靶向治疗的制作方法

专利名称：靶向治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含磁性材料的细胞，特别是巨噬细胞，以及其在肺 瘤治疗中的用途。
背景技术：
近年来，出现了关于支持恶性肿瘤生长和扩散的分子机制的重要 的新视点。这推动了许多能够特异性抑制这些异常细胞生理过程的治 疗剂的设计。这些治疗剂通常表现为肽/蛋白质(或低分子量模拟物)的 形式，结合到细胞外蛋白质以抑制其活性(例如，诸如基质金属蛋白酶 的酶类)，或结合到靶细胞内部或表面的分子以修饰其活性(例如膜上 酪氨酸蛋白激酶的功能)。但是，将此类药物的递送靶向并限制在肿瘤 部位的尝试被证实在很大程度上是不成功的，很多仅显示出对于肿瘤 的有限渗透，并在临床试验中因其对非恶性组织的不良影响而显示显 著的副作用。克服靶向递送中的这个问题被认为对于这类药物的长期 及有效应用非常重要。
更近一些，多种形式的癌症基因治疗尝试将抗肿瘤基因转移到肿 瘤中的把细胞(例如，肿瘤细胞或血管中的内皮细胞)。这种方法在癌 症治疗中发挥有效作用的的可能性通过最近人类基因组的表征和基因
转移技术的改进而增加。实际上，超过150项的这种抗癌基因治疗的 临床试验在进行中。策略包括用其野生型副本替代突变的或缺失的胂 瘤抑制基因，抑制原癌基因(或其下游效应器)的表达/活性以及将编码 细胞毒性蛋白、前药激活酶、免疫调节蛋白或抗血管生成蛋白的基因 递送至肿瘤部位(在Koumklis, 2000中被综述)。尽管使用了大量的的 病毒或非病毒载体将这些基因递送至肿瘤，但只取得有限的成功；主 要的障碍是肿瘤特异性递送系统的开发(Vile等人，2000)。因此，许 多抗癌基因治疗的方案包含局部给予载体(例如，用针直接将载体注入
6原发肿瘤或其血管供给中)。这对患有播散性疾病的患者的适用性有 限，因为转移瘤经常是检测不到的、数目太多和/或通过直接注射难以 达到的。曾尝试过一种可选择的的方法以全身递送载体(从而使其既能 运至原发性肿瘤，又能运至转移性肿瘤)，但通过将治疗基因置于对肺 瘤特异的条件产生反应的启动子(或其一部分)的控制之下，使基因表
达限定在所述肿瘤部位(Brown， 2000)。 一种这样的信号可以是低氧(低 氧)。
氧微电极(Oxygen microelectrodes)已经被广泛应用于测量人类胂瘤 中的氧水平。这些研究表明，在包括脑肿瘤、乳腺肿瘤、子宫颈瘤、 头/颈部肿瘤和软组织肉瘤(在内的不同的肿瘤类型中，存在着很多低 氧(低氧)和缺氧(无氧)区域(Vaupel等，I989; Brown， 2000)。正常组 织通常具有30-70毫米汞柱的中位氧张力(median oxygen tensions),而 所有检测的实体瘤中超过半数呈现低于10毫米汞柱的中值(不足正常 范围测量值的10%)。出现这些低氧/缺氧区域是因为胂瘤中新形成的 血管常常由于很多盲端、不完全的内皮内衬和基底膜是紊乱的，并有 断裂崩解的倾向(Brown&Giaccia， 1998)。因此，血液流动緩慢且不规 则，氧和营养物质到肿瘤的很多区域的递送是不足的。在这些新血管 周围的肿瘤细胞的快速扩张和氧消耗也促成了低氧水平的形成，尽管 一旦达到低氧的阈值浓度，在那个区域的胂瘤细胞会停止增殖并转为 无氧糖酵解产生能量(由Brown， 2000综述)。
许多研究表明，在肿瘤中大的低氧区域的存在与不良的预后相关。 这被认为是因为低氧的肿瘤细胞对于诸如放疗和化疗的常规抗癌治疗 相对耐受。氧充足的肿瘤细胞对于放疗的反应比低氧的肿瘤细胞要显 著得多，因为氧自由基会增强由电离辐射诱发的蛋白质与DNA损伤。 大多数抗癌化疗剂只能杀死快速增殖的肿瘤细胞，所以胂瘤中的非增 殖性低氧部分对于化疗剂的作用是相对耐受的。已知处于这种非增殖 性状态时，低氧肿瘤细胞还会分泌细胞因子和酶以诱导肿瘤内新血管 的生长，从而提供肿瘤生长的氧和营养，以及增加的肺瘤细胞进入全 身循环的路径。低氧也对肿瘤细胞产生了选择性压力，因为只有那些 具有侵袭表型(例如，肿瘤抑制基因p53突变)的肿瘤细胞才能在低氧中存活，继续重定居于肿瘤并转移到远隔部位(Brown & Giaccia, 1998; Brown， 2000)。由于常规的抗癌药物和基因载体相对无法进入这些低氧 区域(因为缺少血液供给)，需要能够深入肿瘤中这些区域的治疗方式。
最近的研究表明，从血流以恒速进入人类肺瘤并随后分化成为巨 噬细胞的单核细胞在这些低氧/坏死区域快速积聚(Leek等人，1996; Burton等人，2001, Burke等人，2003)。巨噬细胞可以作为针对低氧胂 瘤部位的靶向基因治疗的递送载体的想法已经得到研究。在该方法中， 自体的巨噬细胞用治疗性基因"武装(armed)" (Griffiths等人，2000), 该治疗性基因的表达被低氧所诱导。因此，巨噬细胞可以取自给定的 癌症患者的血流，离体分化成巨噬细胞，转染入低氧激活的治疗性基 因，并重新输注给患者。然后这些转染的巨噬细胞从血流中进入原发 性肿瘤(以及存在于身体任何部位的继发性肺瘤)，并在低氧肿瘤部位 积聚。当转染低氧调节基因(例如，诸如细胞色素P450的前药激活酶) 的巨噬细胞与乳腺肿瘤多细胞球状体(来自乳腺肿瘤细胞系的体外生 长的小3-D肿瘤块)共培养时，他们迅速迁移到这些小肿瘤块的内部低 氧区域，并表达转基因。当MTS暴露于前药环磷酰胺时，在MTS中 心的低氧巨噬细胞表达的P450酶将所述的前药转化成其具有活性、细 胞毒性的代谢产物。该产物随后从巨噬细胞(其是非分裂细胞，因此耐 受该产物的作用)中扩散出，被肿瘤细胞摄取，并嵌入其DNA中，导 致肺瘤细胞在随后的有丝分裂中死亡(Griffiths等人，2000)。
然而，至今几乎没有证据表明，当离体培养的巨噬细胞再注射给 荷瘤小鼠时，它能够被大量运至所述肿瘤部位。实际上，刺激后在体 外对肿瘤细胞有细胞毒性作用(例如，通过暴露于离体细胞因子)的巨 噬细胞在重新输注给荷瘤小鼠(Bartholeyns等人194 & 1996)或癌症患 者(Andreesen等，1998)后，迅速被截留于肝脏、肺以及肾脏的有孔毛 细血管中。
由上可见，需要将巨噬细胞靶向病变物，例如，肺瘤。 发明描述
根据本发明的第 一方面，提供包含磁性材料的单核细胞或单核细
8胞来源的细胞。
本发明中所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，在下文中被称 为"细胞"，用作将治疗剂靶向病变物的载体。此外，本发明中的细胞
可用于肿瘤的热处理，例如，高热(hyperthermia)。
所述单核细胞来源的细胞优选巨噬细胞。本发明中的巨噬细胞可 用于治疗诸如肿瘤的病变物，这是因为(i)其能够很容易地穿透内皮细 胞壁，(ii)其自然地迁移入并聚积于血管不发达的区域，例如肿瘤中， 以及(iii)既然磁性材料是在细胞载体，即巨噬细胞内，可以避免由于磁 性材料的积聚而在靶区域的血管形成栓塞的可能性。
