一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法
【专利摘要】本发明公开了一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，步骤包括：犊牛发生腹泻后病料的采集与标记；细菌的增菌，细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养，菌体的处理；设计两对诊断性引物eaeA，P1：5’-CTGAACGGCGATTACGCGAA-3’，P2：5’-CCAGACGATACGATCCAG-3’，预期扩增出的目的片段大小，bfpA基因P1：5’-TGTATATTGGGCAGACC-3’，P2：5’-CAGGGCGTATTATGTAGA-3’，预期扩增出的目的片段大小；PCR扩增反应；记录革兰氏染色镜检结果，大肠杆菌在麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板生长结果，毒力基因eaeAPCR结果；将eaeA所测序列与GeneBank中的序列进行比对，对eae序列进行分析，对核苷酸序列分析；将蛋白序列在NCBI中进行比对，得到该蛋白的结构域。本发明结合传统大肠杆菌的选择性特殊培养对样品进行初步纯化，获得单菌落，可提高PCR检测的准确性，可行性强。
【专利说明】一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于犊牛腹泻病病因领域，尤其涉及一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法。
【背景技术】
[0002]大肠埃希菌是一种重要的危害严重的肠道致病菌，它是一组革兰氏阴性菌，是人和动物肠道的正常菌群，多数不致病，且在肠道中合成B族维生素和维生素K而被动物利用。当宿主免疫力低下或大肠杆菌侵入肠外组织和器官时，可引起肠外感染。有少数菌株可直接引起肠道感染，这些大肠杆菌称为致病性大肠杆菌。
[0003]根据致 病性大肠杆菌的致病特点分为5类:肠产毒性大肠杆菌ETEC，肠致病性大肠杆菌EPEC，肠侵袭性大肠杆菌EIEC，肠粘附性大肠杆菌EAEC和肠出血性大肠杆菌EHEC
坐寸ο
[0004]肠产毒性大肠杆菌主要在小肠内繁殖，致病物质是不耐热肠毒素和耐热肠毒素两种毒素，这两种毒素可引起腹泻。肠致病性大肠杆菌在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖，一般不产生肠毒素，可引起水样腹泻，粪便中带有黏液。肠侵袭性大肠杆菌是国际公认的食物中毒病原菌，主要黏附结肠黏膜上皮细胞并在此生长繁殖，死亡后产生内毒素，引起肠黏膜细胞的炎性反应和溃疡，出现血性腹泻。肠出血性大肠杆菌，可产生志贺样毒素，可导致出血性结肠炎、严重腹泻和便血。自1982年在美国首次从腹泻病人粪便中分离得到肠出血性大肠埃希菌(EHEC) 0157:H7以来，由其引起的食源性疾病在发达国家和一些发展中国家不断发生，且呈逐年上升的趋势。大肠杆菌长期驻留在牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中，造成动物的腹泻，并污染肉奶蛋制品、水源和粮食等，给畜牧业生产造成巨大的损失，对人们的健康构成了巨大威胁。其感染具有爆发流行趋势、致病性、致死性等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。
[0005]在世界范围内，每年肠致病性大肠杆菌感染给人类和畜牧业造成巨大损失，每年引起200百万死亡(WH0，2002)。大肠杆菌可导致的疾病:1.肠道外感染:多为内源性感染，以泌尿系感染为主，如尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎。也可引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎等。婴儿、年老体弱、慢性消耗性疾病、大面积烧伤患者，大肠杆菌可侵入血流，引起败血症。早产儿，尤其是生后30天内的新生儿，易患大肠杆菌性脑膜炎。2.急性腹泻:某些血清型大肠杆菌能引起人类腹泻。其中肠产毒性大肠杆菌会引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性，一般2?3天即愈，营养不良者可达数周，也可反复发作。肠出血性大肠杆菌会引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。此外，肠致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死。细菌侵入肠道后，主要在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖。
