一种靶向人CD47-SIRPα信号通路的双特异性抗体及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供一种抗人CD47和抗人SIRPα的双特异性抗体，包含特异性结合CD47的第一抗原结合域和特异性结合SIRPα的第二抗原结合域，第一和第二抗原结合域都由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)组成；第一抗原结合域为可与CD47特异性结合的抗体可变区结构域；第二抗原结合域为可与SIRPα特异性结合的抗体可变区结构域。制备方法主要包括：合成编码所述抗体的cDNA序列；将cDNA序列插入工具载体，构建表达载体；将表达载体在宿主细胞中表达和分离纯化表达的双特异性抗体。本发明用于制备治疗人类癌症的药品。
【专利说明】—种靶向人CD47-S IRP α信号通路的双特异性抗体及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药【技术领域】，具体涉及一种抗人类整合素相关蛋白(CD47或IAP)和人信号调节蛋白a (SIRPa)的双特异性抗体及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]⑶47,又称整合素相关蛋白(Integrin-associated protein, IAP),最初从人胎盘与整合素aVi3 3共纯化及从血小板与β 3整合素共免疫沉淀而为人们所认识，其功能与整合素相关(Johansen and Brown.J Biol Chem.2007)。它是一种广泛表达于细胞表面的糖基化跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族。结构上包括一个氨基端细胞外可变区域，一个有3-5个高度疏水的跨膜片段构成的跨膜区域和一个亲水的羧基端胞质尾区。CD47是细胞表面至关重要的标记物，分子量在47-55kD之间，与GPA (血型糖蛋白A，Glycophorin A)、GPB (血型糖蛋白 B, Glycophorin B)、带 3 蛋白(Band3protein)、RhD (Rh antigen D)等相关蛋白紧密相关(Barclay and Brown.Nat Rev Tmmunol.2006)。
[0003]SIRPa,信号调节蛋白 a (Signal regulatory proteina)也是一种跨膜蛋白，主要表达于巨噬细胞、树突状细胞和神经细胞表面。其胞外区含有3个免疫球蛋白超家族样区域，其中N末端的区域介导与CD47的结合，而其细胞内结构域具有典型的免疫受体酪氨酸抑制性序列(Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM);与0047结合后，SIRPa的Ι--Μ被磷酸化，产生级联反应，抑制巨噬细胞的吞噬作用(Matozaki etal.Trends Cell Biol.2009)。
[0004]在人体的固有免疫系统(Innate immune system)中，巨卩遼细胞(Macrophage)扮演着“清道夫”的角色，它通过吞噬作用清除病原物、受损细胞和衰老细胞维持机体健康；同时，巨噬细胞又能识别正常健康细胞，使其免于被自我攻击。这种识别的机制正是在于正常健康细胞如红细胞(Oldenborg et al.Science.2000)或血小板(Olsson etal.Blood.2005)表面的⑶47分子与巨噬细胞上的受体SIRP α相互作用产生抑制性信号，抑制其吞噬活性。所以⑶47在红细胞和血小板上是一种“自身细胞的标记物”(Marker ofself)。
[0005]⑶47和SIRPa形成的信号复合体，还可参与神经系统发育、中性粒细胞趋化激活和基质细胞支持的造血细胞生成等多种生理活动，共同调节效应细胞的功能和其所分泌的细胞因子，同时在诱导T细胞免疫耐受、活化、凋亡等方面也发挥着多种调节作用(Johansen and Brown.J Biol Chem.2007)。
[0006]近年来，⑶47和⑶47-SIRP α信号系统受到广泛关注。其中，最令人瞩目的是其作为肿瘤治疗的潜在药靶。已有研究证实，CD47在许多恶性肿瘤中，如急性髓细胞性白血病(AML)、B细胞和T细胞急性白血病、非霍奇金淋巴瘤等，均呈过表达状态，且⑶47高表达与临床预后 差有关(Willingham et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2012 ；Majeti etal.Cell.2009)。⑶47作为卵巢肿瘤细胞标记物第一个被克隆，这表明它可能在阻止其他肿瘤组织的吞噬作用中同样发挥作用(Majeti et al.Cell.2009)。肿瘤细胞表面高表达的⑶47被巨噬细胞表面的SIRPa识别，向巨噬细胞传递“别吃我”(“Don’ t eat me”)的信号，借以逃避免疫监视。