本文使用的表述"磁性材料"指当暴露于热驱动或物理驱动的^f兹场 时的材料所述磁性材料优选表现为磁性颗粒的形式，例如微米颗粒或 者纳米颗粒。可选择地，所述i兹性材料可以是流体，例如，其中的义兹 性颗粒是悬浮状态的流体，或铁磁流体。
石兹性颗粒通常为5求形或椭圓形，平均尺寸在lnm至10 /mi之间。 所述颗并立的平均尺寸可以在5nm至10/mi之间，例如10nm至1 /mi。 优选地，所述颗粒是纳米颗粒，其平均尺寸或直径为，例如，5000 nm 或更小，比如1 nm至5000 nm，优选1 nm至1000 nm，更优选1 nm 至300nm，或2nm至10nm。
石兹性材料可以是有固有磁性的，或者可选择地，可以是在i兹场中 起反应的材料。所述磁性材料可以是铁磁的(ferromagnetic)、反铁磁的 (antiferromagnetic)、 亚牵失》兹合々 (ferrimagnetic) 、 4元亚l失石兹 (antiferrimagnetic)的或者超力l页》兹的(superparamagnetic)。戶斤述i兹寸生材料 可以包括元素铁、铬锰、钴、镍或其化合物。铁化合物可以是选自包 括磁铁矿(Fe304)、磁赤铁矿(YFe203)和硫复铁矿(Fe3S4)，或其任一组 合的组的铁盐。铬化合物可以是二氧化铬。
/磁性材料可以包含生物相容性包被(coating)。该生物相容性包被 可以是例如金的金属、合成材料或生物材料或其组合。合成的包被可 以是聚合物、共聚物或其组合。所述聚合物可以包括葡聚糖、聚乙烯 醇(PVA)、聚乙烯亚胺(PEI)或二氧化硅。所述生物相容性包^皮可以含 有生物分子，其功能是促进磁性颗粒粘附于本发明中的单核细胞或单
9核细胞来源的细胞。可以用于促进粘附的分子的实例包括RGD (包含 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列基序的合成肽)、转铁蛋白、胶原、纤连 蛋白/纤维蛋白、离子通道受体、细胞特异性整联蛋白受体或任何细胞 表面抗原。
如本发明所述的细胞可以包含可检测剂和/或治疗剂。所述可检测 剂可以是与治疗剂连接的可检测标签。优选地，所述可检测剂可以通 过MRI显影。
在本发明细胞的优选方面，优选含有治疗剂的本发明的巨噬细胞。 本文使用的术语"治疗剂"意在包括对治疗有用的任一试剂。所述治疗 剂可以包括化疗剂、放疗剂，或者基因或其一部分(用于基因治疗)。
化疗剂可以是选自下列组中的试剂，所述组由S期依赖的抗代谢 物，如卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞香、多柔比星(doxorubicin)、氟 达拉滨、氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、巯嘌呤、 曱氨蝶呤、泼尼松、丙卡巴肼(procarbazine)、硫鸟嘌呤；M期依赖的 诸如长春碱、长春新碱、长春瑞滨的长春花生物碱类，如依托泊苷 (etoposide)、替尼泊苦的鬼臼毒素类，如多西他赛(doxetaxel),紫杉醇 的紫杉烷类；G2期依赖的化疗剂，如博来霉素、伊立替康、米托蒽醌、 托泊替康(topotecan); Gl期依赖的化疗剂，如门冬酰胺酶；皮质激素 类；烷化剂，如氮芥(mechlorethamine)、氮芥(mustargen)、环磷酰胺、 异环磷酰胺和苯丁酸氮芥(clorambucil)、瘤可宁(leukeran)的氮芥类， 亚硝基脲(nitrosoureas)类；如顺柏，顺氯氨铂(platinol),卡铂，伯尔定 (paraplatin)的柏类试剂；抗代i射类化疗剂；天然治疗产品；抗肿瘤抗 生素类；蒽环类；鬼臼乙叉甙类(epipodophyllotoxin);植物长春花生物 碱类；紫杉烷类；喜树碱，美法仑，卡莫司汀，曱氨喋呤，5-氟尿嘧 咬，巯噪呤；柔红霉素；多柔比星；表柔比星；长春碱；长春新碱； 放线菌素D;丝裂霉素C;紫杉醇；L-门冬酰胺酶；G-CSF;依托泊 苷；^大水仙4成；曱磺酸去纟失胺(deferoxaminemesylate)或其组合组成。
放疗剂可以包含选自钼-99，锝-99m，铬-51，铜-64，镝-165,镱 -169,铟-111,碘-125，硖-131，铱-192，铁-59，磷-32,钾-42，铑-186， 铼-188，钐-153，石西-75,钠-24,锶-89，氙-133,氙-127和钇-90或其
10组合的放射性核素。
化疗剂或放疗剂可以与抗体结合，例如，单克隆抗体。
治疗剂可以包括DNA、 RNA、干扰RNA(RNAi)、肽、多肽、例 如单克隆抗体的抗体、或诸如单链抗体片段的抗体片段适配子和小分 子。小分子可以包括，但不限于，肽、模拟肽(例如，类肽)、氨基酸、 氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、 分子量低于约IO，OOO克每摩尔的有机的或无机的化合物(即，包括异 种有机化合物和有机金属化合物)、分子量低于约5,000克每摩尔的有 机的或无机的化合物、分子量低于约l，OOO克每摩尔的有机的或无机 的化合物、分子量低于约500克每摩尔的有机的或无机的化合物，以 及这些化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。
优选的，所述治疗剂是基因或其一部分(下文中称为"治疗性基 因，，)。
在本发明的另 一优选方面中，本发明中的细胞还包含应答元件。 本文使用的术语"应答元件"(或，反应元件)意在包含基因或其一部 分，所述元件的表达或活性受;&欠被治疗的病变物的特定条件调控或对 其发生反应。本文使用的"基因的一部分"可以包括基因的可调控元 件，例如，增强子、启动子或其部分。所述应答元件可以可操作地 (operably)连接到治疗性基因，从而可以调控治疗性基因的表达。优选 地，该应答元件包含治疗性基因的全部或部分。仍优选地，所述应答 元件是治疗性基因或其部分。
如本发明所述的应答元件包括低氧诱导元件("低氧反应元件") 和缺氧诱导元件("缺氧反应元件")，其已为本领域所公知的实例包 括但不限于，缺氧诱导因子-l(HIF-l)，活化转录因子4(ATF-4)和转录 因子VL30。低氧诱导的或调控的元件被低氧浓度激活，例如1%至8% 的氧。缺氧诱导的或调控的元件被极低氧浓度激活，例如，低于0.1% 的氧。
所述应答元件可以是肿瘤特异的(下文称为"肿瘤应答元件")， 以使肿瘤应答元件的活性或表达受例如低氧、缺氧、低pH(酸性的)、 高pH(碱性的)、低血糖等肿瘤内部或周围的条件的调控，或对其产生反应。优选地，所述应答元件是如本文中所描述的低氧或缺氧调控的 元件。