[0006]致泻性大肠杆菌是大肠埃希氏菌(E.coli)中一类能引起食物中毒和婴儿腹泻的重要病原菌，并且它也是引起幼畜腹泻的重要病原菌。随着奶牛场规模扩大和犊牛饲养密度增加,犊牛腹泻大肠杆菌病已成为奶牛养殖业重要的疾病。该病主要有初生犊牛腹泻和犊牛败血症。其重要特征是能在感染家畜和婴儿的肠上皮细胞或在组织培养细胞表面形成特征性的组织病理学损伤，导致肠道内刷状边缘上皮细胞排列紊乱，使其功能受损而造成严重腹泻，称为粘附与脱落(A/E)。粘附和脱落大肠杆菌类似人的肠致病性大肠杆菌(EPEC)，通过细菌外膜蛋白紧密素局灶性粘附于小肠上皮细胞表面，引起粘附和脱落(A/E)病变。其中EPEC，EIEC，EAEC有共同的致病机制:即能形成吸附擦拭损伤素(AttachingandEffacingLesionA/E),是由 eae 基因编码的。
[0007]Eae (E.coliattachingandeffacing)基因是位于肠细胞消除表位(LEE)致病岛，LEE是由三部分组成:(I)紧密素(eaeA编码)(2)三型分泌系统(EspA基因编码)(3)紧密素转换受体(Tir基因编码),其中被称为紧密素(Intimin或Eae)是编码一个94_97kDa的外膜蛋白，紧密素属于细菌粘附分子家族，可介导细菌与肠上皮细胞紧密粘附，是EHEC和EPEC在人肠道粘膜定居并引起A / E损伤所必需的。其致病特征是细菌与肠上皮细胞紧密粘附，肠微绒毛消失，细菌粘附部位的肠上皮细胞骨架发生改变，丝状肌动蛋白聚集等。后来的研究发现在所有能引起A / E损伤的EHEC、EPEC、弗氏柠檬酸菌和蜂房哈夫尼菌等菌中都检测到eae基因或其同源序列，而肠产毒素大肠杆菌ETEC中则没有这种序列。研究发现:eaeA基因位于LEE致病岛，核苷酸序列分析表明:EPECE2384 / 69的eae基因含有2817bp的开放阅读框(ORF)，编码一个含939个氨基酸残基的蛋白质分子。EHECEDL933的eae基因含有2802bp的0RF，编码一个含934个氨基酸残基的蛋白质分子，不同的0157:H7菌株紧密素的N端序列是高度保守的，EHEC和EPECeae基因序列从N末端起最初的704个氨基酸同源性为94%，这就为疫苗的研制提供了必要的候选基因的基础。其余C末端氨基酸同源性为49%，C末端与肠细胞的特异性粘附有关，正是这一差别决定EPEC和EHEC在体内发生病变的部位不同。EPEC定居于小肠，而EHEC定居于大肠。
[0008]Jerse和Kaper曾报道eae基因表达受一个编码BFP菌毛的EAF(EPECadhencefactor)质粒影响，该质粒广泛分布于各种的EPEC中。BFP被称为(Thebundle-formingpilus)捆绑式菌毛,又称为IV型菌毛(Tfps),该菌毛在细菌的定殖、黏附作用、自动聚集、生物膜的形成、运动性和细菌自然传递等起着重要作用，是EPEC又一个重要致病因子，EBF是由不同的bfpA等位基 因组成，bfpA是编码束霉素蛋白(bundlin)基因，大小528bp。BFP是由反复重复的束霉素亚单位互相缠绕形成如同“绳”状结构。bfpA的亚单位有9种:(1)3个α等位基因，每个等位基因彼此相似，所产生的蛋白中97%的氨基酸是一致的。(2)6个β等位基因，每个等位基因彼此不同，但所产生的蛋白中89%的氨基酸是一致的，所有束霉素亚单位编码的蛋白中有80%的氨基酸是一致的。在感染同一种宿主细胞可产生几种菌毛，有利于帮助细菌逃避宿主的免疫监视系统，从而形成持久感染。种类多样的束霉素蛋白可形成丰富的抗原，具有一定可免疫原性，一般β型束霉素的蛋白免疫原性较差，β 5型束霉素蛋白无免疫原性。α型束霉素的免疫原性较高，用纯化的束霉素蛋白免疫兔和小鼠产生相应的抗体，该抗体识别同一亚型的束霉素的抗体滴度远高于不同型的绑定素，种类不同的束霉素蛋白是保守的，但抗体存在相互交叉识别现象。动物感染一种bfpA亚型的菌毛后，该菌毛可在宿主体内组装所有的其他亚型束霉素，从而形成种类多样的束霉素蛋白。
[0009]随着生物技术的发展，在分子水平上分析病原菌的基因多态性格外有意义。选择大肠杆菌中两个高度保守的致病毒力基因(eaeA，bfpA)设计有关引物，对犊牛腹泻病的EPEC 进行标准化分型:典型性 EPEC (TypicalEPEC) (eaeA+，bfpA+)非典型性 EPEC (AtypicalEPEC) (eaeA+，bfpA_)。典型的EPEC主要流行在发展中国家，引起2岁儿童出现腹泻，非典型EPEC主要流行发达国家引起腹泻。然而目前数据统计显示:包括在发展中国家和发达国家，非典型EPEC的流行趋势高于典型的EPEC，而且可出现长达14天的持久腹泻。
[0010]目前我国对犊牛腹泻病中EPEC的诊断和流行病学调查主要仍处于对菌株的血清型鉴定，对是否携带有相应的毒力因子eaeA，bfpA，检测LEE毒力岛(毒力岛是细菌染色体上编码毒力相关基因的特殊区域，是某些细菌在进化过程中适应环境的变化而获得的毒力基因，通过检测eaeA基因)应为鉴定EPEC的主要依据。
[0011]由于粪便标本中存在着已知和未知的抑制或干扰PCR检测的成分，使得这一技术在粪标本检测的应用上受到一定程度的限制。
【发明内容】