[0007]斯坦福大学的Weissman教授团队系统地研究了多种实体瘤中⑶47的表达水平，结果表明，所有人类实体瘤细胞中的CD47都呈高表达，其平均表达水平是对应正常细胞的3.3倍左右。而且，他们发现实体瘤病人⑶47mRNA的水平与预后指数(Prognosticfactor)呈负相关。进一步针对原位免疫缺陷性小鼠异种移植动物模型(Orthotopicimmunodeficient mouse xenotransplantation models)的实验发现，抗 CD47 单克隆抗体的施用能够抑制大型肿瘤的生长和转移，而对于小型肿瘤则可以治愈。抗CD47单克隆抗体的有效性和安全性还在原位小鼠乳腺癌模型(Orthotopic mouse breast cancer model)实验中得到证实(Willingham et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2012)。为此 Weissman等在美国发表了专利(Jaiswal et al.US12/321，215)。该项研究不仅证实了高表达CD47是肿瘤细胞逃避免疫监视的普遍机制，也为通过阻断CD47-SIRP α信号通路来治疗肿瘤提供了有重要价值的借鉴。
[0008]通过抗CD47单克隆抗体进行肿瘤治疗的有效性和安全性在其它案例中也得到证实。根据Majeti等(Majeti et al.Cell.2009)的研究结果,抗⑶47抗体能够清除小鼠异种移植模型中的急性髓细胞性白血病癌症干细胞。而且他们观察到抗CD47抗体对小鼠没有明显毒性，除了仅有的嗜中性粒细胞减少症。Chao等(Chao et al.Cell.2010)的研究也表明，人非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞上⑶47表达增加，抗⑶47抗体使NHL细胞优先被吞噬，其作用与抗CD20抗体利妥昔单抗(Rituximab)有协同作用；移植人NHL肿瘤细胞的小鼠经抗CD47抗体治疗后肿瘤减少、成活率增加，与利妥昔单抗合用能消除肿瘤，达到治愈。
[0009]专利W02005044857报道了一种人源化抗人⑶47单克隆抗体用于血液性肿瘤，尤其是白血病治疗。
[0010]中国专利(201010557999.1) “一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis_hCD47”报道了一种靶向白血病干细胞的可溶性蛋白hCD47，这种蛋白应用于体内后可与巨噬细胞上的SIRPa结合，阻止白血病干细胞上内源性的⑶47与SIRP α结合，从而促进巨噬细胞对白血病细胞和白血病干细胞的吞噬作用，起到治疗白血病的作用。
[0011]诺华公司于2010年12月在中国申请了一个“四价CD47-抗体恒定区融合蛋白用于治疗”的专利(CN201080064426.3)，描述了一种可溶性蛋白能选择性地结合SIRP a，其中一种是与抗体恒定区的CD47融合蛋白，能同时结合4个SIRP α分子，可用于预防或治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病。
[0012]针对⑶47-SIRPa信号通路，除了采用抗⑶47单克隆抗体和可融性⑶47蛋白的肿瘤治疗策略，还可以开发抗SIRP α单克隆抗体(Ho et al.0ncoImmun0.2013 ；Zhao etal.Proc.Natl Acad Sci USA2011)。专利 W02013056352 描述了人源化的抗人 SIRP α 的全长单克隆抗体及其衍生的抗体片段用于血液性肿瘤，尤其是白血病的治疗。
[0013]除抗体以外，有人报道了一种通过人工改造的可溶性SIRP α变体来拮抗⑶47进而阻断 CD47_SIRPa 信号通路的方法(Weiskopf et al.Science.2012)。Weiskopf 等通过蛋白质工程获得的这种SIRPa变体，相较于天然的SIRPa分子，与⑶47的亲合力提高了约50，000倍。这种SIRP α变体单体能有效拮抗肿瘤细胞上的⑶47，但并不能引起巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬；但这种SIRPa变体单体与其它针对肿瘤的特异性单克隆抗体(如革巴向HER2/neu的Trastuzumab，或革巴向EGFR的Cetuximab)合并施用，能产生显著的协同作用，增加巨噬细胞对肿瘤的吞噬活性和增加抗肿瘤的效应。所以，这种可溶性SIRPa变体可以作为肿瘤特异性抗体的普适性佐剂(Adjuvant)。或者，这种SIRPa变体与人类IgG4的Fe融合制成二聚体后施用，也能增加巨噬细胞对肿瘤的吞噬活性。Theocharides等(Theocharides et al.J Exp Med.2012)也在急性髓细胞性白血病(AML)模型上发现SIRP α -Fe融合蛋白通过阻断⑶47-SIRP α信号通路，能显著增加小鼠和人巨噬细胞对AML癌细胞的吞噬作用，并抑制肿瘤细胞在小鼠的移植和生长，而不增加巨噬细胞对正常造血细胞的吞噬。[0014]本发明釆用一种全新的策略，即通过抗人⑶47和人SIRP α的双特异性抗体，一方面通过与⑶47和SIRPa的结合阻断⑶47-SIRP α信号通路，使得肿瘤细胞“别吃我”信号被封闭，巨噬细胞得以将其吞噬杀灭；另一方面，这种双特异性抗体因能同时结合CD47和SIRPa，可以将高表达CD47的肿瘤细胞和巨噬细胞拉近，促进后者对肿瘤细胞的吞噬作用。