如本发明所述的治疗性基因或应答元件包括，但不限于肿瘤抑制 基因、抗原基因、细胞毒性基因、细胞生长抑制基因、细胞因子基因、 趋化因子基因、药用蛋白基因、促凋亡基因、前药激活基因或抗血管 生成基因。
术语"肿瘤抑制基因"是指核苷酸序列，其在靶细胞中的表达能 够抑制肿瘤的表型和/或诱导凋亡。在本发明的实践中有用的肿瘤抑制
基因的实例包括p53基因、APC基因、DPC-4基因、BRCA-1基因、 BRCA-2基因、WT-1基因、视网膜母细胞瘤基因(Lee等人，(1987))、 MMAC-1基因，结肠腺瘤性息肉病蛋白(Albertsen等人，美国专利 5,783,666， 1998年7月21日授权)、结肠癌缺失(DCC)基因、MMSC-2 基因、NF-1基因、位于染色体3p21.3的鼻咽癌肿瘤抑制基因(Cheng 等人，1998. Proc. Nat. Acad. Sci. 95:3042-3047)、 MTS1基因、CDK4 基因、NF-1基因、NF2基因和VHL基因。用于治疗用途的特别优选 的腺病毒是编码p53肿瘤抑制基因的A/C/N/53载体，在授权于1999 年8月3日的Gregory等人的美国专利5,932,210中对所述载体有更全 面的描述，其全部内容通过引用并入本文。
术语"抗原基因"指其在靶细胞中的表达会导致产生能被免疫系 统识别的细胞表面抗原蛋白的核苷酸序列。抗原基因的实例包括癌胚 抗原(CEA)和p53 (如在公布于1994年2月3日的Levine， A. PCT国际 公布WO94/02167中，所描述的)。为促进免疫识别，抗原基因可以与 MHC-I类抗原融合。优选地，所述抗原基因来自肿瘤细胞特异的抗原。 理想的，为肿瘤排斥性抗原。肿瘤排斥性抗原在本领域内是公知的， 例如但不限于，MAGE、 BAGE、 GAGE和DAGE肿瘤排斥性抗原家 族，参见Schulz等人，Proc Natl Acad Sci USA, 1991， 88， pp991-993。
肿瘤细胞产生许多肿瘤细胞特异性抗原，且其中 一些呈现在肿瘤 细胞表面，这已^皮知晓多年。这些抗原通常浮皮称为肺瘤排斥性抗原， 其来源于被称为肺瘤排斥性抗原前体的更大的多肽。肺瘤排斥性抗原 经由HLA，s呈递给免疫系统。所述免疫系统将这些分子识别为异物，
12并天然地选择与破坏表达这些抗原的细胞。如果转化细胞逃脱了监#见 并定居下来，则会发生肿瘤。已经开发出基于优势的肿瘤排斥性抗原 的疫苗，用以为个体提供针对肿瘤形成的预成的防御。
术语"细胞毒性基因"指其在细胞中的表达产生毒性效应的核苷 酸序列。这种细胞毒性基因的实例包括编码假单胞菌外毒素、荒麻毒 素、白喉毒素以及诸如此类的核苷酸序列。
术语"细胞生长抑制基因"指其在细胞中的表达可造成细胞周期
阻滞的核苷酸序列。这种细胞生长抑制基因的实例包括p21,视网膜 母细胞瘤基因，E2F-Rb基因，编码周期素依赖性蛋白激酶抑制物的基 因，如p16、 p15、 p18和p19、如在Branellec等人(PCT公布号 W097/16459，公布于1997年5月9日以及PCT公布号WO96/30385, 公布于1996年10月3日)描述的生长阻滞特异的同源异型框(GAX)基 因。
术语"细胞因子基因"指其在细胞中的表达可产生细胞因子的核 苷酸序列。这种细胞因子的实例包括GM-CSF，白介素，特别是IL-1、 IL隱2、 IL-4、 IL-12、 IL-IO、 IL-19、 IL-20, a、 /3和y亚型干扰素，复 合干扰素，特别是干扰素a-2b和诸如干扰素a-2a-l的融合物。
术语"趋化因子基因，，指其在细胞中的表达可产生细胞因子的核 苷酸序列。术语趋化因子指一组由细胞分泌的结构上相关的低分子量 细胞因子，其具有促有丝分裂、趋化以及炎症作用。他们主要为含70 至100个氨基酸残基的阳离子蛋白质，共享四个保守的半胱氨酸。基 于两个氨基端半胱氨酸的间距，可以将这些蛋白质分为两组。在第一 组中，所述两个半胱氨酸被单个残基分隔(C-x-C)，而在第二组中，他 们是相邻的(C-C)。 'C-x-C，趋化因子成员的实例包括，但不仅限于，血 小板因子4(PF4)、血小板碱性蛋白(PBP)、白介素-8(IL-8)、黑色素瘤 生长刺激激活蛋白(MGSA)、巨噬细胞炎症蛋白2 (MIP-2)、小鼠Mig (ml 19)、鸡9E3 (或pCEF-4)、猪肺泡巨噬细胞趋化因子I和II(AMCF-I 和-II)、前B细胞生长刺激因子(PBSF)和IPIO。 'C-C，组成员的实例包 括，但不仅限于，单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-2)、单核细胞趋化蛋白3 (MCP-3)、单核细胞趋化蛋白4 (MCP-4)、巨噬细胞炎性蛋白la (MIP- l-a)、巨谨细胞炎性蛋白1/3 (MIP-l-j8)、 巨噬细胞炎性蛋白l-7(MIP-l-力、巨噬细胞炎性蛋白3a(MIP-3-a)、巨 噬细胞炎性蛋白3j8(MIP-3-i3)、趋化因子(ELC)、巨噬细胞炎性蛋白-4 (MIP画4)、巨噬细胞炎性蛋白5(MIP-5)、 LD78j3、 RANTES、 SIS-epsilon (p500)、胸腺和活化调节趋化因子(TARC)、嗜酸性粒细胞趋化因子、 1-309、人类蛋白HCC-l/NCC-2、人类蛋白HCC-3、小鼠蛋白CIO。
术语"药用蛋白基因"指其表达可在靶细胞中产生具有药学效果 的蛋白质的核苷酸序列。药用蛋白的实例包括前胰岛素基因及类似物 (如PCT国际专利申请W098/31397中所描述的)、生长激素基因、多 巴胺、5-羟色胺、表皮生长因子、GABA、 ACTH、 NGF、 VEGF(以增 加靶组织的血液灌注和诱导血管生成，7>布于1998年6月30日的PCT 公布W098/32859)、血小板反应素等。所述药用蛋白基因还包括免疫 反应性蛋白，诸如抗体、Fab片段、Fv片段、人源化抗体、嵌合抗体、 单链抗体以及非人类来源的人抗体。
术语"促凋亡基因"指其表达可诱导细胞的程序性细胞死亡通路 的核苷酸序列。促凋亡基因的实例包括p53,腺病毒E3-11.6K (10.5K)， 腺病毒E4或f4基因，p53通路基因以及编码半胱氨酸蛋白酶(caspases) 的基因。