[0012]本发明实施例的目的在于提供一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，旨在解决由于粪便标本中存在着抑制或干扰PCR检测的成分，使得粪标本检测受到一定程度的限制的问题。
[0013]本发明实施例是 这样实现的，一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，该犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法包括以下步骤:
[0014]步骤一、犊牛发生腹泻后病料的采集与标记；
[0015]步骤二、细菌的增菌，细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养，菌体的处理；
[0016]步骤三、设计两对诊断性引物eaeA, Pl:5，-CTGAACGGCGATTACGCGAA-3，；P2:5’ -CCAGACGATACGATCCAG-3’，预期扩增出的目的片段大小；bfpA基因，Pl:5’ -TGTATATTGGGCAGACC-3’ ；P2:5’ -CAGGGCGTATTATGTAGA-3’，预期扩增出的目的片段大小;
[0017]步骤四、PCR扩增反应；
[0018]步骤五、记录革兰氏染色镜检结果，大肠杆菌在麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板生长结果，毒力基因eaeAPCR结果；
[0019]步骤六、将eaeA所测序列与GeneBank中的序列进行比对,对eae序列进行分析，对核苷酸序列分析；
[0020]步骤七、将蛋白序列在NCBI中进行比对，得到该蛋白的结构域。
[0021]进一步，病料的采集与标记的具体方法为:
[0022]犊牛发生腹泻后，用干净竹签选取含有粘液、脓血病变成分的粪便，也可用棉签取黏附在肛门附近的腹泻粪便，装于无菌的容器内，低温保存，并对病料进行编号，一月龄1-24号，10天内25?30号。
[0023]进一步，细菌的增菌方法为:
[0024]在无菌操作台，用接种环取采集的粪便于LB液体培养基中，放入气浴恒温振荡器中，于37 °C缓慢震荡过夜。
[0025]进一步，细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养的具体方法为:
[0026]用接种环挑取增菌液，在普通琼脂平板进行划线；
[0027]置于37°C恒温培养箱内培养24h，每板选取单个菌落，进行革兰氏染色镜检，选取阴性菌；
[0028]选取革兰氏阴性单个菌落接种麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、37°C恒温培养箱内培养24h，观察结果。
[0029]进一步，菌体的处理的方法为:
[0030]将每一株菌接在两支LB培养液中，过夜培养，一支进行5次离心，弃上清，收集菌体，加入100 μ L灭菌水，悬浮菌体后10(TC煮沸5min，离心作为PCR模版，在_70°C冰箱保存。
[0031]进一步，扩增反应条件:
[0032]eaeAPCR 反应条件:95°C预变性 5min，94°C变性 lmin，44.4°C退火 lmin，72°C延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0033]bfpAPCR 反应条件:95°C 预变性 5min，94°C 变性 lmin，51°C 退火 30s，72 °C 延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0034]PCR产物用1%琼脂糖凝胶，100V电泳30min，凝胶成像系统拍照观察结果。
[0035]进一步，经革兰氏染色镜检，得到革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌，用选择性特殊培养基培养和生化方法鉴定革兰氏阴性菌。
[0036]进一步，判定非典型性EPEC的方法为:
[0037]从分离鉴定的大肠杆菌中，利用PCR技术筛选出四株大肠杆菌含有 eaeA基因、bfpA无带，判定为非典型性EPE`C。
[0038]本发明提供的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法结合传统大肠杆菌的选择性特殊培养对样品进行初步纯化，获得单菌落，可提高PCR检测的准确性，利用PCR方法针对大肠杆菌中的高度保守性毒力基因eaeA和bfpA基因作为标志性的诊断基因设计引物，可特异性的检测出非典型性大肠杆菌，提高病原体的检出率，用于临床快速诊断。本方法是将大肠杆菌的选择性特殊培养和PCR相结合来快速诊断非典型EPEC的一种可行性的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1是本发明实施例提供的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法流程图；
[0040]图2是本发明实施例提供的革兰氏染色镜检结果示意图；