[0015]参考文献
[0016]Barclay AN and Brown ΜΗ.(2006)The SIRP family of receptors and immuneregulation.Nat Rev Immunol.6(6):457-64.[0017]Chao MP, Alizadeh AA, Tang C，et al.(2010)Anti_CD47antibody synergizeswith rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma.Cell.142(5):699-713.[0018]CN201010557999.1.韩骅，梁英民，严学倩.一种白血病干细胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47.[0019]CN201080064426.3.胡贝尔等.四价CD47-抗体恒定区融合蛋白用于治疗.[0020]Ho JMiDanska JSiWang JCY.(2013)Targeting SIRP a in cancer.0ncolmmun0.2:e23081.[0021]Johansen ML and Brown EJ.(2007) Dual regulation of SIRP alphaphosphorylation by integrins and CD47.J Biol Chem.282(33):24219-30.[0022]Majeti R，Chao MP，Alizadeh AA,et al.(2009)CD47is an adverse prognosticfactor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stemcells.Cell.138(2):286-99.[0023]Matozaki T, Murata Y,Okazawa H，Ohnishi H.(2009)Functions and molecularmechanisms of the CD47_SIRPalpha signalling pathway.Trends Cell Biol.19 (2):72-80.[0024]Oldenborg PA,Zheleznyak A，Fang YF,et al.(2000)Role of CD47as a markerof self on red blood cells.Science.288(5473):2051-4.[0025]Olsson M， Bruhns P， Frazier WA, et al.(2005)Platelet homeostasis isregulated by platelet expression of CD47under normal conditions and in passiveimmune thrombocytopenia.Blood.105(9):3577-82.[0026]Theocharides AP, Jin L, Cheng PY, et al.(2012) Disruption of SIRP asignaling in macrophages eliminates human acute myeloid leukemia stem cells inxenografts.J Exp Med.209 (10):1883-99.[0027]US12/321, 215.Jaiswal S，Chao MP，Majeti R and Weissman IL.Methods formanipulating phagocytosis mediated by CD47.[0028]Weiskopf K，Ring AM，Ho CCM, et al.(2013) Engineered SIRP a Variants asImmunotherapeutic Adjuvants to Anticancer Antibodies.Science.341(6141):88-91.[0029]Willingham SB， Volkmer JP, Gentles AJ, et al.(2012)The CD47_signalregulatory protein alpha (SIRP a ) interaction is a therapeutic target for humansolid tumors.Proc Natl Acad Sci USA.109(17):6662-7.[0030]W02005044857.Yasufumi，et al.Humanized ant1-CD47antibody.[0031]W02013056352.Wang JCY, et al.Antibody and antibody fragments targetingSIRP—alpha and their use in treating hematologic cancers.