术语"前药"指任何非治疗性化合物，其是能够被转化为治疗性 化合物的潜在的治疗性化合物。术语"前药活化基因"指核苷酸序列， 其表达导致可以把非治疗性化合物(即前药)转化为治疗性化合物(即药 物)的蛋白的产生，该治疗性化合物可以使细胞对于外部因素的杀伤易 感，或者造成细胞内的毒性环境。前药活化基因的一个实例是胞嘧啶 脱氨酶基因。胞嘧啶脱氨酶将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶，后者是 一种潜在的抗肿瘤剂。肿瘤细胞的裂解使胞嘧啶脱氨酶在局部突然增 加，所述胞嘧啶脱氨酶能够在所述肿瘤局部位点将5-FC转化成5-FU， 致使很多周边肺瘤细胞被杀死。这导致大量肿瘤细胞被杀死，而不需 要用腺病毒感染这些细胞(所谓的"旁观者效应(bystander effect)")。 另外的实例是胸香激酶(TK)基因(参见，例如，于1997年5月20曰授 权的Woo等人的美国专利5，631，236和于1997年2月11日授权的Freeman等人的美国专利5,601,818),其中表达所述TK基因产物的细 胞对通过使用丙氧鸟苷的选择性杀伤是敏感的。前药活化基因可以是 低氧调控基因，细胞色素p450。
术语"抗血管生成基因，，指其表达造成抗血管生成因子的细胞外 分泌的核苷酸序列。抗血管生成因子包括血管生成抑制素，诸如Tie2 (如PNAS(USA)(1998) 95:8795-8800所述)、内皮抑素的血管内皮生长 因子(VEGF)抑制因子。
对本领域技术人员显而易见的是，修饰或缺失上述引用基因以编 码野生型蛋白质的功能性亚片段，可以较好地适合用于本发明的实践 中。例如，提及p53基因时不仅指野生型蛋白，也指修饰的p53蛋白。 所述修饰的p53基因的实例包括修饰p53以增加其核滞留，缺失诸如 □ 13-19位氨基酸以去除钙蛋白酶共有切割位点(Kubbutat和Vousden (1997) Mol. Cell. Biol. 17:460-46)， modifications to the oligomerization domains(对寡聚化结构域的修饰)(如Bracco等人在PCT公布的申请 WO97/0492或美国专利5,573,925等中所述)。
对本领域技术人员显而易见的是，上述治疗性基因可以通过包含 诸如信号肽或核定位信号(NLS)的靶向部分，被分泌到基质中或定位于 特定的细胞内位置。治疗性转基因的定义也包括治疗性转基因与I型 单纯疱瘆病毒(HSV-I)结构蛋白VP22的融合蛋白。当在感染细胞内合 成时，含有VP22信号的融合蛋白被运输出感染细胞，并有效地进入 直径大约16个细胞宽度的周围的非感染细胞。因为融合蛋白能够被有 效地运送至周围细胞的细胞核中，所以该系统特别用于与转录激活蛋 白(如p53)联合。参见，例如，Elliott, G. & O'Hare, P. Cell. 88:223-233:1997; Marshall, A. & Castellino, A. Research News Briefs. Nature Biotechnology. 15:205:1997;公布于1997年2月13日的O'Hare， W a/. PCT公布WO97/05265。在Vives & a/.(1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017中也描述了来源于HIV Tat蛋白的类似的靶向部分。
在本发明的另 一方面，提供了如本发明所述的诸如巨噬细胞的细 胞用作药物。
在本发明的另一方面，提供了包含如本发明所述的细胞，优选巨
15噬细胞的药物组合物。给予时，本发明的药物组合物以药学上可接受 的制剂给予。这种制剂可以常规包含药学上可接受浓度的盐类、緩冲 剂、防腐剂、相容性载体、诸如佐剂的辅助免疫增效剂和细胞因子， 以及任选的其他治疗剂，例如化疗剂。
本发明所述的治疗可以通过任何常规的途径来实施，包括注射或 者随时间徐徐输注。给药方式可以是，例如，口服、静脉给药、腹腔 给药、肌肉内给药、腔内给药、皮下给药或者透皮给药。
本发明中的组合物以有效量给予。"有效量"是指产生预期反应的 单独的或与进一步的剂量合计的组合物的量。在癌症治疗中，预期反 应是疾病进程的抑制。这可以包括仅仅临时减慢疾病进程，尽管更优 选的是，它包括永久地终止所述疾病的进程。其可通过常^见方法;险测 或根据本发明中所讨论的诊断方法检测。
当然，所述数量依赖于治疗的特定状态，所述状态的严重程度， 包括年龄、身体状况、体型和体重的患者个体参数，治疗的持续时间， 同步治疗的性质(如果有的话)，特定的给药途径和以医疗人员的知识 和经验所能考虑到的类似因素。这些因素为本领域内普通技术人员所 熟知，并且可以仅用常规试验处理。通常,，优选使用个别成分或其组 合的最大剂量，即，根据可靠的医学上的判断得出的最高安全剂量。 然而，如本领域技术人员所能理解的，病人可能因为医学上的、心理 上的理由的或者事实上其他任何理由，坚持使用较低的剂量或者耐受 剂量。
在前述方法中使用的药物组合物优选灭菌的且含有有效数量的核 酸，以适于给药的重量或体积单位给予病人，以产生预期反应。所述 反应可以，例如，通过检测肿瘤的消退、疾病症状的减轻、凋亡的调 节等进行衡量。
给予个体的治疗剂剂量可以依照不同的参数选择，特别是根据所 用的给药方式以及个体的状态。其他因素还包括预期的治疗周期。如 果在应用的起始剂量时个体的反应不足，可使用更高剂量(或者通过不 同的更局限的递送途径，达到更高的有效剂量)，直到患者耐受性所能 允许的程度。
16一般而言，通常配制1 nM-1抖M的治疗剂的剂量，并以标准程序 给药。优选地，剂量可以在1 nM-500 nM、 5 nM-200 nM、 10 nM-100 nM 变动。其他用于组合物给药的方案对本领域普通技术人员是公知的， 其中剂量、注射程序、注射部位、给药模式(例如，瘤内)等等，与前 面所述的有所差别。给予哺乳动物而非人类组合物(例如，为了实验目 的或是兽医治疗目的)，在与上述基本上相同的条件下进行。本文所用 的个体，是指哺乳动物，优选人类，并且包括非人灵长类动物，牛、 马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物。
给药时，本发明中的药物制剂以药学上可接受的用量以及药学上 可接受的组合物使用。术语"药学上可接受的"指不干扰活性成分的 生物活性有效性的无毒材料。这种制剂可以常规地含有盐类、緩冲剂、 防腐剂、相容性载体以及任选的其他治疗剂。当在药物中使用时，所 述盐类应该是药学上可接受的，但非药学可接受的盐类可被方便地用 于制备其药学上可接受的盐类，因此不排除在本发明的范围之外。这 种药理或药学上可接受的盐类包括，但不限于，那些由下列酸制备得 到的盐类盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨 酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸以及诸如此类。同时，药学上可 接受的盐类可由诸如钠盐、钾盐或钩盐的碱金属或碱土金属盐类制备。