[0041]图3是本发明实施例提供的大肠杆菌在麦康凯琼脂平板生长结果示意图；
[0042]图4是本发明实施例提供的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板生长结果示意图；
[0043]图5是本发明实施例提供的大肠杆菌eaeAPCR扩增结果示意图；
[0044]图6是本发明实施例提供的蛋白的结构域PRK15318的示意图；
[0045]图7是本发明实施例提供的基因比对获得的基因树示意图。
【具体实施方式】
[0046]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0047]图1示出了本发明提供的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法的流程。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
[0048]本发明的实施例提供的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法包括以下步骤:
[0049]步骤一、犊牛发生腹泻后病料的采集与标记；
[0050]步骤二、细菌的增菌，细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养，菌体的处理；
[0051]步骤三、设计两对诊断性引物eaeA, Pl:5，-CTGAACGGCGATTACGCGAA-3，；P2:5’ -CCAGACGATACGATCCAG-3’，预期扩增出的目的片段大小；bfpA基因，Pl:5’ -TGTATATTGGGCAGACC-3’ ；P2:5’ -CAGGGCGTATTATGTAGA-3’，预期扩增出的目的片段大小;
[0052]步骤四、PCR扩增反应；
[0053]步骤五、记录革兰氏染色镜检结果，大肠杆菌在麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板生长结果，毒力基因eaeAPCR结果；
[0054]步骤六、将eaeA所测序列与GeneBank中的序列进行比对,对eae序列进行分析，对核苷酸序列分析；
[0055]步骤七、将蛋白序列在NCBI中进行比对，得到该蛋白的结构域。
[0056]作为本发明实施例的一优化方案，病料的采集与标记的具体方法为:
[0057]犊牛发生腹泻后，用干净竹签选取含有粘液、脓血病变成分的粪便，也可用棉签取黏附在肛门附近的腹泻粪便，装于无菌的容器内，低温保存，并对病料进行编号，一月龄1-24号，10天内25?30号 。
[0058]作为本发明实施例的一优化方案，细菌的增菌方法为:
[0059]在无菌操作台，用接种环取采集的粪便于LB液体培养基中，放入气浴恒温振荡器中，于37 °C缓慢震荡过夜。
[0060]作为本发明实施例的一优化方案，细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养的具体方法为:
[0061]用接种环挑取增菌液，在普通琼脂平板进行划线；
[0062]置于37°C恒温培养箱内培养24h，每板选取单个菌落，进行革兰氏染色镜检，选取阴性菌；
[0063]选取革兰氏阴性单个菌落接种麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、37°C恒温培养箱内培养24h，观察结果。
[0064]作为本发明实施例的一优化方案，菌体的处理的方法为:
[0065]将每一株菌接在两支LB培养液中，过夜培养，一支进行5次离心，弃上清，收集菌体，加入100 μ L灭菌水，悬浮菌体后10(TC煮沸5min，离心作为PCR模版，在_70°C冰箱保存。
[0066]作为本发明实施例的一优化方案，扩增反应条件:
[0067]eaeAPCR 反应条件:95°C 预变性 5min,94°C变性 Imin, 44.4°C退火 Imin, 72°C延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0068]bfpAPCR 反应条件:95°C 预变性 5min，94°C 变性 lmin，51°C 退火 30s，72 °C 延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0069]PCR产物用1%琼脂糖凝胶，100V电泳30min，凝胶成像系统拍照观察结果。[0070]作为本发明实施例的一优化方案，经革兰氏染色镜检，得到革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌，用选择性特殊培养基培养和生化方法鉴定革兰氏阴性菌。
[0071]作为本发明实施例的一优化方案，判定非典型性EPEC的方法为:
[0072]从分离鉴定的大肠杆菌中，利用PCR技术筛选出四株大肠杆菌含有 eaeA基因、bfpA无带，判定为非典型性EPEC。