【发明内容】
[0032]本发明的目的是:提供一种抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体，并提供其制备方法，以用于制备治疗人类癌症的药品。抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体国内外未见报道。
[0033]本发明的技术方案是:本发明的抗人⑶47和人SIRPa的双特异性抗体，包含特异性结合CD47的第一抗原结合域和特异性结合SIRP a的第二抗原结合域，其结构特点是:
[0034]上述第一抗原结合域和第二抗原结合域都由一对抗体重链可变结构域VH和抗体轻链可变结构域VL组成；
[0035]上述的第一抗原结合域为可与CD47特异性结合的抗体可变区结构域；第二抗原结合域为可与SIRPa特异性结合的抗体可变区结构域。
[0036]进一步的方案是:上述的第一抗原结合域为以下四对序列组合，即SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 中的任意一对序列组合。其中，SEQ ID NO:USEQ ID N0:3、SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 为重链可变结合域；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8为轻链可变结合域。
[0037]进一步的方案是:上述的第二抗原结合域为以下两对序列组合，即SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO:10中的任意一对序列组合。其中，SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11为重链可变结合域；SEQ ID NO:10为轻链可变结合域。
[0038]进一步的方案是:上述的第一抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与人CD47特异性结合的抗体的可变区结构域的序列；上述的第二抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与人SIRP a特异性结合的抗体的可变区结构域的序列。
[0039]进一步的方案是:上述的第一抗原结合域和第二抗原结合域为通过将鼠来源的抗体人源化获得或完全人源获得。
[0040]进一步的方案还有:上述的抗体是二价的或多价的。
[0041]一种上述的抗人⑶47和人SIRP a的双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤:
[0042]①合成编码上述抗体的cDNA序列；[0043]②将cDNA序列插入工具载体，构建可在宿主细胞中表达的表达载体；
[0044]③将上述的表达载体在宿主细胞中表达；
[0045]④分离纯化表达的双特异性抗体。
[0046]进一步的方案是:上述的步骤②中的工具载体为市售商业化载体或自行构建的可供表达的载体。
[0047]进一步的方案是:上述的步骤②和步骤③中的宿主细胞为如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物 细胞、昆虫细胞等常见表达宿主。
[0048]一种上述的抗人⑶47和人SIRP α的双特异性抗体，用于制备治疗人类癌症的药品，尤其是人非霍奇金淋巴瘤(NHL)、人急性髓性白血病(AML)及各种实体瘤的药品。
[0049]本发明有以下优点:本发明中描述的抗人⑶47和人SIRPa的双特异性抗体，一方面通过与⑶47和SIRP a的结合阻断信号⑶47-SIRP a通路，使得肿瘤细胞“别吃我”信号被封闭，巨噬细胞得以将其吞噬杀灭；另一方面，这种双特异性抗体因能同时结合⑶47和SIRPa，可以将高表达CD47的肿瘤细胞和巨噬细胞拉近，促进后者对肿瘤细胞的吞噬作用。本发明的抗0047和311?^的双特异性抗体，可用于制备治疗癌症的药品，尤其是人非霍奇金淋巴瘤(NHL)、人急性髓性白血病(AML)及各种实体瘤的药品。
【专利附图】
【附图说明】
[0050]图1为本发明的抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体的scFv (Single-chainvariable fragment)结构类型示意图，图中抗原I为⑶47,相应地抗原2则为SIRPa，其中:
[0051]图1-1:连接方式:VL1-接头-VHl-接头-VL2-接头-VH2 ；