如果需要的话，组合物可与药学上可接受的栽体结合。本文使用 的术语"药学上可接受的载体"指适于给予人类的一个或多个相容的 固体或液体填料、稀释剂或封装物。术语"载体"表示天然的或合成 的有机或无机组分，活性组分与其结合以利于应用。药物组合物的组 分也能够与本发明中的分子以不存在基本上损害预期的药物有效性的 相互作用的方式;f皮此混合。
所述药物组合物可以含有合适的緩沖剂，包括醋酸盐、柠檬酸 盐、硼酸盐、以及磷酸盐。
任选地，所述药物组合物还可以包含合适的防腐剂，诸如苯扎 氯铵、氯丁醇、对羟基甲酸类以及硫柳汞。
所述药物组合物可以方便地呈现为单位剂量形式，并且可以通过 任 一 制药领域公知的方法制备。所有方法都包括将活性剂与载体结合的步骤，该载体由一种或多种辅助成分组成。通常，通过均勻且紧密 地将活性化合物与液体载体、精细分割的固体载体，或二者结合来制 备组合物，随后，如果需要，定型产物。
适于口服的组合物可以离散单位(discreteunit)呈现，诸如胶嚢、片 剂、锭剂，各自含有预先确定量的活性化合物。其他组合物包括水性 悬浮液或诸如糖浆剂、酏剂或乳剂的非水性悬浮液。
适于胃肠外给药的组合物方便地包含治疗剂的无菌水性或非水性 制剂，其优选与受体的血液等渗透压。该制剂可以根据已知的方法， 使用合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂制备。所述无菌的可注射制剂 也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液 或悬液，例如，1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的运载体或溶剂中， 可以使用的是水、林格氏液以及等渗的氯化钠溶液。此外，无菌的非 挥发油也可以被方便地用做溶剂或悬浮基质。为此目的，可以使用任 何无刺激性非挥发油，包括合成的单或双甘油酯。另外，诸如油酸的 脂肪酸可以被用于制备可注射物。适于口服、皮下、静脉、肌内等给 药方式的载体配方可见Remington's Pharmaceutical Sciences(雷氏药学 大全),Mack Publishing Co" Easton, PA。
本发明的另 一方面提供i兹性材料组合物，所述组合物包含巨噬细 胞，该巨噬细胞含有与首次治疗关联的磁性材料以及与二次治疗关联 的治疗性基因。所述首次治疗可以是热疗，例如，高温。所述二次治 疗可以是基因治疗。该组合物还可以包含至少一种其他试剂，例如， 与治疗性基因相关的前药。
本发明的另一方面提供制备如本发明所述的细胞的方法，该方法 包括将磁性材料导入单核细胞或单核细胞来源的细胞。优选地，所述 细胞是巨噬细胞，并且在将巨噬细胞与磁性材料培养时，所述磁性材 料被巨噬细胞积聚。
在优选方面，所述方法包括将治疗剂导入如本发明所述的细胞的 步骤。其中，所述治疗剂是治疗性基因，使用基因转移载体将其转染 入细胞，通常为巨噬细胞。这些载体可以包括脂质体和病毒载体。病 毒载体可以包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒以及仙台病毒。使用诸如adv5的复制缺陷型腺病毒可实现针对巨噬细胞的高水平基因 转移。
在本发明的另一方面，提供了将如本发明所述的细胞，优选巨噬 细胞，靶向个体中的病变物的方法。该方法包含给予个体的身体、身 体部分、组织或体液单核细胞或单核细胞来源的细胞，并将所述单核 细胞，或单核细胞来源的细胞暴露于磁场中。使用磁场源是用于辅助 巨噬细胞的天然归巢能力，以指导其到达病变靶标。通过这种方式， 巨噬细胞将所述磁性材料靶向，并使其定位于病变物。通过暴露于时 变磁场，所述磁性材料与磁场偶联并被加热。
本文使用的术语"病变物"包括个体身体或身体部分中患病的， 致病的(例如导致疾病的病原体)或不良的物质。
在本发明的另 一方面，提供了将磁性材料到靶向个体中的病变物 的方法，该方法包含给予个体的身体、身体部分、组织或仅体液如发 明所述的细胞。本发明所述的方法在靶向热疗中是有用的，其中施用 磁场，优选时变磁场用于激发/力。热本发明的细胞的磁性材料，导致热 能的释放。
耙向个体中的病变物。
本发明的另一方面提供了用于治疗个体中的病变物的靶向热疗系 统，该系统包含
i) 如本发明的第一方面所述的细胞，优选巨噬细胞；以及
ii) 加热所述细胞中的磁性材料的磁能源。
本发明的另一方面提供了治疗个体中病变物的方法，所述方法包 含给予个体的身体、身体部分、组织或体液本发明中的细胞，优选巨 噬细胞，以及施用磁能源来破坏、破裂或灭活所述病变物。优选地， 本发明所述的方法向/对病变物提供靶向产热。这种加热疗法被称为热 疗或者高热。高热时，约40。C至约46。C范围内的温度诱导细胞坏死(通 常被称为"热消融(thermo-ablation)")和/或导致细胞死亡的细胞热休克 反应(经典的高热-凋亡)，因此导致不可逆的细胞损伤
在本发明的另一方面，提供治疗个体中病变物的方法，该方法包
19含给予个体的身体、身体部分、组织或体液如本发明所述的细胞，优 选巨噬细胞。优选地，所述方法是基因治疗并且所述细胞含有治疗性 基因，以使所述基因被给予到个体的身体、身体部分、组织或体液。
剂，例如，前药。所述至少一种其他试剂可以在给予治疗性基因之前， 之中或之后给予。
已经表明巨噬细胞迁移至肿瘤中的低氧区。此外，通过在巨噬细 胞中掺入磁性材料，可使所述的巨噬细胞在磁力作用下耙向肺瘤中的 这些区域。如果巨噬细胞含有低氧调节的治疗性基因，所述治疗性基 因可在肺瘤中的低氧区表达。
本发明还涉及联合使用靶向热疗和基因治疗来治疗个体中的病变 物的方法。靶向热疗可在基因治疗之前，之中或之后施用，或者其联 合。
优选地，所述个体是人类。
磁能源通常为磁场。磁场可由磁体或磁体阵列提供。所述磁体或 磁阵列可以是永磁体或电磁体。所述磁场可以是稳恒磁场或交变磁场， 例如，振荡磁场。当将所述磁性材料靶向病变靶标时，通常使用稳恒
磁场；当用于加热所述磁性材料时，通常使用交变磁场。所述磁场可 直接施用于个体的身体、身体部分、组织或体液(如血液、血浆、血清 或骨髓)，或在体外施用于个体的身体、器官或体液。优选地，在身体 表面施用f兹场，例如在肿瘤部位之上，以便倾向在朝向肿瘤的方向， 或向着肿瘤内部的部位移动》兹性材料(例如，》兹性颗粒)。这样，可以 利用磁场将含有磁性材料的巨噬细胞靶向肿瘤并提高肿瘤对其的摄 入。所述磁场可以在体内应用，例如，通过植入个体体内的可植入式 磁体提供磁场。通过磁性颗粒高热，巨噬细胞能够破坏肿瘤以及其自 身。
在本发明的另一方面，提供了如本发明所述的细胞，优选巨噬细 胞在制备治疗病变物的药物中的用途。
