和，ASX是天冬酰胺和天冬氨酸的总和， GLX是谷氨酰胺和谷氨酸的总和。
实施例7.分析吉托宁的碳水化合物组成
如图6的A所示，SDS-PAGE中吉托宁的条带是单一(single)的，但宽(broad)，没有被考马斯亮蓝染成很深的颜色，因此有可能含有碳水化合物。
因此，为了确认吉托宁的碳水化合物组成，用2M的三氟醋酸(trifluoroacetic acid)在100°C下水解4小时，然后获得中性糖(neutral sugar)，并且将吉托宁在玻璃安瓿(ampule)中用6N的HCl在100°C下水解4小时，获得氨基糖(amino sugar)和酸性糖 (acid sugar)。
委托位于首尔的世宗大学碳水化合物材料研究所，采用PAS染色(过碘酸-雪夫染色(periodic acid-schiff based staining))法进行染色后，使用装有 CarboPac PAl柱的HPAEC-PAD系统(高效阴离子交换色谱法-脉冲安培检测系统((high performance anion exchange chromatography-plused amphermetric dectection system)；离子色i普仪(Dionex)，加利福尼亚，USA)，对吉托宁的碳水化合物组成进行分析。单糖类的摩尔重量(molar weight)由峰的面积(peak area)计算，中性糖的情况下，用苯酚-磺酸法(亨赛尔，E. F.，戴维斯，M. J.，和史密斯，K. D. (1997)蛋白质实验指南手册，胡玛纳出版社， Totawa,803-804(Hounsel1, E. F. , Davies,M. J. ,and Smith,K. D. (1997)Protein protocol handbood，Humanna press, Totawa,803-804))确定碳水化合物的含量，对于酸性糖，则使用蒽酮(Anthrone)法确定碳水化合物的含量(斯科特，T.A.，和梅尔文，E.H. (1953) 分析生物化学.25，1656-1660 (Scott，Τ. Α.，and Melvin, Ε. H. (1953) Anal. Biochem. 25， 1656-1660))ο
其结果，确认了吉托宁由鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、葡萄糖 (glucose)、甘露糖(mannose)、木糖(xylose)等5个其它种类的中性糖(neutral sugar) 和葡萄糖胺(glucosamine)等1个氨基糖(amino sugar)构成，6个吉托宁相互具有几乎类似的碳水化合物组成(参照表2及表7)。但在吉托宁El E3中未检测出甘露糖。
此外，未检测出I-N-乙酰基-神经氨酸(1-N-acetyl-neuramic acid)、2_半乳糖醛酸 O-galactouronic acid)、3_ 葡萄糖醛酸(3-glucouronic acid)等酸性糖(未图示)°
最后，吉托宁的总碳水化合物含量在吉托宁E1、E2、E3、L1、L2及L3分别显示为约 34. 3,45. 3,38. 1,36. 0,29. 8及45. 2%。由上述结果可以再次确认本发明的吉托宁为糖蛋白质。
表2本发明吉托宁的碳水化合物组成(％ )
权利要求
1.新型糖脂蛋白(glycolipoprotein)吉托宁(gintonins)的制备方法，其包括1)从人参中制备甲醇提取物的步骤；2)用水和正丁醇的混合溶剂分离上述甲醇提取物的步骤；3)使用氯甲烷甲醇水的混合溶剂作为洗脱溶剂，对上述水流分物和正丁醇流分物中的正丁醇流分物实施硅胶柱层析法，分离成8个流分的步骤；4)使用乙醇乙酸乙酯水的混合溶剂作为洗脱溶剂，对上述8个流分物中相对于 CaCC (钙激活氯离子通道(Ca2+-activated Chlo ride Channel))的活性最高的第7流分物实施硅胶柱层析法，分离成2个流分的步骤；及5)透析上述2个流分物中CaCC活性高的流分物II，获得最终产物的步骤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在上述步骤幻之后，还包括下列步骤的单独的吉托宁(gintonin)El、E2、E3、Ll、L2&L3的制备方法6)将最终流分物溶解于含有NaCl的pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline ；PBS)溶液中，实施阴离子交换层析法及凝胶过滤层析法后，分离成2个流分的步骤；及7)将上述2个流分物分别用含有NaCl的pH8.2的Tris-HCl和含有NaCl的pH7. 2的磷酸盐缓冲盐水(PBQ溶液实施阴离子交换层析法，分离单独的糖脂蛋白的步骤。