[0052]图1-2:连接方式:VH1-接头-VLl-接头-VH2-接头-VL2 ；
[0053]图1-3:连接方式:VL2_接头-VH2-接头-VL1-接头-VHl ；
[0054]图1-4:连接方式:VH2_接头-VL2-接头-VHl-接头-VLl ；
[0055]图1-5:连接方式:VL1-接头-VH2-接头-VL2-接头-VHl ；
[0056]图1-6:连接方式:VH1-接头-VL2-接头-VH2-接头-VLl ；
[0057]图1-7:连接方式:VL2_接头-VHl-接头-VL1-接头-VH2 ；
[0058]图1-8:连接方式:VH2_接头-VL1-接头-VHl-接头-VL2 ；
[0059]图2为本发明的抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体的scFab (Single-chainantigen-binding fragment)结构类型示意图，图中抗原I为⑶47,相应地抗原2则为SIRPa，其中:
[0060]图2-1: [VL-CL-接头-VH-CH1]抗原 1-接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原 2 ；[0061 ]图 2-2: [VH-CHl-接头-VL-CL]抗原 1-接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]抗原 2 ；
[0062]图2-3: [VL-CL-接头-VH-CH1]抗原 2_ 接头-[VL-CL-接头-VH-CH1]抗原 I ;
[0063]图2-4: [VH-CHl-接头-VL-CL]抗原 2_ 接头-[VH-CH1-接头-VL-CL]抗原 I。
[0064]图3为本发明的抗一种抗原的全长抗体并含有抗另一种抗原的scFv的四价双特异性识别人⑶47和人SIRPa抗体的结构示意图，图中抗原I为⑶47，相应地抗原2则为SIRPa，其中:
[0065]图3-1:结合SIRP a的scFv连接到全长⑶47抗体的轻链C端；[0066]图3-2:结合SIRP α的scFv连接到全长CD47抗体的Fe的C端；
[0067]图3-3:结合CD47的scFv连接到全长SIRP α抗体的轻链的C端；
[0068]图3-4:结合CD47的scFv连接到全长SIRP α抗体的Fe的C端。
[0069]图4为本发明的抗一种抗原的全长抗体并含有抗另一种抗原的scFab的四价双特异性识别人⑶47和人SIRPa抗体的结构示意图，图中抗原I为⑶47，相应地抗原2则为SIRPa，其中:
[0070]图4-1:结合SIRP a的scFab连接到全长⑶47抗体的轻链的C端；
[0071]图4-2:结合SIRP α的scFab连接到全长CD47抗体的Fe的C端；
[0072]图4-3:结合CD47的scFab连接到全长SIRP α抗体的轻链的C端；
[0073]图4-4:结合CD47的scFab连接到全长SIRP α抗体的Fe的C端。
[0074]氨基酸序列描述
[0075]SEQ ID NO:1针对CD47的抗体重链结合可变区域I ;
[0076]SEQ ID NO:2针对CD47的抗体轻链结合可变区域I ;
[0077]SEQ ID NO:3针对CD47的抗体重链结合可变区域2 ；
[0078]SEQ ID NO:4针对CD47的抗体轻链结合可变区域2 ；
[0079]SEQ ID NO:5针对CD47的抗体重链结合可变区域3 ；
`[0080]SEQ ID NO:6针对CD47的抗体轻链结合可变区域3 ；
[0081]SEQ ID NO:7针对⑶47的抗体重链结合可变区域4 ；
[0082]SEQ ID NO:8针对CD47的抗体轻链结合可变区域4 ；
[0083]SEQ ID NO:9针对SIRP α的抗体重链结合可变区域I ;
[0084]SEQ ID NO:10针对SIRP α的抗体轻链结合可变区域I ;
[0085]SEQ ID NO:11针对SIRP α的抗体重链结合可变区域2。
【具体实施方式】
[0086]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的描述。
[0087](实施例1)
[0088]见图1至图4，本实施例的抗人⑶47和人SIRPa的双特异性抗体，至少包含结合人CD47的第一抗原结合域和结合人SIRP α的第二抗原结合域，前述每个抗原结合域又包含一对功能性的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