本发明所述的治疗方法和用途可以用于于治疗癌症、AIDS、血管 不良生成、心血管斑块、血管斑块、钙化斑块、再狭窄、淀粉样变性、
20结核、肥胖和关节炎。
优选地，所述欲被治疗的病变物是癌症。如本文所使用的，术语 "癌症"指具有自主性生长能力的细胞，即，特征为快速增殖性细胞 生长的异常情形或状态。该术语的含义包括所有类型的癌性生长或致 瘤过程，转移组织或恶性转化细胞，组织，或器官，而不考虑其病理 类型或侵袭阶段。术语"癌症"包括各种器官系统的恶性肺瘤，诸如 那些侵袭例如，肺、乳腺、曱状腺、淋巴、胃肠道以及生殖泌尿道的 恶性肿瘤，以及包括诸如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾 丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌以及食管癌的恶性肿瘤的腺癌。术语 "癌，，是本领域公认的指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系 统癌、胃肠系统癌、生殖泌尿系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、 内分泌癌和黑色素瘤。示例性的癌包括那些从子宫颈、肺、前列腺、 乳腺、头(包括脑)和颈、结肠、皮肤以及卵巢组织形成的癌。术语"癌" 也包括癌肉瘤，例如，包括由癌或肉瘤组织组成的恶性肿瘤的癌肉瘤。 "腺癌"指来源于腺组织或肿瘤细胞在其中形成可识别的腺样结构的 癌。术语"肉瘤"是本领域公认的，指间充质来源的恶性肺瘤。
优选地，所述病变物是肿瘤。术语"肿瘤"意指包括肿瘤细胞和 肿瘤的脉管系统，例如肿瘤血管中的内皮细胞。所述肿瘤可以是良性 的或恶性的。优选地，所述肿瘤是恶性的。
本文使用的"癌症治疗"旨在包括癌细胞的杀伤或者使肿瘤对放 射或化疗的效应更力。敏感。
表述"肺瘤治疗"旨在包括任何破坏或灭活肿瘤细胞，或抑制或 ^皮坏肿瘤的脉管系统的治疗。
本发明的另一方面提供治疗个体的身体、身体部分、组织、细胞
或体液的方法，该方法包含如下步骤身体、身体部分、组织、细胞< 或体液在医学上的成像；给予如本发明第一方面所述的细胞，并^f吏该 细胞暴露于磁场。可以在医学成像之前，之中或之后给予如本发明所 述的细胞或其联合。
贯穿本说明书的说明书和权利要求书中，词语"包含"和"含有" 以及其书f生词，例如，包含(comprising)和包含(comprises),意指"包括-
21但不限于"，且并不意图(并不)排除其他部分、添加物、组分、整体
(integers)或步骤。，
贯穿本说明书的说明书和权利要求书中，单数形式包括复数形式， 除非上下文另有要求。特别地，当使用不定冠词时，应理解为本说明 书(specification)既包括单数，又包括复数，除非上下文另有要求。
应该理解，在本发明的特定方面、实施方案或实施例中描述的特 征、整体(integers)、特性、化合物、化学部分或基团,可适用于本文所 描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
附图简要说明


图1:初级人类巨噬细胞(红色膜染)，内化l-2/miRGD-包被的磁 性颗粒(黄色)后7天。
图2: T47D球状体横切面，带有由两层活细胞包围的中央坏死区 (N)的细胞碎片。外层(蓝色)由含氧量正常的细胞组成，内层是低氧的 (低氧标志物HIF-la染成红色，见箭头)。
图3:人乳腺癌肺瘤球状体的切面，显示巨噬细胞在中央坏死区(N) 周围的内层低氧边缘聚集(染成褐色，见箭头)。
材料和方法
颗粒合成-主要由磁铁矿(Fe304)和/或磁赤铁矿(y Fe:j03)核心组 成，具有硅、葡聚糖或PVA包被的生物相容性的^f兹性纳米颗粒，依照 在Santra et al. (2001)和Pardoe et al. (2001)中列出的方法合成。具有各 种表面化学(surface chemistry)的商业上可获得的i兹性微颗粒以及纳米 颗粒也被用于加载巨噬细胞。这些试验中使用的所有颗粒的》兹性用 Quantum Designs MPMS超导量子干涉器件(SQUID)磁强计表征，并 且，这些参数被用于输入下面讨论的数学模型。
包被与颗粒加载-磁性颗粒的聚合物包被是具有功能的并涂有促 进膜粘附和吞噬的分子。
人类巨噬细胞的分离和非粘附性培养-从取自健康志愿者的血液 中分离单核细胞。血液收集于柠檬酸钠(终体积10%)中，用Ficoll梯度分层。离心之后，收集单核的细胞层，并依照我们先前在Griffiths etal. (2000)中描述的方法，使用CD14磁珠从这一组分中纯化单核细胞。然后在非粘附的无菌聚四氟乙烯袋中将这些细胞在5 0/。自体血清/RPMI中再培养7天，直至其分化成巨噬细胞。我们之前针对常用的巨噬细胞标志物CD68所做的免疫组化染色表明，在这些7天培养物中超过95%的细胞是单核细胞来源的巨谨细胞(MDMs)(Burke等人.2001 & 2003)。
巨噬细胞荷栽的磁性颗粒的作用-对于原代人成骨细胞荷载的初始研究表明，在多达21天的培养中，这些原代细胞即便是对于大颗粒(大至4.5 /mi)也是耐受良好的(Cartmell等人，2002， 2003)。进行了存活力检测，并使用Affymetrix基因芯片研究了基因表达的变化。使用Olympus Flouview 3D激光共聚焦扫描显微镜观测内化，并使用分辨率约2纳米的HITACHI S-4500场发射才全扫描电子显微镜进行后向散射电子成像(backscattered electron imaging)(图1 )。
利用肿瘤球状体对》兹性耙向作用进行体外评估
人类肿瘤球状体的生成-及人类巨噬细胞对它们的浸润-来自
乳腺癌细胞系T47D的肿瘤球状体在非粘附的琼脂糖覆盖的培养中长至直径800至900 um。这样得到的球状体具有外部氧充足的细胞层(约200 um宽)以及内部围绕着中央坏死区的的存活肺瘤细胞的低氧区(200-250 um宽)(图2)。我们先前用HIF-1的抗体对球状体内部低氧边缘的低氧肿瘤细胞染色(图2)，显示巨噬细胞在与初级MDMs共培养1-3天后聚集于这些区域(见图3)。将球状体与50,000个初级人类巨噬细胞共培养。浸润入球状体的巨噬细胞总数用流式细胞术评估(也就是，用胶原酶分散球状体，随后使用CD14/CD68抗体进行FACS分析)。通过在MTS的石蜡/冰冻切片上的CD68的免疫组化，在平行培养物中评估巨噬细胞在球状体内的分布。这确证了巨噬细胞特异地聚集于这些共培养物中的^M犬体的内部低氧区。