[0073]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0074]I 材料
[0075]病料来源于阿拉尔市十团牛场，采自I?30日龄犊牛的30份腹泻粪便。
[0076]1.1 试剂
[0077]10 X tagplusBuffer> DNTPMisture、TagplusNNApolymerase、DL2000marke, 6 X 1adingBuffer, EB、1XTAE、EDTA, Tris 碱、冰醋酸、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠(NaCl)琼脂糖、氢氧化钠(NaOH)、无水氯化钙、无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇、普通琼脂培养基、30%甘油、蒸馏水，均购自TIANGEN公司；高压灭菌的0.lmolCaCl2。LB固体培养基；细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型):购自天根公司；琼脂糖凝胶回收纯化DNA片段试剂盒:购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒:购自天根公司。
[0078]1.2 仪器
[0079]PCR 仪:(TC-5000BibbyscientificLtd);电泳仪:(DYY_12 北京市六一仪器厂);紫外分析仪:(JY02S北京君意电泳仪设备有限公司)；凝胶成像分析系统:(Tanon-4100上海天能科技有限公司)；小 型离心机:(Sigmal_13LabwayScience)。
[0080]2 方法
[0081]2.1病料的采集与标记
[0082]犊牛发生腹泻后，用干净竹签选取含有粘液、脓血等病变成分的粪便或用棉签或其他无菌的东西取黏附在肛门附近的腹泻粪便30份，装于无菌的容器内，低温保存。然后对病料进行编号，一月龄1_24号，10天内25?30号。
[0083]2.2细菌的增菌
[0084]在无菌操作台，用接种环取少量采集的粪便于LB液体培养基中，放入气浴恒温振荡器中，于37°C缓慢震荡过夜。
[0085]2.3细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养
[0086]用接种环挑取少许增菌液，在普通琼脂平板进行划线。然后置于37°C恒温培养箱内培养24h，每板选取单个菌落，进行革兰氏染色镜检，选取阴性菌。选取革兰氏阴性单个菌落接种麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、37°C恒温培养箱内培养24h，观察实验结果。
[0087]2.4菌体的处理
[0088]将每一株菌接在两支LB培养液中，过夜培养，一支进行5次离心，弃上清，收集菌体，加入100 μ L灭菌水，悬浮菌体后10(TC煮沸5min，离心作为PCR模版，在_70°C冰箱保存。
[0089]2.5 根据 eaeAGeneBank (M58154.1), bfpAGeneBank (Z12295.1)上已经发表的肠致病性大肠杆菌的eaeA与bfpA毒力基因序列，分别设计两对诊断性引物eaeA，Pl:5，-CTGAACGGCGATTACGCGAA-3，；P2:5，-CCAGACGATACGATCCAG-3，，预期扩增出的目的片段大小分别为918bp。bfpA基因，Pl:5，-TGTATATTGGGCAGACC-3’ ；P2:5’ -CAGGGCGTATTATGTAGA-3’，预期扩增出的目的片段大小分别为412bp。该引物由上海生物工程公司合成。
[0090]2.3PCR扩增反应条件
[0091]反应体系(50μL):DNA 模板 I μ L，dNTP4.0μ L (含 MgCl2), 10XPCRBuffer5.0M1,Tag 酶 0.2 μ L,引物 PllyL，引物 P21yL，ddH2038 μ L，总体积为 50 μ L0
[0092]PCR扩增条件:
[0093]eaeAPCR 反应条件:95°C 预变性 5min,94°C变性 lmin, 44.4°C退火 lmin, 72°C延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0094]bfpAPCR 反应条件:95°C 预变性 5min，94°C 变性 lmin，51°C 退火 30s，72 °C 延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0095]PCR产物用1%琼脂糖凝胶，IOOV电泳30min，凝胶成像系统拍照观察结果。
[0096]3实验结果
[0097]3.1采集30份犊牛腹泻粪便。分离培养得到251株，经革兰氏染色镜检，革兰氏染色镜检结果如图2所示，得到100株革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌有151株。用选择性特殊培养基培养和生化方法鉴定100株革兰氏阴性菌，得到在麦康凯琼脂平板长出红色单菌落，大肠杆菌在麦康凯琼脂平板生长结果如图3所示；在伊红美蓝琼脂平板长出黑色带金属光泽的为大肠杆菌，大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板生长结果如图4所示，由此分离得到大肠杆菌50株。