[0089]前述针对人⑶47和人SIRP a的双特异性抗体分子组成包含但不限于结合⑶47的第一抗原结合域和结合SIRPa的第二抗原结合域，还包括有助于前述双特异性抗体维持空间结构以实现正常功能或增强抗体功能的其它肽段或分子。
[0090]术语“价”指结合位点在抗体分子上存在的具体数量。比如:术语“二价”，“四价”，和“六价”指在抗体分子上分别存在两个结合位点，四个结合位点，六个结合位点。根据本实施例的双特异性抗体至少是“二价”的，并且可以是“多价”的(例如“三价”，“四价”等)。优选地，本实施例的双特异性抗体是二价的，四价的。对于具有超过两个抗原结合域的抗体，有些结合域可以是相同的，只要前述抗体至少具有对于两种抗原CD47和SIRPa的两个特异性结合域。
[0091]优选地,本实施例的双价的双特异性抗体结构类型包括scFv型和scFab型。scFv是由抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)和肽段接头组成的多肽。具体的，前述scFv型双特异性抗体(如附图1所示)具有从N端到C端方向的下列顺序之一:
【权利要求】
1.一种抗人⑶47和抗人SIRPa的双特异性抗体，包含特异性结合⑶47的第一抗原结合域和特异性结合SIRP a的第二抗原结合域，其特征在于: 所述第一抗原结合域和第二抗原结合域都由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)组成； 所述的第一抗原结合域为可与CD47特异性结合的抗体可变区结构域；第二抗原结合域为可与SIRPa特异性结合的抗体可变区结构域。
2.根据权利要求1所述的抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体，其特征在于:所述的第一抗原结合域为以下四对序列组合SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 中的任意一对序列组合。
3.根据权利要求1所述的抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体，其特征在于:所述的第二抗原结合域为以下两对序列组合SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 10中的任意一对序列组合。
4.根据权利要求1所述的抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体，其特征在于:所述的第一抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与人CD47特异性结合的抗体的可变区结构域的序列；所述的第二抗原结合域的序列为已经公开的其它任何可与人SIRP a特异性结合的抗体的可变区结构域的序列。
5.权利要求1所述的抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体，其特征在于:所述的第一抗原结合域和第二抗原结合域为通过将鼠来源的抗体人源化获得或完全人源获得。
6.根据权利要求1~5任一项所述的抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体，其特征在于:所述的抗体是二价的或多价的。
7.一种权利要求1~5任一项所述的抗人⑶47和人SIRP a的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: ①合成编码所述抗体的cDNA序列； ②将cDNA序列插入工具载体，构建可在宿主细胞中表达的表达载体； ③将所述的表达载体在宿主细胞中表达； ④分离纯化表达的双特异性抗体。
8.根据权利要求7所述的抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体的制备方法，其特征在于:所述的步骤②中的工具载体为市售商业化载体或自行构建的可供表达的载体。
9.根据权利要求7所述的抗人CD47和人SIRPa的双特异性抗体的制备方法，其特征在于:所述的步骤②和步骤③中的宿主细胞为如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等常见表达宿主。
10.一种权利要求1~5任一项所述的抗人⑶47和人SIRP a的双特异性抗体，其特征在于:用于制备治疗人类癌症的药品。
【文档编号】C12N15/70GK103665165SQ201310378875
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】包建新, 楼亚平, 邓洪渊 申请人:江苏匡亚生物医药科技有限公司