球状体的磁性靶向作用-外稀土磁体被用于刺激96孔板中上方"静置"培养的球状体摄入磁性巨噬细胞。这些磁体产生高磁场/梯度积(field/gradient products),其对于巨噬细胞内化的》兹性颗粒施加平寿多力。这些目标参数(场强、梯度、颗粒大小及磁性)已经通过数学模型得到了优化，并使用Redcliffe Diagnostics MagScan系统对磁场分布作图。这使用非转染的巨噬细胞、带有报告基因或治疗性基因的巨噬细胞一次完成。
到巨噬细胞的基因转移-用携带报告基因LacZ的复制缺陷型腺病毒感染巨噬细胞，其中lacZ由组成性^t活的启动子(CMV)或低氧调4空反应元件(HRE)控制。后者只在巨噬细胞迁移入肿瘤球状体的中央^f氐氧区域时才会表达(如之前在Griffith等人，2000 & Burke等人，2003中所描述的)。使用诸如adv5这样的复制缺陷性腺病毒(Griffith等人，2000)，可以实现到巨噬细胞的高水平基因转移(在CEL实验室中效率〉85%)。由于正常组织中存在轻度低氧(3-10%02)，这些组织也会^皮转染的巨噬细胞浸润，因此使用其只能被在恶性肿瘤中存在的极低氧水平激活的HRE是重要的。目前，已经开发出只在处于病理水平的4氐氧/缺氧(<0.1 02)的人类细胞中激活的HRE形式(称为缺氧反应元件，ARE)(Ameri等人，2002 & 2004)。
然后将巨噬细胞用生物相容性磁性纳米颗粒加载，并在高梯度磁场存在或不存在的状态下与球状体孵育(如上所述)。利用j8-GLOFACS分析对在全部的、巨噬细胞浸润的球状体中的巨噬细胞表达的CMV-启动的/3-gal(荷磁的对非荷磁的)进行定量-即，在球状体中的细胞酶解分散之后。可选择地，利用冰冻球状体切片的x-gal染色可使球状体内部的低氧区域的HRE-启动的j8-gal表达显影。使用"纳米磁性"方法，
氧内部核心的水平有所提高，则下一步是用治疗性基因替代所述冲艮告基因(LacZ)，所述治疗性基因诸如P450(Griffiths等人，2000)，或编码有效的新型抗血管生成肽Alphastatin(Staton等人，2004)的cDNA，重复该研究以观察是否磁性颗粒的应用同样提高这些基因在低氧肿瘤区的表达。
利用肿瘤球状体对磁性高热进行体外评估体外球状体高热的产生-一旦磁性巨噬细胞以上面描述的静止以
及流动模式被球状体摄取，则通过磁线圈系统给其施加高频(约0.05至1.2Mhz)电磁场(0-15 kA/m)。这些电磁场与巨噬细胞中的磁性颗粒偶联，根据下述公式，其主要通过超顺磁颗粒中磁化强度矢量的磁滞循环(hysteresis cycling)和相位滞后(phase lag)而诱导产热。
其中P是功率损耗，/io是自由空间的磁导率，/是磁场频率，H是磁
场强度，M是颗粒的磁化强度以及x"是磁敏感性的虚分量(相位滞后)。由该过程产生的热从所述颗粒转移到周围的细胞。通过球状体切片的
TUNEL染色来评估遍布球状体(包括内部低氧区)的肿瘤细胞以及巨喧细月包石皮坏。
在两组试验中使用磁性颗粒高热。在第一种情况下，将它与上述的基因治疗技术联用，以设法破坏转染了治疗性基因或报告基因的荷载巨噬细胞。如果巨噬细胞被允许在如前所述的延长周期的时间内停留在肿瘤中，这种方法将阻止它们对癌症生长的促进。在第二种情况下，将该技术用于更经典的磁性颗粒高热的意义中，其目的不是递送和转染治疗性基因，而是通过热破坏肺块。
数学建模(Mathematical Modelling)
从建模观点上讲，将此过程分为三个阶段是有益的(l)巨噬细胞对肿瘤区域的磁性靶向；(2)它们在所述肿瘤低氧区域的聚集；(3)磁性高热。下面列出了每一部分的建模要点。
(1)巨噬细胞加载磁性颗粒，并将其引入供给肿瘤区域的动脉中。使用靠近肿瘤的具有最大强度的稳恒磁场将所述巨噬细胞从悬浮液中拉出并结合在内皮壁上。这个阶段的建模的主要目的是预测其中巨噬细胞脱离悬浮液的血管类型、血管位置。该模型涉及以巨噬细胞上的^兹力平衡斯托克斯阻力(来自血管中的巨噬细胞与血流的相互作用)。建模的输出结果(outcomes)包括磁场(强力和强度分布)的设计以及使
25巨噬细胞在胂瘤区域脉管系统中的分布最优化所必需的》兹性颗粒的掺入水平。
(2) —旦巨噬细胞到达内皮层，它通过配体与之结合，表达使血管壁变得薄弱的化学物质，从而通过血管壁进入细胞间隙。然后它渗入细胞间隙并通过趋化作用被吸引到低氧浓度区域。这个阶段以相位模型建模，其描述细胞外基质、巨噬细胞/巨噬细胞、肿瘤细胞以及水的粘弹性相互作用。该建模的挑战在于将作用在巨噬细胞/巨噬细胞的趋化"力"并入多相流程框架内，以及负责将巨噬细分化为巨噬细胞。借助于本模型解决的一个关键问题且其对于治疗的成功很重要的一个
于肿瘤内部空间的竟争达到什么程度。(3)—旦所述磁性掺入的巨噬细胞到达其靶点，对肺瘤施用局部的振荡磁场。伴随着所述场的振荡，巨噬细胞内部磁性颗粒的》兹化强度经历滞后，并同时释放热能。所述能量的释放导致局部加热，其用于破坏肺瘤细胞。这种加热通过在巨噬细胞(因此也是磁性颗粒)部位的源项与温度的扩散方程建模。这些源项的强度通过利用磁铁矿的磁滞曲线来估计。该模型用于计算为了得到理想的加热效果而应该对肿瘤使用的^f兹场强度。
实施例
用与此前由他们(Cartmell等人，2002， 2003; Hughes等人，2003)描述的那些方法相似的方法，制备由磁铁矿(Fe304)和磁赤铁矿CyFe203)核心组成的RGD-包被的生物相容性磁性微粒(尺寸l-2/rni)。从人血液中分离血单核细胞，培养8天，使其分化成巨噬细胞。然后用红色的细胞示踪荧光染料PHK-26 (Sigma)标记细胞膜(使用厂商的说明书)，并与磁性颗粒(25/ig/ml)孵育。将细胞与所述颗粒將育过夜，使细胞发挥吞噬作用。然后通过PBS洗涤去除未结合的颗粒，随后细胞在常规的培养条件下维持至7天。然后用激光扫描共聚焦显微镜和图像分析软件(Olympus， Fluoview)追踪颗粒(黄色)在巨噬细胞细胞膜(红色)上的相对定位。细胞在摄取颗粒后1至7天的时间段内被成像以检测是否所述颗粒依然内化。图1显示摄入磁性颗粒后7天的巨噬细胞(使用垂
26直切面成像来评估)。该初步研究证实，这些颗粒可被巨噬细胞迅速才聂取(在一 日分析时间点时颗粒就已经被完全内化)，并且其在细胞中至
少可滞留7天。在此项初步工作中，使用的是微颗粒而非纳米颗粒，这是为了利用共聚焦显微镜准确地显现所述颗粒在细胞中的三维分布。该数据与我们的其他研究相一致，所述其他研究显示原代人成骨细胞和骨髓基质细胞都能快速摄取RGD包被的磁性微颗粒或纳米颗粒(Cartmell等人，2002 & 2003)。
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权利要求
1.单核细胞或单核细胞来源的细胞，所述细胞包含磁性材料。
2. 如权利要求1所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，所述细 胞是巨噬细胞。