[0098]3.2毒力基因ea eAPCR结果如图5所示:
[0099]从50株临床分离鉴定的大肠杆菌中,利用PCR技术筛选出四株大肠杆菌含有eaeA基因、bfpA无带，可以判定为非典型性EPEC(AtypicalEPEC) (eaeA+, bfpA-)，其阳性率为
8% ο
[0100]3.3测序结果
[0101]3.3.1 将 eaeA (菌号 4-8-8，4-8_8_1，3-8-2，6-3)所测序列与 GeneBank 中的序列进行比对，得出序列与GeneBank中的eaeA序列完全一致，将所得序列呈递GeneBank数据库，获得序列基因登陆号为JQ350701，JQ350702，JQ350703，JQ350704。利用DNAstar软件对eaeA4-8-8，4_8_8_I，3_8_2，6_3序列进行分析,得到共同一致的序列,序列如基因序列表所示。
[0102]DNAstar软件对核苷酸序列分析得到306个氨基酸:
[0103]LNGDYAKDTALGMASSQASSQLQAWLQHYGTAEVNLQSGNNFDGSSLDFLLPFYDSENMLAFGQVGARYIDSRFTANLGAGQRFFLPENMLGYNVFIDQDFS⑶NTRLGIGGEYWRDYFKSSVNGYFRMSGWHESYNKKDYDERPANGFDIRFNGYLPSYPALGAKLMYEQYY⑶NVALFNSDKLQSNPGAATVGVNYTPIPLVTMGIDYRHGTGNENDLLYSMQFRYQFDKPffSQQIEPQYVNELRTLSGSRYDLVQRNNNIILEYKKQDILSLNIPHDINGTEHSTQKIQLIVKSKYGLDRIVW。
[0104]将蛋白序列在NCBI中进行比对，得到该蛋白的结构域:PRK15318，如图6所示。
[0105]与其他大肠杆菌eaeA序列进行比对，得到基因树如图7所示。
[0106]得到试验中呈递的eaeA4_8_8，4_8_8_1，3_8_2，6_3的基因序列与GeneBank中其它大肠杆菌eaeA的序列完全一致。从50株大肠杆菌中得到4株eaeA+,bfpA_,属于非典型性大肠杆菌。非典型EPEC可引起幼龄动物长达14天的持久腹泻。由此可以得出:在所采样品地区致犊牛腹泻的大肠杆菌中存在着非典型EPEC，它的致病作用值得临床兽医工作者的进一步关注。
[0107]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0108] 申请人:名称:塔里木大学
[0109]发明名称:一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法
[0110]序列表中序列的个数:1个序列
[0111]序列标识符=ID号 JQ350701, JQ350702, JQ350703, JQ350704
[0112]序列的长度:917bp
[0113]序列的类型:DNA·[0114]序列来源的生物名称:大肠杆菌
[0115]是核苷酸或氨基酸序列:为核苷酸序列
[0116]核苷酸序列:
[0117]CTGAACGGCGATTACGCGAAAGATACCGCTCTTGGTATGGCCAGCAGCCAGGCTTCGTCACAGTTGCAGGCCTGGTTACAACATTATGGAACGGCAGAGGTTAATCTGCAGAGTGGTAATAACTTTGACGGTAGTTCACTGGACTTCTTATTACCGTTCTATGATTCCGAAAACATGCTGGCATTTGGTCAGGTCGGTGCGCGTTACATTGACTCCCGCTTTACGGCAAATTTAGGTGCTGGCCAGCGTTTTTTCCTTCCTGAAAATATGTTGGGCTATAACGTCTTCATTGATCAGGATTTTTCTGGTGATAATACCCGTTTAGGTATTGGTGGCGAATACTGGCGAGACTATTTCAAAAGTAGCGTTAACGGCTATTTCCGCATGAGCGGCTGGCATGAGTCATACAATAAGAAAGACTATGATGAGCGCCCGGCAAATGGTTTTGATATCCGCTTTAATGGCTATTTACCATCATATCCTGCATTAGGCGCCAAACTGATGTACGAACAGTATTATGGTGATAATGTTGCTTTGTTTAATTCCGATAAGTTGCAGTCGAATCCTGGCGCGGCGACCGTTGGTGTAAACTACACTCCGATTCCTCTGGTGACGATGGGGATCGATTACCGTCATGGTACGGGTAATGAAAATGATCTCCTTTACTCAATGCAGTTCCGTTATCAGTTTGATAAACCGTGGTCTCAGCAAATCGAGCCACAGTATGTTAACGAGTTAAGAACATTATCGGGCAGCCGTTACGATCTGGTTCAGCGTAATAACAATATTATTCTGGAGTACAAAAAGCAGGATATTCTTTCTCTGAATATTCCGCATGATATTAATGGTACTGAACACAGTACGCAGAAGATTCAATTGATCGTTAAGAGCAAATACGGTCTGGATCGTATCGTCTG