3.根据权利要求1所述的新型糖脂蛋白(glycolipoprotein)吉托宁(gintonins)的制备方法，其特征在于，所述人参选自红参、水参、白参、栽培参、长脑参及山参。
4.从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白吉托宁El、E2、E3、Li、L2及L3，其特征在于，由权利要求2的方法制得，分子量为67kDa，是表观分子量为13kDa的五聚体(pentamer)。
5.根据权利要求4所述的从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白吉托宁，其特征在于， 所述糖脂蛋白含有作为氨基酸组成成分的半胱氨酸和胱氨酸(cysteine and cystine), 天冬酰胺和天冬氨酸(asparagine and aspartic acid)、谷氨酰胺和谷氨酸(glutamine and glutamic acid)、丝氨酸(serine)、甘氨酸(glycine)、精氨酸(arginine)、苏氨酸threonine)、丙氨酸(alanine)、脯氨酸(proline)、缬氨酸(valine)、异亮氨酸 (isoleucine)、亮氨酸(leucine)、苯基丙氨酸(phenylalanine)、色氨酸(tryptophan)及赖氨酸(lysine)。
6.根据权利要求4所述的从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白吉托宁，其特征在于，所述糖脂蛋白含有作为碳水化合物组成成分的鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、 葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、木糖(xylose)、氨基葡萄糖(glucosamine)。
7.根据权利要求4所述的从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白吉托宁，其特征在于，所述糖脂蛋白含有作为脂质组成成分的亚油酸(linoleic acid)、棕榈酸(palmitic acid)、 油酸(oleic acid)及硬脂酸(stearic acid)。
8.含有权利要求4的糖脂蛋白作为有效成分、用于对因钙浓度降低而引起的疾病的预防及治疗的药物组合物，其中，所述因钙浓度降低而引起的疾病选自精神分裂 (Schizophrenia)(Alzheimer' s Disease) >^ ! ^! (Hungtington' s Disease)、遗传性偏瘫型偏头痛(Familial hemiplegic migraine)、癫痫(Eil 印 sy)、发作性共济失调(印isodic ataxia)、脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxias)及因钙不足引起的成长阻碍。
9.含有权利要求4的糖脂蛋白及食品学上允许的食品辅助添加剂的健康功能食品。
全文摘要
本发明涉及从人参中分离鉴定并制备新型糖脂蛋白(glycolipopr otein)吉托宁(gintonin)的方法和根据上述方法从人参中分离鉴定的新型糖脂蛋白吉托宁及上述新型糖脂蛋白吉托宁的用途。本发明的新型糖脂蛋白吉托宁暂时地诱发细胞质内游离Ca2+(Free Ca2+)的增加，由于细胞内钙浓度增加，使非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)内在的钙依赖性氯离子通道(CaCC)活化，从而增加细胞内钙浓度，因此不仅能够有效地用于因钙浓度降低导致的疾病的预防及治疗，而且在强壮作用、免疫力增加、性功能强化、神经系统保护及活化、血管的新生、抗糖尿作用等细胞内钙依赖性的各种生理活性等方面也显示出了优异的效果。
文档编号A61K36/258GK102549010SQ201080037316
公开日2012年7月4日 申请日期2010年8月12日 优先权日2009年11月17日
发明者崔善惠, 李昞焕, 罗承烈, 表美景, 辛太俊 申请人:建国大学校产业协力团