3. 如权利要求1或2所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其 中所述磁性材料是^f兹性颗粒。
4. 如权利要求3所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其中所 述磁性材料是纳米颗粒。
5. 如权利要求1或2所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其 中所述磁性材料是铁磁流体。
6. 如前述^L利要求中任一项所述的单核细力包或单核细胞来源的 细胞，其中所述^兹性材料包含生物相容性包被。
7. 如权利要求6所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其中所 述生物相容性包被是金属。
8. 如权利要求6所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其中所 述生物相容性包被是聚合物。
9. 如权利要求8所述的单核细胞或单核细胞来源的细^0其中所 述聚合物选自葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯亚胺(PEI)或硅。
10. 如权利要求6所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其中 所述生物相容性包被带有生物分子，所述生物分子可以发挥作用以促进所述磁性颗粒粘附至所述单核细胞或单核细胞来源的细胞。
11. 如权利要求IO所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其中所述生物分子选自RGD、转铁蛋白、胶原、纤连蛋白/纤维蛋白、离 子通道受体、细胞特异性整联蛋白受体或其他任何细胞表面抗原。
12. 如前述权利要求中任一项所述的单核细力包或单核细胞来源的 细胞，所述细胞含有治疗剂。
13. 如权利要求12所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其中 所述治疗剂选自化疗剂、放疗剂、治疗性基因、或其一部分、或蛋白 质或其一部分。
14. 如权利要求12所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其中 所述治疗剂选自DNA、 RNA、干扰RNA(RNAi)、肽、多肽、抗体、抗体片段或适配子。
15. 如前述权利要求中任一项所述的单核细力包或单核细胞来源的 细胞，所述细胞含有应答元件，其中所述应答元件是对胂瘤内的或周 围的条件应答的基因或其部分。
16. 如权利要求15所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其中 所述应答元件的表达受缺氧调控。
17. 如权利要求15所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞，其中 所述应答元件的表达受低氧调控。
18. 如权利要求15至17中的任一项所述的单核细胞或单核细月包 来源的细胞，其中所述应答元件可操作地连接到治疗性基因，以调控 所述治疗性基因的表达。
19. 如权利要求15至17中的任一项所述的单核细胞或单核细胞 来源的细胞，其中所述应答元件包含治疗性基因的全部或部分。
20. 如权利要求15至17中的任一项所述的单核细胞或单核细胞 来源的细胞，其中所述应答元件由治疗性基因的全部或部分组成。
21. 如权利要求15至20中的任一项所述的单核细胞或单核细月包 来源的细胞，其中所述应答元件选自肿瘤抑制基因、抗原基因、细胞 毒性基因、细胞生长抑制基因、细胞因子基因、趋化因子基因、药用 蛋白基因、促凋亡基因、前药激活基因以及抗血管生成基因。
22. 用作药物的如前述;K利要求中^f壬一项所述的单核细胞或单核 细胞来源的细胞。
23. 药物组合物，包含如前述权利要求中任一项所述的单核细胞 或单核细胞来源的细胞，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
24. 将磁性材料靶向个体的病变物的方法，所述方法包括给予所 述个体的身体、身体部分、组织或体液如权利要求15至21中的任一 权利要求所述的单核细胞或单核细胞来源的细胞。
25. 将权利要求1至22中的任一项所述的单核细胞或单核细胞来 源的细胞导向个体病变物的方法，所述方法包括给予所述个体身体、 身体部分、组织或体液单核细胞或单核细胞来源的细胞，并使所述单 核细胞或单核细胞来源的细胞暴露于磁场之中。
26. 如权利要求24或25所述的方法，其中在体内实施所述方法。
27. 如权利要求24或25所述的方法，其中离体实施所述方法。
28. 用于治疗个体病变物的耙向热疗系统，所述系统包括i) 如权利要求1至22中的任一项所述的单核细胞或单核细胞来源 的细力包；以及ii) 加热所述细胞内的磁性材料的磁能源。
29. 治疗个体中病变物的方法，所述方法包括给予所述个体的身 体、身体部分、组织或体液如权利要求15至21中的任一项所述的单 核细胞或单核细胞来源的细胞。
30. 如权利要求29所述的方法，其中所述方法为基因治疗。
31. 治疗个体中病变物的方法，所述方法包括给予个体的身体、 身体部分、组织或体液如权利要求i至22中的任一项所述的单核细月包 或单核细胞来源的细胞，以及施用磁能源以破坏、破裂或灭活所述病 变物。
32. 如权利要求29所述的方法，其中所述治疗是高热。
33. 如权利要求1至22中的任一项所述的单核细胞或单核细胞来 源的细胞在制备用于治疗病变物的药物中的用途。
34. 如权利要求33所述的用途，其中所述病变物是肿瘤。
35. 治疗个体的身体、身体部分、组织或体液的方法，所述方法 包含如下步骤使所述身体、身体部分、组织、细胞或体液在医学上 成像；给予如权利要求1至22中的任一项所述的单核细胞或单核细胞 来源的细胞并将所述单核细胞或单核细胞来源的细胞暴露于磁场。
全文摘要
为了靶向个体的病变物，本发明提出给予掺入诸如磁性颗粒或磁流体的磁性材料的单核细胞或单核细胞来源的细胞，例如巨噬细胞，所述磁性材料优选具有生物相容性的包被。然后可以给个体施用磁能源，以破坏、破裂或者灭活病变物。可选择地，所述单核细胞或单核细胞来源的细胞可以另外包含治疗剂，由此所述细胞能靶向病变物。
文档编号A61K47/48GK101495151SQ200780011706
公开日2009年7月29日 申请日期2007年4月3日 优先权日2006年4月3日
发明者乔恩·多布森, 克莱尔·刘易斯, 海伦·布赖恩 申请人:基尔大学