【权利要求】
1.一种犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，该犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法包括以下步骤: 步骤一、犊牛发生腹泻后病料的采集与标记； 步骤二、细菌的增菌，细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养，菌体的处理； 步骤三、设计两对诊断性引物eaeA，Pl:5’ -CTGAACGGCGATTACGCGAA-3’ ；P2:5’ -CCAGACGATACGATCCAG-3’，预期扩增出的目的片段大小；bfpA基因，Pl:5’ -TGTATATTGGGCAGACC-3’ ；P2:5’ -CAGGGCGTATTATGTAGA-3’，预期扩增出的目的片段大小; 步骤四、PCR扩增反应； 步骤五、记录革兰氏染色镜检结果，大肠杆菌在麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板生长结果，毒力基因eaeAPCR结果； 步骤六、将eaeA所测序列与GeneBank中的序列进行比对,对eae序列进行分析,对核苷酸序列分析； 步骤七、将蛋白序列在NCBI中进行比对，得到该蛋白的结构域。
2.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，病料的采集与标记的具体方法为: 犊牛发生腹泻后，用干净竹签选取含有粘液、脓血病变成分的粪便，也可用棉签取黏附在肛门附近的腹泻粪便，装于无菌的容器内，低温保存，并对病料进行编号，一月龄1-24号，10天内25-30号。.
3.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，细菌的增菌方法为: 在无菌操作台，用接种环取采集的粪便于LB液体培养基中，放入气浴恒温振荡器中，于37 °C缓慢震荡过夜。
4.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，细菌的鉴定和选择性特殊培养基培养的具体方法为: 用接种环挑取增菌液，在普通琼脂平板进行划线； 置于37°C恒温培养箱内培养24h，每板选取单个菌落，进行革兰氏染色镜检，选取阴性菌； 选取革兰氏阴性单个菌落接种麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、37°C恒温培养箱内培养24h，观察结果。
5.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，菌体的处理的方法为: 将每一株菌接在两支LB培养液中，过夜培养，一支进行5次离心，弃上清，收集菌体,加Λ IOOyL灭菌水，悬浮菌体后100°C煮沸5min，离心作为PCR模版，在_70°C冰箱保存。
6.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，扩增反应条件: eaeAPCR 反应条件:95°C 预变性 5min，94°C 变性 lmin，44.4 °C 退火 lmin，72°C 延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存； bfpAPCR反应条件:95°C预变性5min，94°C变性lmin，5rC退火30s，72°C延伸30s，共30个循环，最后72°C延伸10min，4°C保存； PCR产物用1%琼脂糖凝胶，100V电泳30min，凝胶成像系统拍照观察结果。
7.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，经革兰氏染色镜检，得到革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌，用选择性特殊培养基培养和生化方法鉴定革兰氏阴性菌。
8.如权利要求1所述的犊牛腹泻病中鉴定非典型性大肠杆菌的方法，其特征在于，判定非典型性EPEC的方法为: 从分离鉴定的大肠杆菌中，利用PCR技术筛选出四株大肠杆菌含有eaeA基因、bfpA无带，判定为非典型 性EPEC。
【文档编号】C12Q1/68GK103436619SQ201310378688
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】喻华英, 石长青, 焦海宏, 任敏 申请人:塔里木大学